Sequentiële

Het algemene doel van deze procedure is om sequentieel de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam- en progenitorcellen bij de genezing van botbreuken te volgen en te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst in vivo MX1-positieve cellen te labelen via injectie van polycytidische zuur (poly(I:C)), om vervolgens de aanwezige MX1-positieve hematopoëtische cellen te elimineren door middel van bestraling. In de tweede stap worden wildtype beenmergcellen systematisch toegediend aan de bestraalde muizen.

Vervolgens worden er microfracturen gegenereerd in het Cal-gebied van de muis door middel van naaldboring. Ten slotte wordt sequentiële intravitale beeldvorming van de herstelprocedure van de microfractuur uitgevoerd. Deze intravitale beelden kunnen uiteindelijk worden gebruikt om de dynamiek van de instroom en expansie van osteogene stam- en progenitorcellen in de fractiestellen te evalueren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in vivo repetitieve beeldvorming mogelijk maakt van osteogene stam- en progenitorcellen tijdens het proces van fractuurgenezing. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie voor fractuurgenezing en osteoporose, aangezien deze methode een nieuw instrument biedt voor het monitoren van endogene osteogene stamprogenitorcellen bij botregeneratie en -herstel.

Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien het genereren van de microfractuur met minimale weefselschade en de herhaalde in vivo beeldvorming van het fractuurletsel zonder het induceren van ernstige littekenvorming belangrijk voor de methode zijn en technisch uitdagend zijn. Om MX1-positieve cellen in vivo te labelen, begint u met het intraperitoneaal injecteren van 200 µL poly-acidic poly-cytoilic acid per 20 gram gewicht van de MX1-Cree reportermuis, om de dag gedurende 10 dagen. Bestraal vervolgens de geïnjecteerde muizen met een enkele dosis van 9,5 Gy om de aanwezige MX1-positieve hematopoëtische cellen te elimineren. Transplanteer na 24 uur 1 × 10⁶ wild-type beenmergcellen intraveneus per muis.

Vier tot zes weken later wordt de muis geanestheseerd door middel van een intraperitoneale injectie met 50 µL ketamine xylazine. Na bevestiging van de sedatie via een knijptest in de teen, wordt de hoofdhuid van de muis met getransplanteerde beenmergcellen geschoren, waarna de blootgestelde huid wordt gesteriliseerd met een 70% alcohol-wattenstaafje. Breng traangel aan om corneaal uitdroging te voorkomen en maak vervolgens een transversale incisie van minder dan één centimeter over de hoofdhuid, beginnend bij het ene oor en eindigend bij het andere. Draai het dier vervolgens ongeveer 60 graden en zet de incisie met een pincet voort tot deze ongeveer twee tot drie millimeter voor de neus reikt.

Trek de weefselflap naar de zijkanten van het dier om de huid te scheiden; zowel de frontale beenderen als het kruispunt van de sagittale en coronale suturen moeten nu duidelijk zichtbaar zijn. Spoel het open oppervlak met steriele PBS en veeg vervolgens voorzichtig de resterende haren weg met wattenstaafjes. Houd vervolgens, om microfracturen in het schedeldak te veroorzaken, de kop van de muis met één hand en een naald van 30 gauge met de andere hand vast.

Gebruik de naaldpunt van maat 30 om voorzichtig een microperforatie te maken aan één zijde van de frontale beenderen, nabij het kruispunt van de sagittale en coronale suturen. Schakel over naar een grotere naaldmaat en draai de nieuwe naald om het perforatiegat te verbreden tot ongeveer 0,5 millimeter in diameter om penetratie van de hersenen te voorkomen. Nadat een tweede perforatie in het contralaterale frontale bot is gemaakt, wordt er continu PBS op elke plek gedruppeld en afgeveegd tot de bloeding stopt.

Breng vervolgens, om uitdroging te voorkomen, een voldoende grote druppel steriele fysiologische zoutoplossing aan op de schedel om het gebied dat voor de Vidal-beelden moet worden vastgelegd volledig te bedekken. Zet eerst de polygoon-gebaseerde laserscanner in om gelijktijdige multichannel-beeldacquisitie mogelijk te maken met een videosnelheid van 30 frames per seconde. Zet vervolgens de femtoseconde titanium-safierlaser in voor multifoton-beeldvorming.

Stel het vermogen en de golflengte in op 880 nanometers voor second harmonic generation-beeldvorming van het schedeldakbeen bij 440 nanometers voor GFP- en TD-tomato-excitatie, en schakel de solid-state lasers van 491 nanometer en 561 nanometer in. Schakel vervolgens de fotomultiplicatorbuisdetectoren voor elk signaal in: een banddoorlaatfilter van 435 ± 20 nanometer voor second harmonic generation, een banddoorlaatfilter van 528 ± 19 nanometer voor GFP en een banddoorlaatfilter van 590 ± 20 nanometer voor TD-tomato. Plaats het dier nu op een gemotoriseerde microscooptafel met XYZ-assen bovenop een elektrisch verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 °C.

Gebruik plakband om de muis op zijn plaats te houden en breng vervolgens een druppel warme 2% methylcellulose-gebaseerde gel aan op de schedel. Om uitdroging te voorkomen, wordt een dekglas op het beeldgebied geplaatst. Gebruik daarna een 30 x waterimmersie-objectief met een numerieke apertuur van 0,9 en de XY- en Z-asregelaar om het SHG-signaal van de botten te detecteren.

Om het oppervlak van het kalf te vinden, identificeert u een cruciale referentieplaats, zoals het kruispunt tussen de sagittale en coronale suturen, en legt u een beeld vast. Markeer de XY-, Z-coördinaten van dit referentiepunt en zoek vervolgens verder naar de locatie van het letsel, waarbij u de SHG- en fluorescentiesignalen als leidraad gebruikt. Wanneer elk interessegebied is gevonden, legt u een beeld vast van het beste brandvlak dat de SHG- en fluorescentiesignalen van de betreffende cellen bevat.

Sla de XY-, Z-coördinaten en de afstand tot het snijpunt van de sagittale en coronale suturen op om hun precieze locatie te definiëren voor de volgende beeldronde. Verzamel vervolgens 3D-cellulaire en botstructuren van de fractuurletsel. Registreer beelden in Z-stap-intervallen van ongeveer twee tot vijf micron met een diepte van ongeveer 100 micron vanaf het endobenoppervlak.

Verwijder ten slotte, na het afbeelden van beide letselplaatsen, de 2% methylcellulosegel van de schedel met meerdere druppels steriele zoutoplossing. Breng vervolgens antibiotica aan op het oppervlak en dek de schedel af met de huidflappen; sluit de hoofdhuid opnieuw met hypoallergene hechtdraad en houd het dier in een warme herstelkamer totdat het voldoende bij bewustzijn is. Herhaal na drie tot vijf dagen de stappen voor intravitale beeldvorming om de cellulaire veranderingen tijdens de genezing van de fractuur te volgen.

In dit representatieve experiment werden twee microfracturen veroorzaakt in de frontale botten van genische MX1 tomato osteocalcine GFP-muizen na bestraling en vervanging van het beenmerg. Sequentiële 3D intravitale beeldvorming van de microfracturen toonde op dag twee een relocatie van de tomato-positieve osteogene stam- en progenitorcellen binnen de fractieplaats, evenals hun expansie op dag vijf. Hoewel er op dit moment geen GFP-positieve osteoblasten werden gedetecteerd, initieerde op dag 12 een subset van osteoprogenitoren nabij het fractieoppervlak de differentiatie tot tomato-positieve GFP-positieve osteoblasten, zoals aangegeven door de pijl. De accumulatie van nieuwe osteoblasten en nieuwe botvorming op dag 21 geeft aan dat de migratie en proliferatie van de osteogene progenitorcellen een belangrijk mechanisme was voor de aanvoer van nieuwe osteoblasten voor de genezing van de fractuur. Om te testen of deze methode een consistente en kwantitatieve output van het aantal osteoprogenitoren tijdens de fractuurgenezing biedt, werden MX1 YFP-positieve osteogene stam- en progenitorcellen gedurende 14 dagen na het letsel gevolgd.

Kleine aantallen van de progenitors werden consequent gedetecteerd op de plaats van het letsel na drie dagen. De celaantallen namen continu toe op dag zeven en bereikten een piekpopulatie op dag 10, die werd gehandhaafd tot dag 14. De kinetiek van de generatie van de osteo-progenitors werd gekwantificeerd door de YFP-signaalintensiteit in de tijd te meten, en gecorreleerd met de waarnemingen via intravitaal microscopie.

De progenitoren werden voor het eerst waargenomen op dag drie, bereikten een piek op dag 10 en bleven tot dag 14 op een vergelijkbaar hoog intensiteitsniveau. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat bekwaam hechtwerk en minimale bloedingen de littekenvorming kunnen verminderen en de achtergrondautofluorescentie kunnen verlagen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stamprogenitorcellen tijdens het proces van fractuurherstel kunt afbeelden en volgen.