Sequentiële In vivo Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam- en voorlopercellen in botfractuurherstel sequentieel te volgen en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst mixo virus, griepvirusresistentie, een of MX een positieve cellen in vivo te labelen door injectie van poly cynische polycyto iliële zuur, en vervolgens de residente MX een positieve hematopoëtische cellen door bestraling te elimineren. In de tweede stap worden wildtype beenmergcellen systematisch toegediend aan de bestraalde muizen.

Vervolgens worden microfracturen gegenereerd in het Cal-gebied van de muis door naaldboren. Ten slotte wordt sequentiële intra-viale beeldvorming van de microfractuurreparatie uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen deze intravitale beelden worden gebruikt om de dynamische instroom en expansie van osteogene stam- en voorlopercellen in de fractuurlocaties te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze in vivo herhaalde beeldvorming van osteogene stam- en voorlopercellen tijdens het verloop van het fractuurgenezingsproces mogelijk maakt. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot de therapie van fractuurgenezing en osteoporose. Aangezien deze methode een nieuw hulpmiddel biedt voor het monitoren van endogene osteogene stamvoorlopercellen bij botregeneratie en -reparatie.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien het genereren van de microfractuur met minimaal weefselschade en herhaalde in vivo beeldvorming van de fractuurletsel zonder ernstige littekenvorming te induceren belangrijk is voor de methode en technisch uitdagend. Om MX een positieve cellen in vivo te labelen, begint u met het injecteren van 200 microliter poly-zuur polycyto iliële zuur per 20 gram MX een Cree reportermuisgewicht intraperitoneaal eens per twee dagen gedurende 10 dagen. Vervolgens elimineren de residente MX een positieve hematopoëtische cellen door de geïnjecteerde muizen met een enkele dosis van 9,5 gras te bestralen. Na 24 uur transplanteert u eenmaal 10 tot de zesde wildtype beenmergcellen intraveneus per muis.

Vier tot zes weken later, verdooft u de muis door intraperitoneale injectie met 50 microliter ketamine xylazine. Na bevestiging van sedatie door teenprik, knip de hoofdhaar van de muis met beenmergcellen en steriliseer vervolgens de blootgestelde huid met een 70% alcoholdoekje. Breng traanvochtgel aan om hoornvliesuitdroging te voorkomen en maak vervolgens een transversale incisie van minder dan een centimeter lang over de hoofdhuid, beginnend bij een oor en eindigend bij de andere. Draai vervolgens het dier ongeveer 60 graden en verleng de incisie totdat deze ongeveer twee tot drie millimeter van de neus af ligt met behulp van pincetten.

Trek het flapje weefsel naar de zijkanten van het dier om de huid te scheiden, zowel de voorste botten als de kruising van de sagittale en coronale suturen moeten nu duidelijk zichtbaar zijn. Spoel het open oppervlak met steriel PBS en veeg vervolgens de resterende haren voorzichtig weg met wattenstaafjes. Houd vervolgens de muiskop met de ene hand en een 30 gauge naald met de andere vast om microfracturen op de calvaria te genereren.

Gebruik de naaldtip van 30 gauge om een micropunctie te maken op een zijde van de voorste botten nabij de kruising van de sagittale en coronale suturen. Om penetratie van de hersenen te voorkomen, schakel over naar een grotere gauge en draai de nieuwe naald om het punctiegat te verwijden tot ongeveer 0,5 millimeter in diameter. Na het maken van een tweede punctie op het contralaterale voorste bot, druppel continu PBS in elke plek en veeg totdat het bloeden stopt.

Vervolgens, om uitdroging te voorkomen, brengt u voldoende druppels steriel fysiologisch zout op het schedeldak aan om het gebied volledig te bedekken om de Vidal-beelden te verkrijgen. Schakel eerst de polygoon-gebaseerde laserscanner in om gelijktijdige multikanaals beeldverwerving met een videosnelheid van 30 frames per seconde mogelijk te maken. Schakel vervolgens de femtoseconde titaniumsaffierlaser in voor multifotonbeeldvorming.

Stel het vermogen en de golflengte in op 880 nanometer voor tweede harmonische generatiebeeldvorming van het calvariaal bot op 440 nanometer voor GFP en TD-tomaat excitatie, schakel de 491 nanometer en 561 nanometer vaste staat lasers in. Schakel vervolgens de fotovermenigvuldigingsbuisdetectoren in voor elk signaal met een 435 plus min 20 nanometer bandpassfilter voor tweede harmonische generatie, een 528 plus min 19 nanometer bandpassfilter voor GFP en een 590 plus min 20 nanometer bandpassfilter voor TD-tomaat. Plaats nu het dier op een XYZ-as gemotoriseerde microscoopstandaard bovenop een elektrische verwarmingskussen ingesteld op 37 graden Celsius.

Gebruik tape om de muis in positie te houden en breng vervolgens een druppel warm 2% Methylcellulose-gebaseerd gel aan op de schedel. Om uitdroging te voorkomen, legt u een dekglaasje op het beeldvormingsgebied. Gebruik vervolgens een 30 x waterimmersieobjectief met 0,9 numerieke apertuur en de XY, Z-ascontroller om het SHG-signaal van de botten te detecteren.

Om het oppervlak van de calvaria te vinden, identificeert u een cruciale oriëntatieplaats, zoals de kruising tussen de sagittale en coronale suturen, en neemt u een beeld op. Markeer de XY, Z-coördinaten van de oriëntatieplaats en zoek vervolgens verder naar de locatie van het letsel met behulp van de SHG en fluorescente signalen als gids. Wanneer elke regio van belang is gevonden, neemt u een beeld op van het beste focale vlak dat de SHG en fluorescente signalen van de cellen van belang bevat.

Sla de XY, Z-coördinaten en de afstand tot de kruising van de sagittale en coronale suturen op om hun precieze locatie voor de volgende ronde van beeldvorming te definiëren. Verzamel vervolgens 3D-cellulaire en botstructuren van het fractuurletsel. Neem beelden op in ongeveer twee tot vijf micrometer Z-stack intervallen met ongeveer een 100 micrometer diepte vanaf het endoboonoppervlak.

Ten slotte, na beeldvorming van beide letselplaatsen, gebruikt u meerdere druppels ster