Excitotoxische Stimulatie van Hersenen Microslices als In vitro Model van een beroerte
4 februari 2014
We hebben hersenen slice model dat gebruikt kan worden om de moleculaire mechanismen betrokken bij-gemedieerde excitotoxiciteit hersenletsel onderzoeken ontwikkeld. Deze techniek genereert levensvatbare volwassen hersenweefsel en vermindert nummers die nodig zijn voor experimenten dier, met behoud van de neuronale circuits, cellulaire interacties, en postsynaptische compartimenten gedeeltelijk intact.
Het algemene doel van deze procedure is om cytotoxische stimulatie toe te passen op hersenmicroslices om een in vitro beroertemodel te creëren. Dit wordt bereikt door eerst microslices te bereiden van een vers geïsoleerd brein. De tweede stap is om de microslices in evenwicht te brengen met zachte agitatie.
Eenmaal in evenwicht, zijn de microslices klaar om een verscheidenheid aan experimentele manipulaties te ondergaan. Uiteindelijk tonen de resultaten aan dat microslices minstens twee uur na de generatie levensvatbaar zijn. Het belangrijkste voordeel van onze techniek ten opzichte van andere bestaande technieken, zoals primaire embryonale, neuronale culturen, is dat onze techniek gebruik maakt van plakjes van volwassen hersenweefsel, die meer dan één celtype bevatten en daarom representatiever zijn voor intact hersenweefsel.
De eerste stap is om vers hersenweefsel te verkrijgen. Dompel de hersenen in een kleine hoeveelheid warme Krebs-buffer. Om eventuele restanten huid, vacht of bloed te verwijderen, bereid een Macle Wain Chopper voor met twee vellen filterpapier bevochtigd met warme Krebs-buffer.
Als het klaar is, plaats de hersenen op de tafel van de chopper. Houd de hersenen en het filterpapier vochtig met warme crebs-buffer tijdens het werk om te voorkomen dat de hersenen glijden. Zorg ervoor dat er niet te veel vloeistof op het oppervlak ophoopt.
Snijd de hersenen in coronale secties van 250 micrometer. Draai vervolgens de tafel 90 graden en maak sagittale slices van 250 micrometer. Na deze stap worden de hersensecties microslices genoemd.
Plaats de microslices in een ronde bodem twee met 10 tot 15 milliliter warme crebs-buffer. Schud de buis voorzichtig totdat individuele microslices zijn opgeschort en laat ze vervolgens onder invloed van de zwaartekracht bezinken. Verwijder voorzichtig het supernatant, dat troebel zal zijn vanwege gesuspendeerde celresten, en voeg 10 milliliter verse warme crept-buffer toe aan de buis.
Herhaal de wasprocedure vier keer om de meeste restanten te verwijderen. Breng de microslices in evenwicht bij 37 graden Celsius met zachte schudbewegingen of inversie, en ververs de Krebs-buffer elke 15 minuten gedurende een totaal van een uur. Voeg na deze tijd twee milliliter verse Krebs-buffer van 37 graden Celsius toe en breng 15 tot 20 microslices over naar een vijf milliliter polystyreenbuis met een platte bodem.
Gebruik een extra brede boringstip met gladde randen om de microslices gelijkmatig over de bodem van de buis te verdelen in een enkele laag, zodat elke microslice niet verder dan een paar millimeter van de zuurstofrijke atmosfeer is. Eenmaal goed gerangschikt, incubeer de microslices in een waterbad van 37 graden Celsius om de microslices goed te bezuurstoff. Laat voortdurend carbogen over de microslice-suspensie passeren met de gaslijnposities net boven het oppervlak om mechanische verstoring van de microslices door direct contact met het gas te voorkomen voor de beste resultaten.
Het is van cruciaal belang dat de microslices correct worden belucht. Het is belangrijk dat de gaslijn op de juiste afstand van het oppervlak van de microsite-suspensie wordt geplaatst. Meerdere lijnen kunnen samengevoegd worden om meerdere stimulaties mogelijk te maken.
Tegelijkertijd kan een verscheidenheid aan stimuli worden gebruikt. In dit voorbeeld ondergaan de microslices AMPA-stimulatie. Behandel de microslices met een cytotoxische stimulus of alleen Krebs-buffer.
Voor een controle op gestimuleerde groep. Verwijder de incubatieoplossing op verschillende tijdstippen na stimulatie en vervang deze met 300 microliter ijskoude homogenisatiebuffer op het gewenste tijdstip. Homogeniseer de microslices na stimulatie op ijs met behulp van een glazen Teflon-down homogenisator en bewaar de homogenen op min 80 graden Celsius tot verdere analyse.
Respiratiesnelheden laten zien dat microslices die uit de voorhersenen van kippen zijn verzameld, tot twee uur na de generatie levensvatbaar zijn. De hoge ATP- en lage ADP-niveaus die in microslices worden gevonden, zijn ook kenmerkend voor levensvatbare cellen. In dit voorbeeld werd het kaliumgehalte van het weefsel gemeten en bleek dit net boven de achtergrond na dissectie te liggen, maar te zijn gestegen na incubatie met Krebs-buffer. De toevoeging van WABE en EGTA zorgde ervoor dat het kaliumgehalte van het weefsel daalde, wat aantoont dat microslices normaal gesproken actief kalium pompen en dat de niveaus niet te wijten zijn aan kalium dat vastzit in dood weefsel of interstitiële ruimtes.
Hier werden microslices gegenereerd uit het striatum en de sensorische cortex van mannelijke ratten en gedepolariseerd met behulp van een hoge kalium-crebs buffer. De snelheid van glue N twee B-fosforylering varieerde tussen de cortex en het striatum, terwijl de snelheid van glue a een-fosforylering vergelijkbaar was tussen de twee gebieden. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een model van hersensnijden dat is ontworpen om de moleculaire mechanismen van excitotoxiciteit-gemedieerde hersenbeschadiging te onderzoeken. De techniek maakt het mogelijk om levensvatig volwassen hersenweefsel te genereren, terwijl het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd en de neuronale circuits behouden blijven.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- In vitro-modellen
Achtergrond
- Excitotoxiciteit is een belangrijke factor bij hersenletsel.
- Bestaande modellen steunen vaak op primaire neuronale culturen.
- Het gebruik van volwassen hersenweefsel biedt een nauwkeurigere weergave van in vivo condities.
- Dit model heeft tot doel het aantal dieren dat in onderzoek wordt gebruikt te verminderen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar in vitro berotemodel te ontwikkelen.
- Om de effecten van cytotoxische stimulatie op hersenmicro-slices te onderzoeken.
- Om cellulaire interacties en postsynaptische compartimenten te behouden.
Gebruikte Methoden
- Bereiding van microslices uit vers geïsoleerd hersenweefsel.
- Equilibratie van microslices onder milde agitatie.
- Toepassing van diverse experimentele manipulaties na equilibratie.
- Beoordeling van de levensvatbaarheid van de slices gedurende ten minste twee uur na bereiding.
Belangrijkste resultaten
- Micro-plakjes blijven gedurende twee uur levensvatbaar voor experimenteel gebruik.
- De techniek behoudt meerdere celtypen binnen de plakjes.
- Resultaten geven aan dat dit model representatiever is voor intact hersenweefsel.
- Demonstreert voordelen ten opzichte van traditionele methoden voor neuronale culturen.
Conclusies
- Het ontwikkelde hersensnijmodel is effectief voor het bestuderen van excitotoxiciteit.
- Deze benadering vermindert het gebruik van dieren terwijl de weefselintegriteit behouden blijft.
- Toekomstig onderzoek kan dit model benutten voor verdere inzichten in de mechanismen van hersenletsel.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het modelleren van excitotoxisch hersenletsel in rijp neuraal weefsel vult een kritisch gat in de translationele neurowetenschappen, waardoor een meer voorspellende evaluatie van moleculaire mechanismen die relevant zijn voor ischemische beroertes mogelijk wordt. Dit platform met hersenmicroslices ondersteunt mechanische risicovermindering en doelwitvalidatie door de cellulaire complexiteit en weefselarchitectuur te behouden, die ontbreken in primaire neuronale culturen. De aanpasbaarheid over verschillende soorten en hersenregio's heen vergroot de relevantie van de portfolio voor vroege ontdekking en preklinisch onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het mogelijk om excitotoxiciteitspaden te onderzoeken in volwassen, multicellularen neurale omgevingen.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door celdood en signalering in intact weefsel te modelleren.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door reacties van volwassen weefsel te onderscheiden van artefacten uit onvolgroeide culturen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor kandidaat-targets die betrokken zijn bij beroertes en neurodegeneratie.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd, reproduceerbaar systeem voor het kwantificeren van functionele uitkomsten, zoals cellevensvatbaarheid en fosforyleringsgebeurtenissen.
- Ondersteunt de standaardisatie van assays door parallelle stimulatie- en controlecondities mogelijk te maken binnen dezelfde weefselcontext.
- Maakt schaalbare aanpassing aan meerdere hersenregio's en soorten mogelijk, waardoor de toepasbaarheid van screening wordt verbreed.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van de effecten van verbindingen op de respons van volgroeid neuraal weefsel.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante mechanismen door excitotoxisch letsel te modelleren in volwassen hersenplakjes.
- Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers door de meting van moleculaire eindpunten na stimulatie.
- Biedt continuïteit van vroege mechanistische studies naar preklinische validatie in complexere systemen.
- Vermindert het translationele risico door de kloof tussen celkweek en in vivo-modellen te overbruggen.
Integratie van pijplijn en workflow
Dit model van hersenmicroslices bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinische validatie, waardoor hypothesetesten en mechanistische studies mogelijk zijn voorafgaand aan in vivo werk.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van pathways en biologische risicoreductie voor targets van excitotoxiciteit en neuroprotectie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten, zoals celviabiliteit en fosforyleringsstatus, voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt vergelijkende analyse mogelijk van moleculaire responsen over verschillende hersengebieden en behandelcondities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming met ziekterelateerde eindpunten en biomarkerstrategieën.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Het aanpasbare protocol ondersteunt toepassing over verschillende programma's en standaardisatie binnen neurowetenschappelijke portfolio's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in neurodegeneratieonderzoek.
- Operationele waarde: Standardiseert weefselpreparatie en stimulatie voor reproduceerbare, schaalbare workflows.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door volwassen weefselgegevens te leveren voorafgaand aan dierstudies.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve en excitotoxiciteits-modulerende kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in hersendissectie, weefselbehandeling en de beoordeling van de levensvatbaarheid van coupes.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde apparatuur voor weefselsnijden, incubatie en oxygenatie.
- Vereist een strikte standaardisatie van stimulatieprotocollen en analytische eindpunten over teams heen.
- Aanpasbaar aan verschillende soorten en hersenregio's, maar kan protocoloptimalisatie vereisen voor elke context.
- Het venster van levensvatbaarheid beperkt de experimentele duur tot ongeveer twee uur na het genereren van de coupes.
