Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om dendritische stekels met superresolutie te beeldvormen. Dit wordt bereikt door eerst een primaire rattenhippocampus voor te bereiden, de tweede stap is om de dendritische stekels te visualiseren door middel van GFP-transfectie en kleuring. Vervolgens wordt de acquisitie van GFP-gelabelde dendritische stekels uitgevoerd in superresolutie met behulp van een SIM-microscoop.

De laatste stap is om de ruwe beeldgegevens te reconstrueren in 3D, klaar voor verdere beeldanalyse. Uiteindelijk wordt GFP-uitdrukkende primaire hippocampale neuronen, afgebeeld in superresolutie, gebruikt om subtiele veranderingen in de morfologie van dendritische stekels te laten zien. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals conventionele confocale microscopie, is dat het je in staat stelt om de morfologie van dendritische stekels in meer detail te bestuderen.

Deze methode kan helpen bij het onderzoeken van belangrijke lopende vragen in de neurowetenschappen, zoals moleculaire en farmacologisch afhankelijke veranderingen in de vorm van dendritische stekels. Gestructureerde eliminatiemicroscopie is gebaseerd op de projectie van lijnpatronen op het monster, en dit geeft extra informatie die door een computerprogramma kan worden geëxtraheerd en geeft extra scherpe beelden en stelt je in staat om naar MI-mitochondria en andere kleine structuren in de cel te kijken. Een visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om een ​​geldige reconstructie van een SIM-beeld te bereiken, het is cruciaal om de stappen te doorlopen die je een goede kwaliteit van de ruwe gegevens geven.

Een belangrijke voorbereidende stap omvat het coaten van de dekglasjes, werken in een steriele laminaire kap. Gebruik kleine steriele pincetten om de individuele dekglasjes in afzonderlijke putjes van een 12-putjesplaat te plaatsen. Voeg vervolgens 500 microliter polylysine-oplossing toe aan elke put om de dekglasjes te onderdompelen.

Na het wassen van de putjes, voeg een milliliter plateermedium toe en laat de dekglasjes maximaal 24 uur in de weefselkweekincubator liggen voorafgaand aan het plateren van de cellen. De procedure zal worden gedemonstreerd door HU is SH, een promovendus in onze groep. Na het isoleren van een rattenembryo, gebruik fijne pincetten om het cerebellum uit de hersenen te verwijderen en weg te gooien.

Scheed de twee hemisferen door een sagittale snede te maken langs de middellijn onder een dissectiemicroscoop, gebruik een paar kleine pincetten om de middenhersenen voorzichtig vast te houden en verwijder de middenhersenen. Met een ander paar pincetten, laat het overblijvende deel van het hemisferium dat de cortex en de hippocampus bevat intact. Verwijder vervolgens voorzichtig de hersenvliezen, oriënteer het weefsel opnieuw zodat de hippocampus naar boven gericht is.

De hippocampus kan worden geïdentificeerd aan de hand van zijn karakteristieke CS-vormige structuur. Gebruik fijne pincetten om de hippocampus te dissecteren en plaats deze in een nieuwe 30 millimeter schotel die vers koud een X-H-B-S-S bevat. Nadat de hippocampi uit alle embryo's zijn verwijderd, tel het totale aantal hippocampi en snijd ze vervolgens in kleine stukjes.

Verzamel de stukjes in een 15 milliliter centrifugeerbuisje met drie milliliter een X-H-B-S-S. Na centrifugeren en verwijderen van het supernatant, voeg zes microliter trypsine toe per hippocampus. Na het incuberen en wassen van de hippocampale fragmenten zoals beschreven in het tekstprotocol, tate de fragmenten langzaam 30 keer met een met vuur gepolijste pastor pijp tot alle weefselstukken homogeen zijn verspreid in enkele cellen.

Zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Voeg vervolgens vijf milliliter plateermedium toe, vooraf gewaarschuwd tot 37 graden Celsius. Na het tellen van de cellen met behulp van een trian blauw vitale kleuringszaad, 50.000 cellen per put van een 12, puttenplaat in een milliliter plateermedium voor een totaal volume van twee milliliter.

Na het wiegen van de plaat om de cellen gelijkmatig te verdelen, incubeer de cellen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Na twee tot drie dagen, vervang 0,5 milliliter van het plateermedium door kweekmedium dat 10 micromolair FUDR bevat. Om de neuronen te transfecteren, voegt u een lipectomie toe.

Voeg druppelsgewijs een DNA-mix toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. In een laminaire stroomkap, 10 minuten voor het einde van de 30 minuten DNA-lipectomiemengsel, incubatie, pipetteer het geconditioneerde medium van de oorspronkelijke of eerste kweekplaat naar een tweede 12. Welplaat en bewaar deze plaat bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide in de eerste kweekplaat.

Vervang snel het geconditioneerde medium door een milliliter voorverwarmd incubatiemedium om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Plaats beide platen terug in de incubatiekast bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Aan het einde van de 30 minuten DNA-lipectomie-incubatie, is de DNA-lipectomiemix klaar om aan de cellen toe te voegen.

Voeg voorzichtig druppelsgewijs 200 microliter van de DNA-lipectomiemix toe aan elke put en incubeer gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Na de 45 minuten incubatie, gebruik kleine pincetten om de dekglasjes met de neuronen op te tillen. Spoel ze door ze in een drie centimeter schotel met vers, warm neuro basaal medium te dompelen en plaats ze in een put.

In de tweede 12, puttenplaat met het geconditioneerde medium. Incubeer vervolgens de getransfecteerde neuronen bij 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide gedurende 48 uur. Om voor te bereiden op immunokleuring, aspireer voorzichtig het medium uit de putten met de dekglasjes.

Voeg vervolgens 500 microliter warm 4% PFA voorzichtig toe om schade aan de dendrieten te voorkomen. Na het incuberen en wassen van de cellen, blokkeer met 1%T-B-S-B-S-A oplossing bij kamertempera