Expressie, isolatie en zuivering van oplosbare en onoplosbare Biotinylated Eiwitten voor Nerve Tissue Regeneration
22 januari 2014
Ontwikkelen biotinylatable fusie-eiwitten heeft veel potentiële toepassingen in diverse gebieden van onderzoek. Recombinant eiwit-engineering is een rechttoe rechtaan procedure die is kosteneffectief, het verstrekken van hoge opbrengsten van op maat gemaakte eiwitten.
Het algemene doel van deze procedure is om succesvol recombinante gebiotineerde eiwitten te ontwerpen, tot expressie te brengen en te isoleren die kunnen worden opgenomen in een verscheidenheid aan toepassingen zoals sondes, sensoren, medicijnafgifte en weefselengineering. Dit wordt bereikt door eerst het op maat ontworpen plasmide te transformeren in een bacteriële gastheercellijn met behulp van kleinschalige culturen, en vervolgens de expressie van het doeleiwit te induceren. Vervolgens wordt de aanwezigheid en oplosbaarheid van het doeleiwit bepaald om geschikte zuiveringsprocedures te formuleren.
Vervolgens wordt de procedure opgeschaald om grotere opbrengsten van het doeleiwit te produceren, die vervolgens worden geïsoleerd met behulp van affiniteitschromatografietechnieken. Ten slotte worden de eiwitten gezuiverd en vervolgens geconcentreerd voor downstream-toepassingen en -analyses. Uiteindelijk bevestigen SDS-pagina en FPLC-resultaten dat recombinante eiwitten succesvol zijn geïsoleerd en gezuiverd en worden de eiwitten verder getest op functionaliteit.
Het belangrijkste voordeel van recombinante eiwitontwerp is dat het ons in staat stelt om grootschalige of milligram-schalige hoeveelheden op maat ontworpen eiwitten te maken om aan onze exacte wetenschappelijke specificaties te voldoen. Bijvoorbeeld, we kunnen nieuwe functionaliteiten toevoegen aan delen van deze eiwitten om nieuwe eigenschappen mogelijk te maken. We laten u vandaag zien hoe u de uiteinden van specifieke eiwitten kunt biotinen, en we gebruiken dit om deze eiwitten specifiek te immobiliseren of te verankeren op oppervlakken om cellulaire functies zoals neuronale uitgroei of neuronale differentiatie te begeleiden.
Personen die nieuw zijn met deze techniek, zouden niet veel moeite moeten hebben bij het volgen van de procedures voor zowel native als niet-native eiwitsisolatie. Veel stappen zijn hetzelfde, maar vereisen specifieke buffers die zijn geformuleerd voor native of niet-native omstandigheden. Zorgvuldige aandacht voor details tijdens het begin.
Transformatie- en testexpressiefasen zorgen voor een hoge eiwitopbrengst tijdens het latere uiteindelijke opschaalproces. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat het laat zien hoe recombinante eiwitten kunnen worden gemaakt met behulp van eenvoudige laboratoriumapparatuur en benodigdheden. Door gebruik te maken van de eenvoudige batchreactie, worden e-gelijk en groeimedia grootgebracht in leiderschaal, waarbij 10 milligram eiwit per hoofdcultuur wordt geproduceerd.
Bovendien kunnen chromatografietechnieken worden gebruikt en gedemonstreerd om te laten zien hoe eiwitten verder worden gezuiverd voor downstream-toepassingen. Vandaag zal Alicia, afgestudeerde Cinema Lab, de procedure demonstreren. Na het klonen en testen op expressie van het doeleiwit van belang en het kweken van een 20 milliliter cultuur gedurende de nacht. Volgens het tekstprotocol, giet de nachtelijke cultuur in 1,8 liter steriele groeimedium met ampicilline en gebruik een pasterpijpje om zes tot acht druppels steriele anti-schuim 2 0 4 plaats culturen in een waterbad van 37 graden Celsius door een 0,2 micronfilter, laat perslucht door de culturen inbellemen door middel van beluchtingsstenen. Wanneer de cultuur een OD 600 van 0,7 tot 0,8 bereikt bij één millimolair IPTG en induceert deze gedurende vier uur bij 37 graden Celsius of overnacht bij 18 graden Celsius, afhankelijk van of het eiwit werd gevonden in de oplosbare of onoplosbare fractie in de testexpressie.
Experimenten om de cellen te verzamelen, breng de cultuur over in één liter centrifugeerbuizen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 maal zwaartekracht en vier graden Celsius. Giet de supernatant af en gebruik een dunne spatel om de bacteriële pellet in twee 50 milliliterbuizen te scheppen. Pellet de cellen opnieuw door centrifugatie gedurende enkele minuten voordat de pellets worden bewaard bij min 80 graden Celsius.
Om niet-native eiwitisolatie uit te voeren voor een onoplosbaar eiwit naar elke bevroren e coli-pellet. Voeg 20 milliliter lysis, wasbuffer toe en vortex en schud om op te schorsen om eventuele grote stukken te elimineren.
Na incubatie op een mutator gedurende de nacht, zal de oplossing eruitzien als een viskeuze slurry centrifuge. De slurry bij 20.500 maal zwaartekracht en kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Breng de supernatant over naar een verse buis en gooi de pellet weg voor native eiwitisolatie.
Resuspendeer de pellets in lysisbuffer tot een eindvolume van 30 milliliter met de opgeschorte pellet op ijs. Stel de sonicate in op een amplitude van 30% met een puls van 30 seconden aan en 30 seconden uit, en soniceer gedurende vijf minuten. Laat de buis tijdens het soniceren op en neer bobbelen om de celpellet volledig te breken.
Centrifugeer de slurry bij 20.500 maal zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Breng vervolgens de supernatant over naar een verse buis en gooi de pellet weg. Om affiniteitschromatografie uit te voeren op een niet-natief geïsoleerd eiwit, voegt u één milliliter nikkel NTA-harsoplossing toe aan elke centrifugeerbuis en incubeert u deze op een mutator of schudder bij kamertemperatuur gedurende minimaal één uur.
Giet de slurry in een affiniteitskolom en laat de oplossing volledig druppelen door de stopcockklep in een afvalbeker. Voeg 10 milliliter wasbuffer toe aan de centrifugeerbuis om resterende hars te verwijderen en voeg de oplossing toe aan de kolom nadat de oplossing is gedropt. Gebruik een glazen roerstaaf om de hars te roeren en laat deze volledig druppelen voordat u nog een wasbeurt toevoegt.
Gebruik vervolgens 10 milliliter wasbuffer om de wasbeurt van de centrifugeerbuis te herhalen en breng deze over naar de kolom. Voer vervolgens acht meer wasbeurten uit van de kolom met 10 milliliter lysiswasbuffer voor elke wasbeurt. Nadat de wasbeurten voltooid zijn, sluit u de stopcock en vervangt u de afvalbeker door de 50 milliliter centrifugeerbuis.
Voeg 15 milliliter eluciabuffer toe aan de kolom, roer de hars en laat de oplossing gedurende vijf minuten staan. Open vervolgens de stopcock en verzamel de EIT voordat u herhaalt met
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel bespreekt het ontwerp, de expressie en de isolatie van recombinante gebiotineleerde eiwitten voor diverse toepassingen. Het proces omvat het transformeren van plasmiden in bacteriële cellen, het induceren van eiwitexpressie en het zuiveren van de eiwitten met behulp van affiniteitschromatografie.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Biotechnologie
- Proteïne-engineering
- Biochemie
Achtergrond
- Recombinante eiwitengineering is een kosteneffectieve methode.
- Er kunnen hoge opbrengsten van op maat ontworpen eiwitten worden behaald.
- Biotinyleerbare fusie-eiwitten hebben diverse toepassingen.
- Toepassingen omvatten probes, sensoren, geneesmiddelentoediening en tissue engineering.
Doel van de studie
- Om recombinante gebiotinyleerde eiwitten te ontwerpen en te tot expressie te brengen.
- Om eiwitten te isoleren voor downstream toepassingen.
- Om de functionaliteit van de gezuiverde eiwitten te verifiëren.
Gebruikte methoden
- Transformatie van plasmiden in bacteriële gastheercellen.
- Inductie van de expressie van het doeleiwit.
- Bepaling van de aanwezigheid en oplosbaarheid van het eiwit.
- Zuivering met behulp van affiniteitschromatografietechnieken.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en zuivering van recombinante eiwitten.
- Verificatie van de eiwitfunctionaliteit via SDS-PAGE en FPLC.
- Productie van grotere opbrengsten voor diverse toepassingen.
- Vaststellen van passende zuiveringsprocedures op basis van oplosbaarheid.
Conclusies
- Recombinante gebiotinyleerde eiwitten kunnen effectief worden geproduceerd.
- De methodologie is toepasbaar op een reeks wetenschappelijke vakgebieden.
- Verdere testen zijn essentieel voor functionele toepassingen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
De productie van recombinant gebiotineerd eiwit maakt de schaalbare generatie van op maat ontworpen biologische middelen mogelijk voor toepassingen bij de regeneratie van zenuwweefsel. Deze aanpak ondersteunt doelwitvalidatie en het verminderen van mechanische risico's door gedefinieerde moleculaire instrumenten te bieden om neuronale uitgroei- en differentiatiepaden te onderzoeken. De methode biedt voorspellende zekerheid in preklinische modelsystemen via reproduceerbare, affiniteitsgezuiverde eiwit-inputs voor de functionalisering van biomaterialen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek mogelijk naar de functionele domeinen van nerve growth factor (NGF) en semaphorine 3A (Sema3A) bij de modulatie van neuronale pathways.
- Operationele waarde: Biedt de mogelijkheid voor biotinylering-streptavidine-koppeling voor geïmmobiliseerde proteïne-assays op biomateriaaloppervlakken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de functionele validatie van targets via celgebaseerde assays die neurietuitgroei en differentiatie meten.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde gebiotineerde eiwitprobes voor kwantitatieve detectie in streptavidine-gebaseerde capturesystemen.
- Operationele waarde: Levert affiniteitsgezuiverde eiwitten die geschikt zijn voor ELISA, SPR of microfluïdische screeningsplatforms die geïmmobiliseerde liganden vereisen.
- Schaalbaarheid: Expressie op milligramschaal in E. coli maakt de productie van assay-reagentia mogelijk voor screeningscampagnes met een gemiddelde tot hoge doorvoersnelheid.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelateerde systeemmodellering door de presentatie van neurotrofe en leidingsignalen op synthetische steigers mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Faciliteert consistente eiwitimmobilisatie over verschillende batches biomateriaalproductie voor studies naar regeneratieve geneeskunde.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen targetvalidatie in de ontdekkingsfase en preklinische efficiëntietests door middel van gedefinieerde formats voor eiwitpresentatie.
Integratie van pipeline en workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door gevalideerde eiwitreagentia te leveren voor target-engagementstudies, gevolgd door assay-ontwikkeling voor lead-identificatie, en door preklinische validatie mogelijk te maken via eiwitpresentatie geconjugeerd aan biomateriaal.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van neurotrofe en guidance cue-mechanismen via oplosbare en geïmmobiliseerde eiwitformaten.
- Screening: Maakt assays mogelijk door gebruik van affiniteitsgezuiverde, gebiotineerde eiwitten die compatibel zijn met streptavidine-gecoate oppervlakken voor bindings- en functionele readouts.
- Analytics: Biedt kwantificeerbare resultaten via SDS-PAGE en FPLC voor zuiverheidsbeoordeling en opbrengstbepaling voorafgaand aan functionele testen.
- Translationeel onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door eiwitverankering aan biomaterialen mogelijk te maken voor assays voor neuronale uitgroei en differentiatie.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor eiwitproductie voor meerdere neurogene targets naast NGF en Sema3A.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in het doelmechanisme door gedefinieerde eiwitpresentatie; vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar neuronale pathways.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via affiniteitszuivering; schaalbaarheid naar milligramopbrengsten in bacteriële expressiesystemen.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go beslissingen bij doelvalidatie; kapitaalefficiëntie door herbruikbare eiwitproductie; verminderd biologisch risico in programma's voor regeneratieve geneeskunde.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van neurogene targets op basis van functionele eiwitactiviteit in assays voor axonale groei en geleiding.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, bacteriële expressie en eiwitzuiveringstechnieken.
- Afhankelijk van infrastructuur voor affiniteitschromatografie (Ni-NTA harsen, FPLC-systemen) en analytische apparatuur (SDS-PAGE, spectrofotometers).
- Necessiteert cross-team standaardisatie van bufferformuleringen en inductiecondities voor de isolatie van oplosbare versus onoplosbare eiwitten.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen aan verschillende oplosbaarheidsprofielen van eiwitten, zoals gedemonstreerd door de zuiveringspaden van NGF (oplosbaar) versus Sema3A (onoplosbaar).
- Praktische beperking: De initiële transformatie- en testexpressiefasen vereisen uitgebreide tijdlijnen om de eiwitoplosbaarheid te bepalen vóór opschaling.
