Name: Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T17:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer proteasomale eiwitafbraak analyseren in een celvrij systeem met Nicotiana benthamiana bladeren. Deze methode meet eiwitstabiliteit via western blotting en SDS-PAGE voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De werkzaamheden die leiden tot deze publicatie heeft financiering ontvangen van de Marie Curie COFUND programma &quot;U-Mobility&quot;, medegefinancierd door de Universiteit van Malaga en de Europese Unie 7e kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder GA nummer 246550. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door subsidies van de NIH, USDA / NIFA, NSF, BARD en BSF naar VC

1. Eiwitexpressie <ol><li> Keuze van meningsuiting systeem Systeem selecteren, dat wil zeggen vectoren en vector levering methode, meest geschikt voor expressie van het eiwit van belang in de specifieke modelorganisme / cel. Merk op dat onze test vereist expressie van de geteste eiwitten in gemakkelijk waarneembaar bedragen, die het best bereikt door transiënte transformatie van grote aantallen cellen. In planten, bijvoorbeeld, is het beste bewerkstelligd met behulp van binaire plasmiden als expressievectoren en Agrobacterium als afgiftesysteem. </li><li> Constructie van binaire expressievectoren Kloon de coderende sequentie (s) van het eiwit (ten) van belang in een expressievector alleen of in translationele fusie aan een epitoop tag. Gebruik vectoren geschikt voor het gekozen expressiesysteem en standaard moleculair biologische procedures voor genklonering. Voor Agrobacterium-gemedieerde gentherapie, in dienst binaire vectoren en hen te introduceren, ook met behulp van Standard protocollen in een Agrobacterium-stam, zoals EHA105, voor daaropvolgende inoculatie van plantenweefsels. </li><li> Keuze van plantensoorten Selecteer de plantensoorten waarin het eiwit (s) van belang wordt uitgedrukt. Merk op dat, terwijl alle planten die gevoelig zijn voor Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie worden gebruikt, onze plantensoorten van keus Nicotiana benthamiana die gemakkelijk wordt gekweekt, zeer gevoelig voor Agrobacterium, en heeft grote bladeren die gemakkelijk worden geïnoculeerd. </li><li> Plantengroei Grow een fabriek voor 4 tot 6 weken in een pot met Pro-Mix BX in een pot (20 cm x 20 cm x 20 cm) onder milieuvriendelijke gecontroleerde omstandigheden (bv. groei kamer) van de lange dag (dwz 16 uur van 130 -150 uE m-2 s-1 licht bij 23 ° C en 8 uur donker bij 20 ° C) en 40-65% relatieve vochtigheid. 1.5.2 Bemesten af ​​en toe met de handel verkrijgbare producten per instructies van de fabrikant. Zodra de plant wordt geteeld, selecteertbladeren met de grootte van 50 mm x 70 mm of groter (deze lengte metingen omvatten niet de bladsteel) voor Agrobacterium inenting. </li><li> Inoculatie met Agrobacterium Kweek Agrobacterium stam die de binaire construct tot expressie de geteste eiwit (ten) van stap 1.3 overnacht bij 28 ° C in YEP-medium (1% pepton, 1% gistextract en 0,5% NaCl) aangevuld met geschikte antibiotica (bijvoorbeeld 100 mg / L streptomycine en 10 mg / l rifampicine voor pPZP-RSC2-gebaseerde vectoren 24-25). 1.6.2 Centrifugeer de cellen opnieuw gesuspendeerd tot OD 600 = 0,5 infiltratie buffer [10 mM MgCl2, 10 mM MES (pH 5,6), 100 pM acetosyringoon] en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Infiltreren de cultuur in de abaxiale zijde van een blad, met een 1-ml naaldloze injectiespuit, mee dat de bladeren geïnoculeerd in situ, terwijl wordt aan de plant bevestigd. 1.6.3 Na infiltratie, groeien de plant gedurende 72 uur onder het licht regime van 16 uur 130-150 &amp;# 181, E m-2 s-1 licht bij 23 ° C / 8 uur donker bij 20 ° C voor de oogst. </li><li> Toepassing van proteasomale remmers Om de gedachte dat de geteste eiwit (ten) wordt afgebroken via een proteasoom route ondersteunen gebruiksspecifieke proteasomale remmers MG132 en lactacystin 28-29, die moet verminderen of zelfs blokkeren afbraak. Vier uur voor de oogst (zie Stap 2.1), infiltreren de-Agrobacterium geënt blad gebieden met 10 uM MG132 (EMD Millipore) of 10 uM lactacystin (Sigma-Aldrich) of modellen behandelen het blad met de respectieve oplosmiddelen, dwz 0,1% DMSO of gedestilleerd water. </li></ol> 2. Bereiding van celvrije extracten <ol><li> Blad oogsten Oogst de geënte delen van het blad, meestal ca.. 200-400 mg vers gewicht, en stamp ze fijn tot fijn poeder in vloeibare stikstof. Als alternatief, kraal-winnen van de weefsels, met behulp van een kraal-beater (bijv. Biospec) of een tandheelkundige amalgamator (bijv. TPC Geavanceerde<html> Technologies) direct bij de afbraak-buffer (zie Stap 2.2). </li><li> Eiwitextractie Bereid totaal eiwit extract door het plaatsen van de grond weefsel in 500 ui afbraak buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenosine 5&#39;-trifosfaat en 1x proteaseremmer Cocktail (Sigma-Aldrich)]. Merk op dat de proteaseremmer cocktail voornamelijk invloed serine, cysteïne, asparaginezuur en metalloproteasen en niet interfereert met de 26S protease. Verduidelijken het extract door twee opeenvolgende centrifugeren bij 12.000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Eiwitafbraak reactie Overdracht gelijke volumes extracten, meestal 20 pl, microfuge buizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende toenemende perioden. Typisch, sample tijd nul, en 5, 10, 15, 20, en 30 minuten tijdstippen. Stop reacties door koken in SDS-gel-sample buffer, en ze te analyseren met western blotting. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 3. Opsporen afbraak van eiwitten door immunoblotting <ol><li> Gel elektroforese 3.1.1 Los het eiwitmonsters door SDS-polyacrylamidegel elektroforese en elektro-de opgeloste eiwitten op een nitrocellulose membraan volgens het standaardprotocol 30. 3.1.2 Bepaal eiwitconcentratie volgens de Bradford methode (Bio-Rad), en laadt 50-80 ug totaal eiwit per laan. Zorg ervoor dat alle monsters gelijk worden geladen. Voor het laden controles vergelijken intensiteiten van een alomtegenwoordige eiwit species, zoals vermeende RuBisCo grote ketens die migreren als een hoofdband met een relatieve elektroforetische mobiliteit van ongeveer 50 kDa, kunnen ze worden gedetecteerd op met Coomassie-blauw gekleurde gelen of Ponceau S-of fluorescerende SYPRO Ruby-gekleurd nitrocellulosemembranen. </li><li> Blokkeren Blokkeer het membraan met 5% magere melk in TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li&gt; <li> Primaire antilichaam Verdun primaire anti-epitoop-antilichaam in 1% afgeroomde melk in TBST bij de concentratie door de fabrikant en incubeer de geblokkeerde membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C onder zacht schudden. </li><li> Spoelen Spoel het membraan gespoeld in 20 ml TBST gedurende 15 min eenmaal en tweemaal gedurende 5 min bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Secundair antilichaam Verdun secundair antilichaam (bijvoorbeeld anti-konijn IgG) geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HRP) in 1% afgeroomde melk in TBST zoals aanbevolen door de fabrikant en incubeer met het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zacht schudden. </li><li> Opsporing Spoel het membraan weer zoals beschreven in stap 3.4. Na de laatste spoeling in TBST, visualiseer de eiwitten van belang met een HRP chemiluminescentiesubstraat, meestal met behulp van een ECL-kit. </li></ol>

<ol><li>Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+control+in+ubiquitin-dependent+proteolysis%3A+don%E2%80%99t+Skp+the+F-box+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis.</a> Trends Genet. 14, 236-243 (1998).</li>
<li>Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+and+cullin%2Fring+H2-based+ubiquitin+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases.</a> Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).</li>
<li>Callis, J., Vierstra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+in+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein degradation in signaling.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).</li>
<li>Hellmann, H., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+development%3A+regulation+by+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant development: regulation by protein degradation.</a> Science. 297, 793-797 (2002).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Dharmasiri, S., Estelle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+regulated+protein+degradation+in+auxin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of regulated protein degradation in auxin response.</a> Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).</li>
<li>Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ubiquitination+in+the+regulation+of+plant+defence+against+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).</li>
<li>Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+ubiquitin-26S-proteasome+pathway+in+gibberellin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling.</a> Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).</li>
<li>Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+26S+proteasome+system+in+the+signaling+pathways+of+TGF-beta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily.</a> Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).</li>
<li>Pagano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+DNA+synthesis+and+mitosis+by+the+Skp2-+p27-Cdk1%2F2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis.</a> Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+of+the+host+SCF+ubiquitin+ligase+machinery+by+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens.</a> Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).</li>
<li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+the+biology+behind+the+%26%2334%3Bgene-jockeying%26%2334%3B+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the &#34;gene-jockeying&#34; tool.</a> Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).</li>
<li>Lacroix, B., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+bacterial+and+host+plant+factors+in+Agrobacterium-mediated+genetic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation.</a> Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).</li>
<li>Schrammeijer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+virulence+protein+VirF+of+Agrobacterium+tumefaciens+with+plant+homologs+of+the+yeast+Skp1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein.</a> Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).</li>
<li>Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+induces+expression+of+a+plant+host+F-box+protein+required+for+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity.</a> Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).</li>
<li>Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+targeted+proteolysis+in+plant+genetic+transformation+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium.</a> Nature. 431, 87-92 (2004).</li>
<li>Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+of+synthetic+Agrobacterium+T-DNA-protein+complexes+via+the+host+SCFVBF+ubiquitin-ligase+complex+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).</li>
<li>Zhou, P., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+degradation+of+the+substrate+recognition+subunits+of+SCF+ubiquitin-protein+ligases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases.</a> Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).</li>
<li>Galan, J. M., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-dependent+degradation+of+multiple+F-box+proteins+by+an+autocatalytic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).</li>
<li>Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tome-1%2C+a+trigger+of+mitotic+entry%2C+is+degraded+during+G1+via+the+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC.</a> Cell. 113, 101-113 (2003).</li>
<li>Guardavaccaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+meiotic+and+mitotic+progression+by+the+F+box+protein+b-Trcp1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo.</a> Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).</li>
<li>Magori, S., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+counteracts+host-induced+degradation+of+its+F-box+protein+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector.</a> Sci. Signal. 4, (2011).</li>
<li>Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prophase+destruction+of+Emi1+by+the+SCFbTrCP%2FSlimb+ubiquitin+ligase+activates+the+anaphase+promoting+complex+to+allow+progression+beyond+prometaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase.</a> Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).</li>
<li>Tzfira, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pSAT+vectors%3A+a+modular+series+of+plasmids+for+fluorescent+protein+tagging+and+expression+of+multiple+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants.</a> Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).</li>
<li>Goderis, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+modular+plant+transformation+vectors+allowing+flexible+insertion+of+up+to+six+expression+units%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units.</a> Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).</li>
<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-DNA+binary+vectors+and+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).</li>
<li>Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Delivery of multiple transgenes to plant cells.</a> Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+Arabidopsis+26+S+proteasome%3A+biochemical+and+molecular+analyses+revealed+the+presence+of+multiple+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms.</a> J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).</li>
<li>Fenteany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasome+activities+and+subunit-specific+amino-terminal+threonine+modification+by+lactacystin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin.</a> Science. 268, 726-731 (1995).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).</li>
<li>Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from:
 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij">imagej.nih.gov/ij</a> (1997).</li>
<li>Kim, J. H., Kim, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+RING+E3+ubiquitin+ligase+AtAIRP3%2FLOG2+participates+in+positive+regulation+of+high+salt+and+drought+stress+responses%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses).</a> Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Deze test berust op de expressie van de geteste eiwitten in plantenweefsels, dus de potentiële proteasomale afbraakproces uiteraard het reeds in het levende weefsel. We assay eiwit destabilisatie echter alleen in de extracten met tijdstip nul monster die als eerste referentiepunt. Daarom definiëren we als een celvrij assay. Éen belangrijk aspect van het succes van deze test is de juiste keuze van de expressievector waarvan de geteste eiwitten (s) geproduceerd. Behoudens specifieke antilicham...

De ubiquitin/26S proteasoomroute is in opkomst als een wijdverbreid mechanisme voor de controle van diverse biologische reacties, waaronder transcriptionele regulatie, cel-cyclus progressie en signaaltransductie, receptor down-regulering of endocytose, onder andere verwerkt 1-4. In deze route, is het doelwit eiwit gelabeld door ubiquitine residuen die het eerst worden aangesloten via een thiolester binding met ubiquitine-activerend enzym E1 en vervolgens translocatie naar een cysteïne aminozuur residu van ubiquitine-conjugatie enzym E2, eindelijk, E2 interageert met ubiquitinligase E3 , waardoor polyubiquitinatie van het eiwit substraat. Uiteindelijk worden de polyubiquitinated eiwitten herkend en afgebroken door het 26S proteasoom. In dit mechanisme, de E3 enzym specificeert de ondergrond en fungeert als de belangrijkste regelgevende component van de ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS). E3 ligasen onafhankelijk optreden, zoals RING domein ligasen, of als onderdeel van een multisubunit SCF (Skp1/Cullin/F-box proteïne)-complex, zoals F-box domein ligases. SCF-gemedieerde proteasomale afbraakroutes zijn betrokken bij de regulatie van transcriptie, celcyclus, signaaltransductie 5-10 en vele andere belangrijke cellulaire functies. Naast deze kritische rol bij de regulatie van cellulaire processen, UPS duurt het centrale podium in veel plant-pathogeen interacties. Bijvoorbeeld meer gegevens suggereren dat verschillende planten pathogenen, waaronder Agrobacterium tumefaciens, vertrouwen op de host UPS voor om de infectie proces 11 te vergemakkelijken. Agrobacterium lokt neoplastische groei op planten, zijn natuurlijke gastheren te vertegenwoordigen, en het kan ook veranderen diverse andere eukaryoten, van schimmels 1,2 tot menselijke cellen 12,13. Tijdens de infectie, Agrobacterium exporteert een DNA-element (T-DNA) en verscheidene virulentie (Vir) proteïnen in de gastheercel 12-13. Een van deze eiwitten is VirF, de eerste F-box eiwit gevondenwordt gecodeerd door een prokaryote genoom 14. Als onderdeel van de SCF ubiquitine ligase complex VirF De praktisch gastheer homoloog VBF 15 vergemakkelijken Agrobacterium infectie via de UPS-gemedieerde eiwitafbraak, die vermoedelijk vergemakkelijkt uncoating van de binnenvallende bacterieel T-DNA van de bijbehorende bacteriële en gastheereiwitten, VirE2 en VIP1, respectievelijk 16,17. Interessant is dat veel F-box eiwitten, waaronder VirF, intrinsiek onstabiel vanwege hun proteolyse, wat gemedieerd door autoubiquitination activiteit 18,19 of andere E3 ligasen waarvoor F-box eiwitten als substraten 20-23 dienen. Bij het bestuderen van biochemische activiteiten van F-box eiwitten, met ubiquitine ligasen en / of hun substraten, zou het zeer nuttig zijn om een ​​eenvoudige en betrouwbare test voor proteasomale degradatie gebruiken. Hier beschrijven we een dergelijk protocol voor de analyse proteïne stabiliteit in een cel-Vrij systeem. In deze bepaling wordt de stabiliteit van de UPS substraat geanalyseerd in de aanwezigheid of afwezigheid van een van de essentiële componenten van de proteasomale afbraak route, zoals een F-box eiwit in een celvrij systeem. Over het algemeen spreken wij de geteste eiwit (s) in plantaardige weefsels, bereiden cel-vrije extracten uit deze weefsels en toezien op de hoeveelheden van het eiwit (s) van belang door western blotting. De UPS-afhankelijk mechanisme van eiwitdegradatie wordt aangetoond door opname van specifieke proteasomale remmers en / of met co-expressie van dominant-negatieve vorm van SCF component, Cullin. Terwijl wij illustreren deze assay gebruikt proteasomale afbraak van de Arabidopsis VIP1 17 eiwit door de F-box eiwit VBF 15 kan worden toegepast om de stabiliteit van andere proteasomale substraten te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Protein assay kit</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase inhibitor cocktail&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean systeem</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Semi-dry western blotting SD elektroforesesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Affiniteit Gezuiverde Konijn Anti-Ha</td><td>ICL Lab</td><td>RHGT-45A-Z</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-Konijn IgG Peroxidase Conjugaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace, NT nitrocellulose transfer membraan</td><td>Pall Corporation</td><td>27377-000</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon western chemiluminescent HRP substraat</td><td>EMD Millipore</td><td>WBKL S0 050</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>EMD Millipore</td><td>474790-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substraat</td><td>Pierce</td><td>35055</td><td></td></tr></tbody></table>

het testen van proteasomale afbraak in een celvrije system in plants

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

De ubiquitine-proteasoom route voor eiwitafbraak voren gekomen als een van de belangrijkste mechanismen voor het regelen van een breed scala van cellulaire functies in bijna alle eukaryote organismen. Specifiek, in planten, het ubiquitin/26S proteasoom systeem (UPS) regelt eiwitafbraak en draagt ​​aanzienlijk bij tot de ontwikkeling van een groot aantal processen, waaronder immuunrespons, ontwikkeling en geprogrammeerde celdood. Bovendien, en meer gegevens suggereren dat een groot aantal planten ziekteverwekkers, zoals Agrobacterium, exploiteren de host-UPS voor efficiënte infectie, met nadruk op het belang van UPS in plant-pathogeen interacties. De substraatspecificiteit van UPS wordt bereikt door E3 ubiquitin ligase dat werkt in samenhang met de E1 en E2 ligasen herkennen en markeren specifieke eiwitmoleculen voor afbraak bestemde met daaraan verbonden ketens van ubiquitine moleculen. Een klasse van de E3 ligasen is het SCF (SKP1 / CUllin / F-box eiwit)-complex, dat specifiek de UPS substraten en richt ze voor ubiquitination via de F-box eiwit component. Om een ​​mogelijke rol van UPS in een biologisch proces plaats te onderzoeken, is het belangrijk om een ​​eenvoudige en betrouwbare test voor UPS-gemedieerde eiwitafbraak bedenken. We beschrijven hier een dergelijke test met behulp van een plant-cel-vrij systeem. Deze test kan worden aangepast voor studies van de rol van gereguleerde eiwitafbraak bij diverse cellulaire processen, met een speciale focus op de F-box eiwit-substraat interacties.

Figuur 1, aangepast van Zaltsman et al.. 17, illustreert representatieve experimenten voor de detectie van proteasomale afbraak in een cel-vrij systeem. Specifiek, tonen we destabilisatie van een plant defensiegerelateerde eiwit VIP1 door de VBF F-box eiwit via de SCF VBF pathway in N. benthamiana. Arabidopsis VBF en HA-gelabeld VIP1 (HA-VIP1) eiwitten werden tijdelijk coexpressed, en HA-VIP1 eiwitgehalte in extracten van het uiten van bladeren werd geana...

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire &quot;labels&quot; voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de eiwitstabiliteit in een celvrij systeem te analyseren. Dit wordt bereikt door de inoculatie van Oceana Biana met verschillende agrobacteriumstrains die een binair construct bevatten met het eiwit van belang.Vervolgens wordt het totale eiwit uit de plantenbladeren geëxtraheerd. De bladeren worden overgebracht naar microcentrifugebuisjes en geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende toenemende tijdsintervallen. Daarna worden de eiwitmonsters gescheiden via SDS-acrylamidegelelektroforese en elektrisch overgebracht op een nitrocellulosemembraan.Om het eiwit van belang aan te tonen met behulp van een specifiek antilichaam, worden resultaten verkregen die de eiwitstabiliteit aantonen in de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke proteasoomremmer op basis van western blot-analyse. Wij beschrijven hier een eenvoudige methodologie om de stabiliteit van het INE proteasoomcystesubstraat te bestuderen in de aanwezigheid of afwezigheid van een van de essentiële componenten van de proteasomale degradatieroute in een celvrij systeem. Deze methoden kunnen zo inzicht bieden in een veiligere proteasomale degradatie.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals studies naar de rollen van gereguleerde proteïneafbraak in diverse cellulaire processen. In deze demonstratie wordt NCOA hamana gebruikt. De plant is gemakkelijk te kweken, zeer gevoelig voor agrobacterium en heeft grote bladeren die eenvoudig te inoculeren zijn.Kweek één plant gedurende vier tot zes weken in een pot met promix B onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden van lange dagen en een relatieve vochtigheid van 40 tot 65%. Bemest de plant af en toe met commercieel verkrijgbare producten volgens de instructies van de fabrikant. Zodra de plant is volgroeid, selecteert u bladeren met een afmeting van 50 millimeter bij 70 millimeter of groter.Kweek voor de agrobacterium-inoculatie de Agrobacterium-stam die het binaire construct bevat en het geteste eiwit tot expressie brengt, gedurende één nacht bij 28 °C in YEP-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Resuspendeer de cellen na centrifugatie in infiltratiebuffer tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van 0,5 en incubeer dit gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Infiltreer de cultuur in de AAL-zijde van een blad met behulp van een naaldloze spuit van 1 ml. Laat de plant na infiltratie 72 uur groeien onder hetzelfde lichtregime. Infiltreer de met agrobacterium geïnoculeerde bladgebieden vier uur voor de oogst met 10 µM inhibitor of een mock-controle.Behandel het blad met de betreffende oplosmiddelen, oogst de geïnoculeerde gebieden van het blad, gewoonlijk 200 tot 400 mg vers gewicht, en maal deze in vloeibare stikstof tot een fijn poeder. Bereid vervolgens het totale eiwitextract door het gemalen weefsel te plaatsen in 500 µL degradatiebuffer. Clarificeer het extract door twee opeenvolgende centrifugaties bij 12 000 ×g gedurende vijf minuten om de eiwitdegradatiereactie uit te voeren.Breng gelijke volumes extracten, gewoonlijk 20 µL, over naar microcentrifugebuisjes en incubeer deze bij kamertemperatuur gedurende toenemende tijdsintervallen. Typisch worden tijdstip nul en tijdstippen van 5, 10, 15, 20 en 30 minuten gebruikt. Stop de reacties door een SDS-gel monsterbuffer te koken voordat deze worden geanalyseerd via western blotting.Scheid de eiwitmonsters via SDS-polyacrylamidegelelektroforese door eerst de eiwitconcentratie te bepalen met de Bradford-methode en 50 tot 80 microgram totaal eiwit per lane te laden. Zorg ervoor dat alle monsters gelijkmatig worden geladen voor de ladingscontroles. Vergelijk de intensiteiten van overal aanwezige eiwitsoorten, zoals vermoedelijke RubisCO-grote ketens, die migreren als een prominente band met een relatieve elektroforetische mobiliteit van rond de 50 kilodalton.Na de elektrotransfer van de gescheiden eiwitten naar een nitrocellulosemembraan volgens standaardprotocollen, wordt het membraan één uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk in TBST. Verdun vervolgens het primaire anti-epitoop antilichaam in 1% magere melk in TBST tot de door de fabrikant aanbevolen concentratie. Incubeer het antilichaam met het geblokkeerde membraan gedurende één uur bij kamertemperatuur of overnacht bij vier graden Celsius onder zachte agitatie.Spoel het membraan vervolgens één keer gedurende 15 minuten in 20 milliliters TBST en daarna twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Verdun daarna het secundaire antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase in 1% Skim milk in TBST volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Incubeer het secundaire antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie op het membraan na nogmaals spoelen in TBST; visualiseer de eiwitten van belang met mierikswortelperoxidase, waarbij representatieve experimenten de destabilisatie van een plantverdedigingsgerelateerd eiwit tonen.De afbraak van Veep one door het VBFF-boxeiwit via het SCF-pad wordt aangetoond in N hamana. Western blot-analyse toonde aan dat de hoeveelheden Veep one aanzienlijk waren verminderd bij co-expressie met VBF, maar relatief stabiel bleven bij afwezigheid van VBF-co-expressie. Het proteasomale degradatiemechanisme van de destabilisatie van Veep one door VBF werd afgeleid uit de inhibitie hiervan door de proteasoomremmer MG 1 32.Kwantificatie van deze resultaten toonde een bijna volledige inhibitie van V one aan door VBF, wat vrijwel volledig werd geblokkeerd door MG 1 32. De iets hogere niveaus van V one in aanwezigheid van MG 1 32 worden zeer waarschijnlijk verklaard door inhibitie van de activiteit van de endogene VBF-homoloog. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de proteïnedegradatie via de beginnende proteasoomroute bestudeerd kan worden.Hetzelfde experimentele ontwerp kan worden toegepast op andere organismen en kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de rollen van gereguleerde proteïnedegradatie in diverse cellulaire processen.

assaying-proteasomal-degradation-in-a-cell-free-system-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen te volgen beschreven. Een degron-gedestabiliseerd GFP-(GFP-dgn) en een stabiele GFP-fusie-eiwit dgnFS gegenereerd en wordt getransduceerd in de cel met een lentivirale vector expressie. Deze techniek maakt het mogelijk om een ​​stabiel GFP-dgn/GFP-dgnFS expressie cellijn waarin ubiquitine-proteasoom activiteit gemakkelijk worden bepaald onder toepassing epifluorescentie of flowcytometrie.

Monitoring van ubiquitine-proteasoom activiteit in levende cellen door een Degron (dgn)-gedestabiliseerd Green Fluorescent Protein (GFP)-gebaseerde Reporter Protein

In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering en karakterisering van plantaardig eiwit complexen. We zien dat door immunoprecipitatie een eiwit in een complex, zodat we kunnen zijn post-translationele modificaties en zijn interactie partners identificeren.

Identificatie van post-translationele modificaties van Plant eiwitcomplexen

Hier beschrijven we een robuuste biologische test voor het kwantificeren van de relatieve snelheid van proteolyse door het ubiquitine-proteasoomsysteem. De uitlezing van de test is de groeisnelheid van gist in vloeibare cultuur, die afhankelijk is van de cellulaire niveaus van een reportereiwit dat een afbraaksignaal bevat dat is gefuseerd met een essentiële metabole marker.

-Reporter gebaseerd Growth Assay voor systematische analyse van eiwitafbraak

Dit artikel beschrijft een op groei gebaseerde gisttest voor de bepaling van genetische vereisten voor eiwitafbraak. Het demonstreert ook een methode voor snelle extractie van gisteiwitten, geschikt voor western blotting om biochemisch de afbraakvereisten te bevestigen. Deze technieken kunnen worden aangepast om de afbraak van een verscheidenheid aan eiwitten te monitoren.

-Groei op basis Vaststelling en Biochemische Bevestiging van Genetische Eisen voor de afbraak van eiwitten in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit rapport beschrijft protocollen voor het meten van degradatiesnelheden van verkeerd gevouwen eiwitten door middel van western blot of fluorescentie-gebaseerde assays. De methoden kunnen worden toegepast op de analyse van andere verkeerd gevouwen eiwitten en voor high-throughput screening.

Assays voor de afbraak van Misfolded Eiwitten in Cellen

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Hier wordt een fosfaatprotemische benadering gepresenteerd, namelijk stop and go extractietip op basis van phosfoproteom, die een hoge doorvoer en diepe dekking van Arabidopsis phosphoproteome biedt. Deze aanpak definieert het overzicht van osmotische stresssignalering in Arabidopsis.

Fosfaatprotemische strategie voor profilering osmotische stresssignalering in Arabidopsis

Dit protocol beschrijft de workflow voor metabole etikettering van senescente en niet-delende cellen met gepulste SILAC, ongerichte massaspectrometrie-analyse en een gestroomlijnde berekening van eiwithalfwaardetijden.

Meting van eiwitomloopsnelheden in senescente en niet-delende gekweekte cellen met metabole etikettering en massaspectrometrie

Leer proteasomale eiwitafbraak analyseren in een celvrij systeem met Nicotiana benthamiana bladeren. Deze methode meet eiwitstabiliteit via western blotting en SDS-PAGE voor celbiologisch onderzoek.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

Meer video's verkennen