Name: Oprichting van een In Vitro Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 26 s
Description: Leer een reproduceerbaar in vitro model van de ratbloed-hersenbarrière opzetten met endotheliale cellen en astrocyten. Deze methode maakt onderzoek naar barrière-eigenschappen en geneesmiddelafgifte mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiële steun aan VECT-HORUS wordt erkend van het Fonds Unique Interministeriel (FUI / MEDUL project) en vect-Horus en de UMR7259 laboratorium van het Agence Nationale de la Recherche (ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC en PREVENTAD samenwerkingsprojecten) . De UMR7259 laboratorium erkent ook financiële steun van het CNRS en van Aix-Marseille Universite.

1. Productie van Rat Astrocytes Voor elk preparaat gebruiken 10 neonatale Wistarratten van beide geslachten. <ol><li> Offer de ratten door snijkoppen met een schaar en zet ze onmiddellijk in een droge petrischaal onder een laminaire stroming kap. Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en overbrengen onmiddellijk in een petrischaal met koude dissectie buffer: HBSS aangevuld met 1% runderserumalbumine (lage endotoxine BSA), 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml. </li><li> Snijd de hersenen in de helft, om de 2 hersenhelften gescheiden en breng ze in een schone petrischaal met dissectie buffer op ijs. Snijd de oogzenuw en verwijder de hersenvliezen onder een stereomicroscoop. </li><li> Was de corticale stukken uitgebreid in 50 ml koud dissectie buffer. </li><li> Plaats de corticale stukken van 3 hersenen in een 15 ml Falcon buis en distantiëren door en neer te pipetteren een staatsgreeple malen met 10 ml wegwerp pipet met een blauwe tip in 6 ml 0,05% trypsine - EDTA 0,02% gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 24 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en de volgende antibiotica, penicilline 100 eenheden / ml streptomycine en 100 ug / ml, media genaamd glia celmedium (GCM) en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. FBS batches werden geselecteerd en gevalideerd voor de groei en overleving van astrocyten cutures. </li><li> Resuspendeer de pellet met de gedissocieerde cellen in 10 ml GCM en plaat in een 75 cm 2 T-kolf (T75). Verander het medium de volgende dag om de celresten te verwijderen en DNA. Vervang het kweekmedium tweemaal per week. </li><li> Na 1 week van proliferatie, schud de gliacellen met een orbitale schudder bij 60 rpm gedurende 24 uur bij 37 ° C in GCM. Als de T75 niet in een incubator worden gebracht met 5% CO 2/95% lucht bij 37 ° C bevochtigde atmosfeer, vullen de media 5 mM HEPES. Was de cellen tweemaal aan rchrap de niet-hechtende microgliale cellen. </li><li> Drie weken na het zaaien, was de cellen tweemaal met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 3 ml warm trypsine-EDTA 0,05% 0,02%, incubeer bij 37 ° C en wacht tot de cellaag wordt verspreid (meestal 5 min). Remmen trypsine activiteit door toevoeging van 10 ml GCM, breng de celsuspensie in een 15 ml Falcon buis en centrifugeer bij 120 xg gedurende 8 minuten. </li><li> Resuspendeer de pellet in astrocyte 90% FBS - 10% DMSO, overbrengen naar cryovials (2 x 10 6 cellen per cryoflesje) en bewaar in vloeibare stikstof. </li></ol> 2. Isolatie van Rat Brain microvessels Onze experimentele procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Faculteit van Marseille en voldoen aan de nationale en Europese regelgeving (EU-richtlijn nr. 86/609). Alle inspanningen werden geleverd om dierenleed te minimaliseren en vermindering van het aantal gebruikte dieren. <ol><li> Voor elk preparaat en voor een experimenter, gebruiken 3 vijf weken oude Wistarratten. </li><li> Maandag van de eerste week, 2 T75 kolven bereid door het coaten met type IV collageen en fibronectine, zowel 1 ug / cm 2 in steriele kweek water (10 ml per T75). Laat hechten bij 37 ° C tot microvaatje zaaien. </li><li> Woensdag ochtend van de eerste week, euthanaseren de ratten onder een toenemende flux CO 2 slaperigheid induceren, verlies van houding en ademhaling onderbreking, gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit de koppen met 70% ethanol. Snijd de koppen met een schaar en overbrengen onder een laminaire stroming kap in een droge petrischaal. </li><li> Verwijder de hersenen uit de schedel zonder cerebellum en de optische zenuwen, dan overbrengen naar een petrischaal gekoeld op ijs en gevuld met koud dissectie buffer (HBSS aangevuld met 1% BSA, 100 eenheden penicilline / ml en streptomycine 100 ug / ml) . </li><li> Snijd de hersenen in de helft van de 2 hersenhelften en aparte middenhersenen scheiden van voorebrain. Breng de voorhersenen in een schone petrischaal op ijs met dissectie buffer. </li><li> Neem een ​​paar halve bollen in een nieuwe petrischaal met koud dissectie buffer om de hersenvliezen verwijder voorzichtig uit de voorhersenen onder een stereomicroscoop met N ° 5 gebogen pincet. Dan, het reinigen van de binnenkant van de hersenen om het dekbed van myeline verwijderen en het verkrijgen van een schil van cortex. Deze stappen moeten meer dan 2 uur voor weefsel behoud en overleving van de cel niet nemen. </li><li> Distantiëren de cortex van 3 hersenen in 6 ml koud dissectie buffer in dounce homogeniseerapparaat een 7 ml met 10 opwaartse als neerwaartse slag met elk van 2 stampers van verschillende afstanden, 71 um gevolgd door 20 micrometer. </li><li> Verdeel de suspensie tot het equivalent van 1 cortex in 1 ml van een 50 ml Falcon buis en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te verkrijgen. Verwijder het supernatant. </li><li> Digest de suspensie van 1 cortex met 1 ml van een enzymatische oplossing die een mengsel van collagenase / dispase (60 ug / ml R11; 0,3 U / ml), DNase type I (35 ug / ml - 20 K eenheden / ml) en gentamicine (50 ug / ml) in een schudder gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li><li> Meng 1 ml verteren van 1 cortex met 10 ml 25% BSA / 1X HBSS en gescheiden door densiteitafhankelijke centrifugeren bij 3600 xg gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Breng zorgvuldig de bovenste schijf (myeline en de hersenen parenchym) en de bovenstaande vloeistof in een schone 50 ml Falcon buis en herhaal het centrifugeren. Houd de resulterende pellet die de hersenen microvaatjes bij 4 ° C. </li><li> Gooi de bovenste schijf en het supernatant voorzichtig. Resuspendeer beide resulterende pellets die de hersenen microvaatjes met 1 ml koude HBSS 1X en over in een schone 50 ml Falcon buis. </li><li> Was de microvaatjes door toevoeging van 20 ml koude HBSS 1X en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant. </li><li> Verder verteren de microvaatjes van 1 cortex met 1 ml van dezelfde enzymatische oplossing zoals beschreven in stap 2.9 gedurende 1 uur bij 37 ° C in een shAker. </li><li> Vervolgens meng de gedigereerde microvaatjes uit elk van de 3 cortex in een buis en verder gescheiden in twee 50 ml Falcon buizen bloedvaten uit het equivalent van anderhalf (1,5) cortex per slangetje. Voeg 30 ml koud dissectie buffer en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet in 10 microvaatje ml DMEM/F12 aangevuld met 20% bovien bloedplaatjes arm plasma afgeleid serum, basische fibroblastgroeifactor (bFGF, 2 ng / ml) heparine (100 ug / ml), gentamicine (50 ug / ml) en HEPES (2.5 mM), genaamd endotheelcellen media (ECM) aangevuld met puromycine bij 4 ug / ml. </li><li> Neem de 2 gecoate T75 kolven uit de incubator, zuig het overtollige van de coating en de plaat de haarvaten van elke buis in een T75 fles (microvessels onttrokken 1.5 cortex per T75 fles). </li></ol> 3. Zuivering en verspreiding van RBEC Primocultures <ol><li> Zuivering: woensdag tot en met vrijdag, voeg puromycin bij 4 ug / ml aan het kweekmedium. Verander het medium op donderdag. Op vrijdag was de cellen en voeg puromycine op 2 ug / ml tot en met maandag. </li><li> Proliferatie: op maandag van de tweede week, was de cellen en voeg insuline, transferrine en natriumseleniet supplement aan het kweekmedium tot de culturen oplopen tot 90% samenvloeiing op woensdag van de tweede week. </li></ol> . 4 Differentiatie: Het opzetten van de In Vitro BBB Model <ol><li> Maandag van de tweede week, filters (polyethyleen, 12 wells, poriegrootte 1,0 um) bereid door bekleding met een combinatie van collageen type IV, fibronectine en zowel 0.5μg/cm 2 kweek in steriel water (500 ui mengsel in het bovenste compartiment en 1,5 ml steriel cultuur water in het onderste compartiment). Laat hechten bij 37 ° C tot RBEC zaaien. </li><li> Maandag van de tweede week, vijf dagen vóór de oprichting van de co-cultuur, ontdooien de astrocyten uit cryovials bij 37 ° C en de overdrachtin een 15 ml Falcon met 10 ml GCM. Centrifugeer de suspensie bij 120 xg gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer de pellet in astrocyten GCM en plaat bij een dichtheid van 30 x 10 3 cellen per cm2 in 12-well platen. </li><li> Woensdag van de tweede week, net voor dissociatie van RBEC met trypsine, was tweemaal de pre-coated filter met DMEM/F12-medium. Pre-vul de kamers met ECM: 1,5 ml in het onderste compartiment en 0,5 ml in het bovenste compartiment. </li><li> Woensdag van de tweede week, was tweemaal de RBEC met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg 4 ml warm trypsine 0,05% - 0,02% EDTA-oplossing bij 37 ° C per T75 fles gedurende 30 seconden precies. Verwijder vervolgens 3,5 ml trypsine oplossing en nemen onder de microscoop. Wanneer de cellaag begint los te maken van de matrix, te helpen bij de rand van de T75 kolf te tikken totdat alle cellen zweven. </li><li> Voeg 9 ml van ECM per T75 fles en over in een 15 ml Falcon buis. Heel voorzichtig distantiëren de celschorsing door en neer te pipetteren 4 keer met een pipet 10 ml voorzien van een gele tip (vermijd de productie van bellen in de oplossing). Tel de cellen in de suspensie (ca. 3 x 10 6 cells/T75) en direct plaat van vooraf gecoat en voorgevulde filters met hoge dichtheid (160 x 10 3 cellen / filter dus ongeveer 18 filters/T75) (Figuur 8 ). De volgende dag (donderdag), veranderen twee keer het medium van het bovenste compartiment naar cel vuil te verwijderen. </li><li> Donderdag van de tweede week, de dag vóór de oprichting van de co-cultuur, vervang de astrocyten cultuur media met 1,5 ml van differentiatie media (ECM met hydrocortison bij 500 nM) die kan worden aangevuld met 1/3 geconditioneerde medium van de basale compartiment van een eerdere co-cultuur (3 dagen van contact tussen endotheelcellen en astrocyten). </li><li> Vrijdag van de tweede week wordt gedefinieerd als dag 0 van differentiatie; Vervang het kweekmedium van de filters containing de RBEC met differentiatie media. Breng de RBEC filters in de putjes die de astrocyten. Onder deze omstandigheden in vitro modellen differentiëren en expressie-junction verwante eiwitten binnen 3 dagen. </li><li> De modellen houden hun optimale differentiatie gedurende 3 dagen, tussen maandag en woensdag van de derde week. </li></ol>

Michel Khrestchatisky is directeur van het UMR7259 laboratorium, mede-oprichter en wetenschappelijk adviseur van het biotechnologiebedrijf VECT-HORUS.

We beschrijven de implementatie van een wekelijkse reproduceerbare protocol voor de isolatie en beplating van de hersenen haarvaten, na zuivering en de cultuur van RBEC en verder opzetten van co-cultuur met primaire astrocyten rat aan een in vitro BBB model met karakteristieke BBB eigenschappen genereren. Succesvol vaststellen van gestandaardiseerde in vitro kweken BBB vereist optimale omstandigheden in de verschillende opeenvolgende stappen van het proces. Het model werd (a) geoptimaliseerd voor de laagste paracellulaire permeabiliteit, die de &quot;heilige graal&quot; van in vitro BBB-modellen blijft, en (b) gevalideerd voor efflux en RMT mechanismen te verkrijgen. Productie, zuivering en verspreiding van RBEC De grootste uitdaging bij het kweken RBEC is om reproduceerbaarheid tussen verschillende culturen te bereiken. Standaardisatie van het protocol vereist hoogwaardige gereedschappen voor dissectie, hoge kwaliteit reagentia en respect van reagens vervaldata. De experimentator moet worden bedreven in micro-dissectie onder stereomicroscoop voor snelle verwijdering van hersenvliezen en grote schepen uit de cortex oppervlak. Zodra de hersenen geïsoleerd en mechanisch gedissocieerd een van de belangrijkste uitdagingen is de optimale enzymatische vertering van de vers geïsoleerde hersenen microvaatjes. Het type en de kwaliteit van de gebruikte enzymen kritisch. Een mix van collagenase type I en II en dispase in hoge concentratie met lage variabiliteit tussen batches gebruikt. Ook van belang zijn de duur van de enzymatische digestie en de verhouding tussen enzymconcentratie / weefsel gewicht / volume van de spijsvertering. De beste opbrengst van hersenen microvaatje productie werd verkregen met het equivalent van 1 cortex van de hersenen in 1 ml collagenase / dispase mengsel bij 60 ug / ml in beide ontsluitingen, respectievelijk 30 min en 1 uur. Ook kritisch is de eliminatie van contaminerende cellens (astrocyten en vooral pericyten). Deze cellen vermenigvuldigen bij een hogere snelheid dan endotheelcellen en geen krappe kruispunten niet vast te stellen met de laatste, waardoor het voorkomen van de opbouw van een homogene cel monolaag met goede paracellulaire restrictiviteit. Aangezien hersenen endotheelcellen tot expressie veel hogere efflux pomp, vooral P-gp, vergeleken met de andere celtypes in microvaatjes zij beter tolereren anders toxische concentraties van P-gp ligand drugs, terwijl niet-endotheelcellen worden geëlimineerd. Puromycine behandeling bij 4 ug / ml voor de eerste twee dagen werd gevolgd door twee dagen bij 2 ug / ml endotheelcel goede zuiverheid te verkrijgen. Deze selectie kan ook voorstander van capillaire endotheelcellen versus die van venulen, precapillaire arteriolen of grotere bloedvaten, en leiden tot strengere monolagen. Bovendien, het gebruik van slechte plasma afgeleide runderserum een noodzakelijk om zuivere kweken van endotheelcellen 47,48 verkrijgen. De plasma-derived serum mist bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF), dat mitogeen voor fibroblasten voor gladde spiercellen en derhalve pericyten. We vonden dat behandeling van kunststof en filters met een combinatie van collageen type IV van muizen en humaan fibronectine levert een belangrijk voordeel, met een 2-voudige toename van de proliferatie opbrengst in vergelijking met de traditioneel aanbevolen collageen type I uit rattenstaart. Belangrijke aanwijzingen voor celproliferatie werden door de extracellulaire matrix zoals integrine en groeifactor (bFGF) activering 49. Buffer concentratie en pH van het kweekmedium zijn beschreven positief effect hebben op paracellulaire dichtheid 50 en observeerden we een betere reproduceerbaarheid tussen culturen aangevuld met HEPES buffer bij 5 mM. Differentiatie van RBEC: Co-cultuur Vestiging op Filters Insert Zodra hersenen endotheliale cellen bEEN gezuiverd en hebben zich verspreid voor 6 dagen, kunnen ze worden uitgeplaat op filters. Cel plating bij hoge dichtheid is van cruciaal belang om een ​​perfecte monolaag verkrijgen. Een zaaien dichtheid van 160x10 3 cellen per 12 wells plaat filters noodzakelijk en voldoende was om een confluente monolaag 24 uur na het uitzaaien verkrijgen. Echter, isolatie van primaire hersentumoren capillaire endotheelcellen uit hun omgeving is paradoxaal in de bouw van een BBB in vitro model zoals bekend is dat primaire cellen, met name de hersenen capillaire endotheelcellen, sterk gereguleerd door de omgeving en inductieve factoren door de verschillende omringende celtypen. Brain capillaire endotheelcellen alleen gekweekt snel de-differentiëren en verliest wat specifieke hersengebieden endotheliale markers. Daarom moet primaire endotheelcellen worden bij lage doorgang (P1) en opnieuw aangesloten, althans gedeeltelijk, met de omgeving door co-cultuur met astrocyten of medium geconditioneerd door astrocyten 47,51. Dit geldtgeldt voor astrocyten differentiatie hersenen endotheelcellen en astrocyten zijn betrokken bij twee-weg inductie. Kweken RBEC met astrocyten geleid tot een sterke inductie van interendotheliale TJ 52,23. De moleculaire mechanismen van herinductietherapie blijven grotendeels onbekend en onderzoek gaande in verschillende laboratoria specifieke modulerende factoren afgescheiden door astrocyten, zodat optimale endotheelcel differentiatie 53,54 kunnen bevorderen identificeren. Factoren uitgescheiden door de hersenen endotheelcellen waaronder leukemie inhiberende factor (LIF) is aangetoond astrocytaire 55,56 differentiatie induceren. Voordat co-cultuur vestiging, werden astrocyten blootgesteld aan differentiatie medium dat de glucocorticoïdereceptoragonist hydrocortison, en co-cultuur geconditioneerd medium. Hydrocortison is bekend dat de dichtheid van hersenen endotheelcellen verbeteren en wordt gebruikt BBB modellen bijzonder van 57 ratten en muizen 58,59 endotheelcellen. De geconditioneerde medium wordt na 3 dagen verzameld uit de onderste compartiment van de endotheelcellen / astrocyten co-cultuur systeem en voor later gebruik bevroren. Het gebruik van co-cultuur geconditioneerd medium verminderde de tijd van endotheliale celdifferentiatie tot 3 dagen met een optimale paracellulaire permeabiliteit voor 2 dagen en ook verbeterd reproduceerbaarheid tussen culturen. Kortom, het protocol beschrijven we levert een reproduceerbare TEER dan 300 ohm-cm 2 en een gemiddelde paracellulaire permeabiliteit coëfficiënt Pe (LY) van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min, vergelijkbaar met de beste primaire celgebaseerde BBB modellen 22, 12. Het protocol beschrijven we in dit manuscript met de voorgestelde modulatie van microvaatje enzymatische digestie kunnen worden uitgebreid aan endotheelcellen van de ratten ruggenmerg 60 en hersenen van muizen. Moleculaire en functionele karakterisering BovendienTJ inductie, astrocyten ook bijdragen aan de expressie van transporters zoals P-gp in de hersenen endotheelcellen 61. We zien inderdaad expressie van de efflux transporter P-gp in de BBB model en we tonen de polariteit van het P-gp efflux pomp localisatie middels biochemische benaderingen en P-gp activiteit met behulp van een functionele test. GLT-1 expressie werd gedetecteerd in de basale membraan fractie van microvaatjes, maar was niet in gekweekte RBEC gedetecteerd. Onze hypothese is dat GLT-1 down is geregeld in onze RBEC cultuur in vergelijking met de in vivo omstandigheden en dus niet gedetecteerd door western blot analyse. Overmaat glutamaat neurotoxisch en in vivo, GLT-1 is verantwoordelijk voor glutamaat efflux van het basale compartiment (parenchym) aan het apicale compartiment (bloedcirculatie). In astrocyten blijft GLT-1-expressie zeer laag en wordt geïnduceerd door de toevoeging van glutamaat in het medium 62,63. We hebben ook confIRM de uitdrukking van instroom transporters op de apicale membraan zoals LRP1, LDLR en TfR. Functionaliteit van TfR en LDLR werd gedemonstreerd met binding en transport experimenten van Tf-Cy3 en DiLDL van de luminale naar de abluminale kant van de monolaag zoals eerder getoond met een rund in vitro BBB model 64. Interessant is aangetoond dat lipide behoefte van astrocyten verhoogt de expressie van LDLR op de hersenen capillaire endotheelcellen 65,66 verdere bevestiging van de fysiologische overspraak tussen astrocyten en de hersenen endotheelcellen, zoals in vitro. Wij hebben besloten om vervoer illustreren met fluorescerende kleurstoffen zoals als Cy3 en Dil gezien het feit dat spectrofluorimetrische analyse is beschikbaar in de meeste laboratoria, en kan nuttig zijn om te valideren in vitro BBB-modellen. Echter, kwantificering van fluorescentie is veel minder gevoelig dan radioactiviteit en vereist een toename van het aantal experimenten significante gegevens te verkrijgen.Idealiter Tf en LDL zijn gewoonlijk radioactief gemerkt (jodium 125) voor een dergelijke binding / opname en transport experimenten. We tonen ook dat de gedifferentieerde endotheelcellen monolaag verkregen met de voorgestelde protocol aan ontsteking geïnduceerd door TNF-α, zoals blijkt uit CCL2 afgifte en BBB opening. CCL2 (MCP-1) en zijn receptor CCR2 betrokken bij CZS aandoeningen zoals multiple sclerose, experimentele autoimmuun encefalomyelitis (EAE) 67, CNS trauma 68 en staan ​​bekend als mediatoren van migratie van leukocyten in het CZS onder neuro-inflammatoire condities 69,70. Met de geteste protocol, kunnen we niet concluderen op een gepolariseerde secretie van CCL2 omdat BBB opening kan de CCL2 concentratie in evenwicht tussen beide bovenste (apicale) en lagere (basale) compartimenten. Daarom hebben we duidelijk onderschatten de hoeveelheid CCL2 door de RBEC in het apicale compartiment van 24 uur (Figuur 5A). Algemeen Overzicht en Beperkingen van BBB in vitro modellen: I n Vivo versus In Vitro en knaagdieren versus Human Vergelijkingen Veelbelovende CNS geneesmiddelen die effectief BBB passage in vitro bleek niet in klinische onderzoeken door een gebrek aan voorspelbaarheid van in vitro modellen BBB vaak gebaseerd op cellen geïsoleerd uit andere soorten dan menselijke. Aan het beste van onze kennis, de in vitro BBB modellen zijn waarschijnlijk meer voorspellend als het gaat om het bestuderen van mechanistische aspecten van eiwitnetwerken, signaaltransductie, transporters en receptoren. Elk mechanisme, pad of doel te worden bestudeerd in vitro te worden gekarakteriseerd voor de regulering van complementaire omgevingsfactoren (andere celtypes, chemicaliën, eiwitten) en gecombineerd om in situ studies met dezelfde diersoort, En indien mogelijk, met bloedvaten en endotheelcellen geïsoleerd van de mens, met de beperkingen en voorzichtigheid opgeroepen hieronder. In vitro BBB-modellen moeten worden gezien als autonome systemen, geïsoleerd uit het lichaam van regelgeving, maar toch begiftigd met grote in vivo eigenschappen en een potentieel voor regulering door omgevingsfactoren. Nee &quot;ideaal&quot; in vitro BBB model wordt nog voorgesteld 71,72,73 omdat de endotheelcel monolagen missen een aantal belangrijke onderdelen van de neuro-vasculaire glia eenheid (NGVU) en worden geïsoleerd uit bloed en lichaamsvloeistoffen regelgeving. Het ontbreken van pericyten 74,16 17,18 neuronen of de verschillende bestanddelen van de extracellulaire matrix voor kunststofbekleding of het kweekmedium en serum voor celgroei in de meest voorkomende en &quot;gemakkelijkst gemaakt&quot; in vitro BBB modellen gebaseerd op endotheliale gedifferentieerde cellen met astrocyten kan eiwitexpressie i modulerenn vergelijking met de in vivo situatie 75. Deze modellen kunnen veel transporters in vivo uit te drukken, maar niet allemaal. In sommige gevallen werden transportparameters eerst gecontroleerd in geïsoleerde bloedvaten (het dichtst bij de in vivo situatie), en vervolgens onderzocht in celkweek systemen 76,61. Moleculair biologisch onderzoek heeft geleid tot de karakterisering van gen-en eiwitexpressie in geïsoleerde bloedvaten en lage passage endotheliale celculturen van dezelfde soort, en tussen verschillende soorten, meestal van kleine dieren zoals knaagdieren (muizen en ratten) of van koe en varken in vergelijking mens 77,78,75,15. Transcriptoom vergelijking van in vivo en in vitro hersenen microvasculaire endotheelcellen liet talrijke gen transcripten die differentieel tot expressie werden gebracht en meestal aanzienlijk downregulated in vitro. Transcripten coderend instroom vervoerders zoals TfR en proteins betrokken bij blaasje mensenhandel worden voornamelijk downregulated in gekweekte hersenen endotheelcellen, hetgeen duidt op een algemene daling van de endocytose en vesiculair transport in dergelijke cellen. Cultuur manipulatie in termen van zuiverheid (puromycine behandeling) en behandeling met hydrocortison kan helpen om een meer &quot;in vivo-achtige&quot; genexpressieprofiel 77 herstellen. Transcriptomic studies bleek ook belangrijke verschillen tussen soorten die voorspellingen over drugs-opname verder te compliceren bij de mens op basis van knaagdieren in vitro BBB-modellen 75. In vitro BBB-modellen met co-cultuur van humane endotheelcellen en astrocyten zijn beschreven 15. Weliswaar relevant, deze modellen zijn moeilijker uit te voeren op regelmatige basis als ze dat gereglementeerde toegang tot post-mortem menselijk weefsel en er is heterogeniteit in de kwaliteit / eigenschappen van de menselijke hersenen endotheelcellen afhankelijk van de leeftijd, ziekten, en mogelijk medische treatment van donoren. Inspanningen worden gedaan om nieuwe in vitro modellen die beter reproduceren fysiologische, anatomische en functionele kenmerken van de in vivo BBB ontwikkelen. Co-culturen waarbij drie-celtypen zijn zeer restrictief en lijken moeilijk te routinematig uitvoeren. Tot op heden de meest complexe in vitro BBB-modellen zijn de dynamische in vitro modellen (DIV-BBB) die vatachtige organisatie met astrocyten omvatten en beschikken over een stroom van medium dat de bloedstroom 75,79,80,81,82 nabootst, 83,84,85. Wanneer cerebrale endotheelcellen worden blootgesteld aan een stroom, de gegenereerde schuifspanning activeert mechanotransducers op het celoppervlak, die de expressie van verschillende genen betrokken bij endotheliale celfysiologie zoals celdeling, differentiatie, migratie en apoptose 80 moduleren. In vivo schuifspanning gegenereerd door de bloedstroom is verantwoordelijk voor mitotische arrestatie in de cel contact, dat de oprichting van een toelaatendotheelcellen monolaag in bloedvat 80. Genomics en proteomics analyse van normaal menselijk brein microvasculaire endotheelcellen toonde het effect van shear stress in BBB-endotheel fysiologie 84. Schuifspanning is verantwoordelijk voor celoverleving, een hogere endotheelcel adhesie, efflux pomp inductie en betere polarisatie van transporteurs 75, regulering van glucosemetabolisme 75,86, oxidatie gemedieerd door CYP450-enzymen 75 en de regulering van paracellulaire permeabiliteit door het verhogen van de expressie van genen die coderen voor intercellulaire junctionele elementen zoals occludin en ZO-1 87,75,80 en bijgevolg hoge TEER rond 1500 - 2000 ohm · cm 2, het dichtst bij bekende in vivo parameters 79,80 In de biotechnologie en farmaceutische industrie, routinematige screening van drugs of zelfs high throughput screening (HTS) en inspanningen om dierproeven te verminderen, leiddede ontwikkeling van verschillende cellijnen worden gebruikt ter vervanging van de primaire kweek van cerebrale endotheelcellen die moeilijker op te zetten routinematig blijven. In de meeste gevallen, werden primaire kweken van cerebrale endotheelcellen getransduceerd met een onsterfelijk makend gen (SV40 of polyomavirus groot T-antigeen of adenovirus E1A), door transfectie van plasmide DNA of door infectie met retrovirale vectoren 88,89,75. Verschillende endotheliale cellijnen van cerebrale oorsprong zijn ontwikkeld, zoals de RBE4, GP8/3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBBs of rBCEC4 rat cellijnen 88,75, de b.End3 muis cellijn 90,75, de PBMEC/C1 - 2 varkens cellijn 87,75, en de hCMEC/D3 humane cellijn 89,75. Andere modellen gebaseerd op cellen van niet-cerebrale oorsprong zoals Madin-Darby hondennier (MDCK) of Caco2 cellijnen 12,75. Van de verschillende humane cerebrale endotheliale cellijnen is de hCMEC/D3 wijd aubd en verbeterd als een model van BBB sinds haar oprichting in 2005 91,92. Net als primaire culturen, cellijnen aanwezig voordelen en beperkingen. Ze zijn gemakkelijker te hanteren dan de primaire culturen, hebben een langere levensduur, zijn goed gekarakteriseerd en laat reproduceerbaarheid tussen grootschalige experimenten. Echter, cellijnen weefsel-specifieke functies verliest, verlies milieuregelgeving en het verwerven van een moleculaire fenotype heel anders uit cellen in vivo 75, 89. In het bijzonder, monolagen gegenereerd uit cellijnen huidige verlaagde dichtheid, lage TEER-en show transporter profiel variatie 75,89. Zo dierproeven of studies in primaire cellen zijn vaak de voorkeur, ondanks hun toegevoegde complexiteit.

Veel geneesmiddelen ontwikkeld centraal zenuwstelsel (CNS) te behandelen aandoeningen zijn niet in staat om de hersenen parenchym in therapeutisch relevante concentraties bereiken. De BBB beschermt hersenen zenuwweefsel van de fluctuatie van plasma samenstelling van ziekteverwekkers en onderhoudt homeostase van het hersenparenchym door uitsluitend niet-specifieke flux van ionen, peptiden, eiwitten en zelfs cellen in en uit de hersenen 1. BBB kenmerken worden opgewekt en gehandhaafd door intieme nabijheid en overspraak tussen de gespecialiseerde klasse hersenen microvasculaire endotheelcellen en naburige elementen van de neuro-vasculaire glia-eenheid (NGVU) zoals neuronen, gliacellen (nauwkeuriger astrocyten eind voet), en pericyten gevat in de basale membraan dat in hoofdzaak bestaat uit collageen type IV, fibronectine, laminine en proteoglycanen 2,3. Pericytes dekken ongeveer 22-32% van het endotheel op het capillair niveau en spelen een belangrijkerol in de regulatie van endotheel proliferatie, angiogenese en ontstekingsprocessen. Endotheelcellen vormen een continu vel die het binnenoppervlak van de haarvaten. Zij zijn onderling verbonden door TJS die een bandvormige structuur te vormen in het apicale gebied en die bijdragen tot polarisatie cel. Astrocytes reguleren BBB eigenschappen en zijn bronnen van belangrijke regulerende factoren zoals TGF-β, GDNF, bFGF en IL-6. Astrocyten tekort aan GFAP met onvolledige functionaliteit zijn niet in staat om BBB-eigenschappen 4 reguleren. Neuronen zijn niet direct structureel betrokken bij de vorming van de BBB, maar reguleren ook belangrijke aspecten van eiwitexpressie en BBB functies 5. Om verdere studie van de structuur, fysiologie en pathologie van de BBB, in vitro modellen van BBB werd ontwikkeld als research tools. Brain endotheelcellen zijn gewonnen uit verschillende soorten uit te voeren in vitro BBB-modellen op basisop lage passage primaire kweken van runderen 6,7, varkens 8,9, 10,11,12 rat, muis 13 en ook de menselijke 14,15. Deze modellen zijn bekend bootsen de in vivo BBB, vooral wanneer co-gekweekt met gliale cellen van rat of muis en / of pericyten 16,12 en / of neurale voorlopercellen cel afkomstige astrocyten 17 en / of neuronen 18. De &quot;in lab&quot; modellen vaak uit knaagdieren omdat zij kunnen in vitro / in vivo experimenten en vergelijkingen en / of het onderzoek van de hersenen endotheelcellen uit transgene modellen 19. Nieuw ontwikkelde in vitro BBB-modellen zijn ook ontworpen om te helpen de hersenen opname van potentiële CNS kandidaat-geneesmiddelen voorafgaand aan in vivo testen 15,20,21,3,6,22,11,23 voorspellen. In vitro BBB-modellen worden meestal gebruikt om te vergelijken het vervoer van drugs met: i) bekend penetratie in het CZS of met low permeabiliteit over de BBB en geen centrale effecten, en ii) de schijnbare Pe van dezelfde geneesmiddelen gemeten in diermodellen van dezelfde soort. De geneesmiddelen die gemakkelijk over de BBB meestal lipofiele en steek de hersenen endotheliale celmembranen door lipide gemedieerde gratis verspreiding (cafeïne, carbamazepine, enz.). De negatief vervoerde geneesmiddelen zoals digoxine, verapamil of cyclosporine A actief geëxtrudeerd door hersenen endotheliale transporters zoals P-gp. Echter, veel van de nieuw ontwikkelde therapeutische moleculen biofarmaceutica, zoals recombinante eiwitten, siRNA of monoklonale antilichamen. De meeste van hen de BBB niet oversteken door i) het ontbreken van specifieke vervoerders, en ii) de dicht opeengepakte laag van endotheelcellen, die voorkomen dat hoge gewicht moleculen gevormd worden van het ondergaan paracellulaire passage. Met deze grenzen, &quot;Trojaans paard&quot; strategieën zijn geïmplementeerd met behulp van vectoren (antilichamen, peptiden) tegen bekende receptoren op de BBB, betrokken zijn in receptor gemedieerd transport of transcytose (RMT), zoals transferrine (Tf) receptor (TfR), de insulinereceptor (IR), of leden van de LDL receptor (LDLR)-gerelateerde receptoren (LDLR, LRP1). Dergelijke receptoren zijn gevonden op geïsoleerde hersenen haarvaten en de BBB in vivo 24,25. Transcriptionele profielen van deze receptoren, met name die van de familie LDLR, werden geanalyseerd en vergeleken tussen de hersenen endotheelcellen en hersenen endotheelcellen samen gekweekt met astrocyten of hersenen haarvaten direct na extractie uit de hersenen 26. Pardridge 24 opende het veld met de OX-26 antilichaam tegen de transferrinereceptor (TfR), gevolgd door antilichamen tegen de insulinereceptor en insuline-groeifactor receptor 27,28. Met deze antilichamen gebaseerde vectoren, heeft ArmaGen Technologies een BBB moleculair Trojaans paard platform technologie ontwikkeld om drugs te leveren, waaronder eiwitten, over de BBB 29. Deliteratuur is rijk aan gegevens waaruit blijkt LRP1 expressie in de hersenen endotheelcellen en haar rol als een krachtige endocytisch / scavenger receptor. Western blot analyse suggereerde dat LRP1 wordt uitgedrukt in fracties, aangerijkt met hersenen haarvaten en in de hersenen van de rat capillaire endotheelcellen 30. Bedrijven zoals Angiochem doel LRP1 met peptide vectoren afgeleid van aprotinine dat efficiënte drug instroom te bevorderen over de BBB 31. Echter, is LRP1 ook betrokken bij actief transport van AB en haar efflux / ontruiming van de hersenen parenchym om bloed 32. Deze gegevens omvatten LRP1 in een bidirectionele transport over de BBB afhankelijk van de liganden. biOasis ontwikkelt Transcend technologie met een eiwit melanotransferrine voor het transport van biologische zoals lysosomale enzymen en antilichamen over de BBB 33 terwijl VECT-HORUS ontwikkelt peptide vectoren die de LDLR 34 richten. Er worden gegevens suggereren dat de LRP en LDLR kunnen worden gebruikt diff vervoerenErent moleculen zoals lysosomale enzymen 35,36 of nanodeeltjes complexen over de BBB 37. Ons aandachtsgebied is drug delivery aan de CNS behulp vectormoleculen en vectorized drug-kandidaten voor de behandeling van het centrale zenuwstelsel. Vooral geneesmiddelafgifte over de BBB is in het kader van ontstekingsprocessen in een proces dat kan variëren in de mate van belang, maar dat waarschijnlijk voor alle hersenletsels en ziekten, waaronder encefalitis, multiple sclerose, ziekte van Alzheimer enz. ontstekingsprocessen wordt geassocieerd met BBB-ontsteking en mogelijk veranderingen in BBB fysiologie en permeabiliteit gezien het feit dat paracellulaire en transcellulaire vervoer kan worden versterkt in pathologische omstandigheden 38,39,40,41,42,43. Bijvoorbeeld, TNF-α, TWEAK, en andere cytokinen moduleren ontsteking en experimenten met in vitro BBB modellen hebben aangetoond dat zij de paracellulaire eigenschappen van e kan veranderene endotheelcellen monolaag 38,39,40 en TNF-α leidt ook tot een toename van transcellulair transport van LDL 41, holotransferrin 42 en 43 lactoferrine. Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren van een geoptimaliseerde en zeer reproduceerbaar rat syngeen BBB-model met behulp van co-culturen van primaire hersentumoren endotheelcellen en astrocyten. We gebruikten 5 week oud en neonatale Wistarratten voor hersenen endotheelcellen productie en astrocyten productie respectievelijk. Een uitdaging was om een ​​protocol waarmee de productie van &quot;wekelijkse reproduceerbare&quot; BBB-modellen vast te stellen. Om deze doelstelling te bereiken, elke stap van het productieproces protocol werd uitgevoerd op vaste dagen van de week, vanaf hersenen microvessel productie op woensdag van de eerste week. Dissecties werden bijna elke week uitgevoerd tijdens de laatste 3 jaar. Verdere verbetering van de reproduceerbaarheid van de culturen, werd een systeem voor kwaliteitsborging. Alle Reagents en chemicaliën werden verwezen in een databank (datum van binnenkomst, voorraad, vervaltermijn, enz.). Het model werd gekarakteriseerd na een aantal criteria, zoals endotheelcellen organisatie en zuiverheid, TEER, LY permeabiliteit, respons op pro-inflammatoire middelen, kwalitatieve en kwantitatieve expressie van eiwitten TJ functionaliteit van transporters zoals P-gp en receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag zoals TfR of LDLR.

<table><tbody><tr><td>BSA fraction V low endotoxin</td><td>PAA</td><td>K45-011-500g</td><td>4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>DMEM high glucose</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td>4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Invitrogen</td><td>10270-098</td><td>-20 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>T75 flasks</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer (1 M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>4 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>Collagen type IV mouse (10 x 1 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356233</td><td>-20 &deg;C / 1 maand</td></tr><tr><td>Fibronectin humain plasma (5 mg)</td><td>Becton Dickinson</td><td>356008</td><td>-20 &deg;C / 1 maand</td></tr><tr><td>Vannas spring scissors, straight (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Scissors, straight (9 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, tip width 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps, curve tip width 0.8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Collagenases / dispase mix (2 x 5 mg)</td><td>Roche Diagnostics</td><td>05 401 054 001</td><td>-20 &deg;C / 3 maanden</td></tr><tr><td>DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>DN25-100 mg</td><td>-20 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>Gentamicin (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td>4 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>31331-028</td><td>4 &deg;C&nbsp;</td></tr><tr><td>Bovine serum from platelet poor plasma (500 ml)</td><td>Clinisciences</td><td>BT-214-100</td><td>-20 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>bFGF (10 &micro;g)</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td>-20 &deg;C / 6 maanden</td></tr><tr><td>Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td>4 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833-10 mg</td><td>-20 &deg;C / 6 maanden</td></tr><tr><td>ITSX</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>4 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td><td>Millipore</td><td>PIRP15R48</td><td>Porosity: 1 &micro;m Surface: 1.1 cm2</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1 g</td><td>-20 &deg;C / 1 jaar</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD31 / PECAM&nbsp;</td><td>Chemicon</td><td>MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Von Willebrand</td><td>Chemicon</td><td>AB7356</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Desmine</td><td>Chemicon</td><td>MAB3430</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Vimentine</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>08-0052 clone V9, (58 &micro;g/ml)&nbsp;</td><td>1/50 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-Claudin-5</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>35-2500, (500 &micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-ZO-1</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>61-7300 (250 &micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Occludine&nbsp;</td><td>Invitrogen, Zymed</td><td>71-1500 (250 &micro;g/ml)</td><td>1/200 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>1/800</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH, dilithium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L0259</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>TNF-alpha human</td><td>PeproTech</td><td>300-01A</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>Rat MCP-1 ELISA Kit</td><td>PeproTech</td><td>900-K59</td><td>4 &deg;C / -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Mouse anti-P-glycoprotein</td><td>Covance, Eurogentec</td><td>SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td><td>1/400 - fixatie PFA 4% 1/200 (western blot)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-GLT-1</td><td>Abcam</td><td>ab41621</td><td>1/1.000 (western blot)</td></tr><tr><td>Rhodamine 123</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83702</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V4629</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30024</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td><td>American Diagnostica</td><td>3501 (100 &micro;g/ml)</td><td>1/5 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Mouse anti-LDLR</td><td>R&amp;D systems</td><td>AF2255 (200 &micro;g/ml)</td><td>1/50 - fixatie PFA 4%</td></tr><tr><td>Rat transferrin-Cy3</td><td>Gentaur</td><td>JOR160050</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>DiILDL</td><td>Invitrogen</td><td>L-3482</td><td>4 &deg;C</td></tr></tbody></table>

oprichting van een<em&gt; in vitro</em&gt; model van rat bloed-hersenbarrière (bbb): een focus op bbb ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

De bloed-hersenbarrière (BBB) ​​regelt specifiek de moleculaire en cellulaire flux tussen het bloed en het zenuwweefsel. Ons doel was het ontwikkelen en karakteriseren zeer reproduceerbare syngeen rat in vitro model van de BBB met co-culturen van primaire endotheelcellen van rattenhersenen (RBEC) en astrocyten receptoren betrokken transcytose in de endotheelcellen monolaag bestuderen. Astrocyten werden geïsoleerd door mechanische dissectie volgende trypsinedigestie en voor later co-cultuur zijn bevroren. RBEC werden geïsoleerd uit 5 weken oude cortex rat. De hersenen werden ontdaan van hersenvliezen en witte stof, en mechanisch gescheiden na enzymatische afbraak. Daarna werd het weefselhomogenaat in runderserumalbumine gecentrifugeerd verblijf fragmenten scheiden van zenuwweefsel. De fragmenten schip onderging een tweede enzymatische digestie vrij endotheelcellen uit hun extracellulaire matrix. De resterende contaminerende cellen zoals pericyten werden fERDERE geëlimineerd door plating de microvessel fragmenten in-puromycine bevattend medium. Ze werden vervolgens gepasseerd op filters voor co-cultuur met astrocyten geteeld op de bodem van de putjes. RBEC uitgedrukt hoge niveaus van tight junction (TJ) eiwitten zoals occludin, claudin-5 en ZO-1 met een typische lokalisatie in de cel grenzen. De transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van de hersenen endotheliale monolagen, met vermelding van de dichtheid van TJs bereikt 300 ohm · cm 2 gemiddeld. De endotheliale permeabiliteit coëfficiënten (Pe) voor lucifer geel (LY) was zeer reproduceerbaar met een gemiddelde van 0,26 ± 0,11 x 10 -3 cm / min. Brain endotheelcellen georganiseerd monolagen sprak de efflux transporter P-glycoproteïne (P-gp), toonde een gepolariseerd transport van rhodamine 123, een ligand voor P-gp, en toonde specifieke transport van transferrine-Cy3 en DiILDL in de endotheelcellen monolaag. Tot slot bieden we een protocol voor het opzetten van een in vitroBBB model dat zeer reproduceerbaar door de kwaliteitsborgingsmethoden en die geschikt is voor onderzoek naar BBB transporters en receptoren.

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Het algemene doel van deze procedure is het opzetten van een zeer reproduceerbaar in vitro model van de bloed-hersenbarrière van ratten. Dit wordt bereikt door de oogzenuwen, het cerebellum en de meninges onder een stereomicroscoop te verwijderen, waarna de twee hersenhelften worden gescheiden en gedissecteerd om een schoon stuk cortex te verkrijgen. De tweede stap is het isoleren van de microvaten uit de cortex door middel van enzymatische behandeling en dichtheidsafhankelijke centrifugatie.Vervolgens worden de microvaten uitgeplaat en geïncubeerd met puromycine om de endotheelcellen te zuiveren van contaminerende cellen, zoals parasieten. Pure culturen van ratten hersenendotheelcellen prolifereren totdat de cellen een confluentie van 90% bereiken. De laatste stap is het induceren van de differentiatie van de ratten hersenendotheelcellen door de cellen in de bovenste kamer van de insertfilters en door deze samen te kweken met vooraf geprepareerde en uitgeplaatte ratten astrocyten.Uiteindelijk kan de gedifferentieerde monolaag van hersenendotheelcellen worden gekenmerkt door de expressie van specifieke tight junction-eiwitten en door de permeabiliteitsindex van een referentieverbinding door de endotheelcelmonolaag vanuit het bovenste compartiment. In vitro BBB-modellen, zoals het hier gepresenteerde, zijn nuttig om de cellulaire distributie van sleutelmoleculen te onderzoeken en om basale cellulaire en moleculaire mechanismen van de BBB-functie te ontrafelen. In het bijzonder maken dergelijke modellen het mogelijk om BBB-receptoren en hun betrokkenheid bij endocytose-transport en transcytose in onze handen te onderzoeken.De in vitro BBB-modellen worden voornamelijk gebruikt om de targeting van specifieke receptoren met peptidevectoren te onderzoeken die wij ontwikkelen. Om de toediening van geneesmiddelen in het CZS over de BBB te vergemakkelijken, maken we gebruik van een proces dat receptor-gemedieerde transcytose wordt genoemd, ook wel bekend als de Trojan horse-benadering. Een visuele beschrijving is cruciaal, aangezien personen die nieuw zijn met deze methode dissectievaardigheden en een microscoop nodig hebben om snel en nauwkeurig genoeg te kunnen werken om de weefseloverleving tijdens het celproductieproces te waarborgen.Een ander kritiek punt is het vroegtijdig afsluiten van het fragiele en het tele-zalmgebied om te voorkomen dat barrières openen tijdens de experimenten. Ten slotte zal dit idee details in het protocol laten zien die het onderscheid maken tussen de rode en gevisualiseerde protocollen, waarbij wordt aangetoond dat de procedure door mijzelf en mijn collega zal worden uitgevoerd. Begin deze procedure door twee T 75-flessen te coaten met collageen type vier en fibronectine met een concentratie van 1 µg/cm² in steriel cultuurwater, en laat deze in de incubator bij 37 °C hechten tot het zaaien van de microvaten.Verwijder twee dagen later de hersenen uit de schedel van drie vijf weken oude Vista-ratten en breng de hersenen over naar een petrischaal gevuld met koude dissectiebuffer op ijs. Disseceer de hersenen waarbij het cerebellum en de oogzenuwen worden verwijderd. Snijd vervolgens elke hersenmassa onder de stereomicroscoop doormidden om de twee hersenhelften te scheiden.Maak een volgende snede om de middenhersenen te verwijderen en breng alle vier de hersenen over naar een schone Petrischaal op ijs met dissectiebuffer. Breng vervolgens één voorhersenen over naar een nieuwe Petrischaal gevuld met koude dissectiebuffer. Houd deze vast met een klem en verwijder voorzichtig de hersenvliezen van de randen van de voorhersenen.Keer daarna de voorhersenen om en trek de hersenvliezen voorzichtig af zonder ze te scheuren. Zorg ervoor dat de voorhersenen volledig vrij zijn van hersenvliezen en knip het overgebleven deel van de oogzenuwen door. Het doel van deze stap is om de laag witte stof te verwijderen zodat er een schil van de cortex overblijft.Begin met het klemmen van de voorhersenen aan de rand en trek vervolgens voorzichtig de pincet over het oppervlak, waarbij u erop let dat het oppervlak van de cortex niet beschadigd raakt. Controleer daarna of de hersenen vrij zijn van de hersenvliezen door ze om te draaien en te controleren of er geen resterende hersenvliezen of grote oppervlakkige bloedvaten aanwezig zijn. De totale tijd voor de dissectie, beginnend bij de extractie van de drie hersenen uit de schedel, mag niet langer dan twee uur bedragen voor het behoud van het weefsel en de overleving van de cellen.Overbreng de cortices van drie hersenen naar 6 mL koude dissectiebuffer in een 7 mL Dounce-homogenisator; dissociate vervolgens de cortices met 10 op- en neergaande bewegingen met de eerste stamper met grotere speling, gevolgd door 10 op- en neergaande bewegingen met de tweede stamper met kleinere speling. Overbreng daarna 6 mL van de suspensie naar een nieuwe 50 mL Falcon-buis en spoel de Dounce-homogenisator met 24 mL koude dissectiebuffer. Verdeel de suspensie over drie Falcon-buizen om het equivalent van één cortex per buis te verkrijgen. Centrifugeer vervolgens bij 1000 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Waarneming van het pellet laat een gradiënt van roze kleur zien, wat het deel van de microvaten van de cortices vertegenwoordigt. Verwijder nu het supernatant en homogeniseer het pellet van één cortex met één milliliter enzymatische oplossing die een mengsel bevat van collagenase dyse, DNA type one en Gentamycine. Plaats de buizen 30 minuten lang in een schudmachine bij 37 °C.Meng vervolgens één milliliter van het digestaat met 10 milliliter 25%B-S-A-H-B-S-S één X, vortex de buisjes voorzichtig en scheid ze vervolgens door middel van dichtheidsafhankelijke centrifugatie bij 3.600 Gs gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na de dichtheidsafhankelijke centrifugatie bevat het pellet de microvaten en bevat de bovenste schijf myeline brain parenchyma en residuele microvaten. Breng de bovenste schijf en het supernatant voorzichtig over in schone 50 milliliter falcon-buisjes.Zorg ervoor dat het pellet met de microvaten niet wordt weggezogen; vortex de buis voorzichtig en herhaal de dichtheidsafhankelijke centrifugatie tijdens de tweede centrifugatie. Bewaar het resulterende pellet met de microvaten bij vier graden celsius. Gooi na de tweede dichtheidsafhankelijke centrifugatie voorzichtig de bovenste schijf en de snat-mix weg en resuspendeer de resulterende pellets met de microvaten van beide centrifugaties in één milliliter koude HBSS 1x.Was daarna de microvaten met 20 milliliters koude hbss one x en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 Gs. Verwijder vervolgens het supernatant, waarbij u er zorg voor draagt dat de microvaten niet verloren gaan. Homogeniseer het pellet van de microvaten uit één cortex met één milliliter van dezelfde enzymatische oplossing door de buizen voorzichtig te vortexen.Verteer de microvaten verder gedurende één uur bij 37 °C in een schudmachine. Meng daarna de verteerde microvaten van de drie cortices in één buis. Verdeel het mengsel vervolgens opnieuw over twee Falcon-buizen van 50 ml om microvaten te verkrijgen die geëxtraheerd zijn uit het equivalent van anderhalf cortex per buis.Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 1000 Gs. Neem bij kamertemperatuur, vlak voordat de microvaten worden uitgeplaat, twee gecoate T 75-kolfjes uit de incubator en aspireer het overschot aan coating. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet van de microvaten in één milliliter ECM; vul elke buis aan tot 10 milliliter met ECM gesupplementeerd met vier micrograms per milliliter.Voeg purmycine toe om het zuiveringsproces te starten en zaai de microvaten uit in de kolf. Plaats de kolven vervolgens in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 om de adhesie van de microvaten aan de collageen-fibronectine-matrix na het zuiveringsproces mogelijk te maken. Was 24 uur na het uitzaaien van de microvaten het celpuin met verse ECM en vervang het kweekmedium door ECM aangevuld met 4 µg/mL purmycine tot dag vijf in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. 24 uur na het uitzaaien van de microvaten beginnen de endotheelcellen te migreren en zich te verspreiden over de collageen-fibronectine-matrix. Was op dag vijf, om het zuiveringsproces te voltooien, het celpuin met verse ECM en vervang het kweekmedium door ECM aangevuld met 2 µg/mL.Behandel drie dagen langer met Puromycine voor proliferatie. Was de cellen op dag acht en voeg insuline, transferrine en natriumseleniet toe. Vul het kweekmedium aan tot de culturen op dag 10 een confluentie van 90% bereiken.Bereid op dag acht de filters van drie 12-wells platen voor door ze te coaten met een mengsel van collageen type IV en fibronectine, beide met een concentratie van 0.5 µg/cm² in steriel cultuurwater. Begin met het toevoegen van 1.5 mL steriel cultuurwater in het onderste compartiment.Voeg vervolgens 0,5 milliliters van het mengsel toe aan het bovenste compartiment. Laat de matrix hechten bij 37 degrees Celsius tot het uitzaaien van de endotheliale cellen op dezelfde dag, vijf dagen voor de vestiging van de co-cultuur. Ontdooi de astrocyten uit cryovials bij 37 degrees Celsius en breng de cellen over naar een 15 milliliter falcon tube met 10 milliliters GCM centrifuge.Centrifugeer de suspensie bij 120 Gs gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer vervolgens het astrocytenpellet in GCM en zaai deze uit met een dichtheid van 30.000 cellen per vierkante centimeter. Plaats de 12-wells platen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 op dag 10, vlak voor de dissociatie van RBEC met trypsine.Was het vooraf gecodeerde filter met DMM F 12-medium, vul de kamers vooraf met ECM en plaats ze terug in de incubator tot de plating van de RBEC op dezelfde dag. Was de RBEC tweemaal met DPBS zonder calcium en magnesium. Voeg vier milliliter warme trypsine-EDTA-oplossing per T 75-fles toe bij 37 °C gedurende precies 30 seconden en verwijder 3,5 milliliter van de trypsine-EDTA-oplossing.Zorg ervoor dat de endotheelcellen altijd bedekt blijven met een laag trypsin-EDTA. Volg vervolgens de loslating van de cellen via observatie onder de microscoop. Wanneer de cellaag zich begint los te maken van de matrix, tik dan voorzichtig tegen de rand van de T 75-fles tot alle cellen zweven.Voeg drie milliliter ECM toe aan elke T 75-fles en breng dit over naar een Falcon-buis van 50 milliliter. Herhaal deze stap twee keer door het medium door te spoelen om alle cellen terug te winnen.Disсоcieer de celсусpensie zeer voorzichtig door vier keer op en neer te pipetteren met een 10 milliliter pipette voorzien van een gele tip. Tel de cellen in de suspensie en zaai deze de volgende dag onmiddellijk met een hoge dichtheid uit op de vooraf gecodeerde en gevulde filters. Vers xlabel het medium van het bovenste compartiment twee keer om celresten te verwijderen, teneinde verstoring van de celmonolaag tijdens de vervanging van het medium te voorkomen.Houd de plaat iets schuin en breng de aspiratiepipet niet te dicht bij het oppervlak, zodat er altijd wat medium boven de cellaag blijft; dit is noodzakelijk om uitdroging van de cellaag tijdens het vervangen van het medium te voorkomen. Was slechts zes inserts tegelijk. 24 uur na het uitplaten moet de cellaag confluent zijn.Vervang vervolgens op dezelfde dag, één dag voor het opzetten van de co-cultuur, het astrocyte-kweekmedium op dag 12 door 1,5 milliliters aangevuld differentiatiemedium, waarbij dag 12 wordt gedefinieerd als de eerste dag van differentiatie. Vervang het kweekmedium in de filters die de RBEC bevatten door differentiatiemedium. Plaats daarna de RBEC-filters onder deze omstandigheden in de wells met de astrocyten.In vitro modellen differentiëren en brengen junctie-gerelateerde eiwitten binnen drie dagen tot expressie, waarna de optimale differentiatie nog drie dagen voortduurt. Hier werd de celmonolaag immunogekleurd om een confluente cerebrale endotheelcelmonolaag te onthullen met een niet-overlappende morfologie en de typische spoelvormige cellen met endotheelmorfoloog, evenals de expressie van tight junction-eiwitten zoals ZO-1 en occludine. De dichtheid van de monolaag in het 12-well BBB-model werd beoordeeld door het transport van Lucifer yellow te meten.De resultaten worden uitgedrukt in permeabiliteit of PE in 10⁻³ centimeter per minuut, en de barrière wordt als permeabel of open beschouwd wanneer de PE van LY boven 0,6 × 10⁻³ centimeter per minuut ligt. In de afgelopen decennia hebben veel publicaties en reviews informatie verschaft over statische en dynamische in vitro BBB-modellen van verschillende soorten. Dergelijke modellen blijven echter moeilijk hanteerbaar en de reproduceerbaarheid van de barrièrekwaliteit blijft een belangrijk doel.Na het bekijken van deze video zouden wetenschappers een goed begrip moeten hebben van hoe een in vitro model van de PBB geproduceerd en gekarakteriseerd kan worden.

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

This video demonstrates a method to study permeation through an in vitro blood-brain barrier (BBB) model using astrocytes and endothelial cells on a membrane insert, with free FITC and FITC-loaded ferritin. FITC-ferritin bound to receptors on endothelial cells and crossed the membrane barrier to the lower chamber while free FITC showed restricted permeation and remained in the upper chamber.

Studying the Permeation of FITC and FITC-Ferritin through an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

Een methode om een in vitro model van de bloed-hersenbarrière te vestigen op basis van een co-cultuur van endotheelcellen van rattenhersenmicrovatsculair en astrocyten wordt beschreven en gevalideerd. Dit systeem bleek een geldige tool te zijn om het effect van nanoformulering op de trans-barrière penetratie van fluorescerende moleculen te bestuderen.

In Vitro Permeatie van FITC-geladen Ferritins Across een Rat bloed-hersenbarrière: een model om de Levering van Nanoformulated Molecules Studie

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier wordt een methode voor het isoleren van de rat hersenen microvessels en voor de bereiding van de eindmonsters membraan beschreven. Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het produceren van verrijkte microvessel monsters met aanvaardbare eiwit van individuele dieren opbrengst. Steekproeven kunnen vervolgens worden gebruikt voor analyses van de robuuste proteïne in de hersenen microvasculaire endotheel.

Een eenvoudige en reproduceerbare methode te bereiden membraan monsters van vers geïsoleerde Rat hersenen Microvessels

Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt in vitro model van de bloedbarrière van de hersenen. De methode maakt gebruik van cerebrale vasculaire endotheelcellen bEnd.3 van muizen en meet de transmembraan elektrische weerstand.

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Leer een reproduceerbaar in vitro model van de ratbloed-hersenbarrière opzetten met endotheliale cellen en astrocyten. Deze methode maakt onderzoek naar barrière-eigenschappen en geneesmiddelafgifte mogelijk.

Oprichting van een In Vitro Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport (Video) | JoVE Journal

Oprichting van een

Meer video's verkennen