Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van beeldvorming en analyse van de mitose van neurale progenitorcellen in levende plakjes muizenbrein. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit embryo's te dissekeren. De tweede stap is het maken van hersenplakjes met een vibratoom.

Vervolgens wordt de live-imaging van hersensecties uitgevoerd. De laatste stap is het extraheren van informatie uit de video's om de relevante mitoseparameters te analyseren. Uiteindelijk wordt time-lapse microscopie gebruikt om te laten zien hoe progenitorpopulaties van de hersenen in realtime delen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals analyse van gefixeerd weefsel, is dat men aanzienlijk inzicht kan verkrijgen in de temporele dynamiek van de deling van neurale progenitorcellen in levende hersensnijden. Het kan ook worden gebruikt om te begrijpen hoe genetische perturbaties de deling van neurale progenitorcellen kunnen beïnvloeden. Hoewel we deze methode gebruiken om de corticale ontwikkeling te begrijpen, kan de beschreven analyse worden toegepast op de studie van mitose van stamcellen in andere hersenregio's of zelfs buiten de hersenen.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Louis y, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door de muizenembryo's te verzamelen en de embryonale hersenen te dissekeren, inclusief de rhombencephalon en de vier hersenen met de twee cerebrale hemisferen. Maak in een bak met ijs een gat in het ijs voor de inbedmalen.

Giet vervolgens 3% aros-medium in een plastic mal en plaats deze mal in het gat in het ijs. Roer het aros-medium met de punt van een digitale thermometer totdat de temperatuur 35 °C bereikt. Plaats daarna direct het brein in het insluitingsmedium om overtollig HBSS op de interface tussen het brein en het aros te verwijderen.

Draai de hersenen voorzichtig en herhaaldelijk in de inbeddingsoplossing. Met de pincet zal er een kussen van gestolde aros aan de bodem van de mal vormen in contact met het ijs. Zodra het kussen met de punt van de pincet voelbaar is tijdens het roeren, wordt de positie van de hersenen zodanig aangepast dat de dorsale zijde naar boven wijst; de hersenen mogen niet tot op de absolute bodem van de mal zakken.

Laat de aros in het ijs minstens vijf minuten uitharden voordat u de hoeken van de mal met een scheermesje wegsnijdt. Snijd voorzichtig een aros-blok rondom de hersenen en probeer het aantal sneden te minimaliseren om verstoring van de ingebedde hersenen te voorkomen. Maak met de VT 1000 s Viome coupes van 200 tot 250 micron.

Verdun cyto 11 nu tot een eindconcentratie van 0,5 tot 1 µM in het kweekmedium voor coupes, aangevuld met groeifactoren. In een 12-wellplaat worden de coupes van één brein gedurende één uur bij 37 °C geïncubeerd in 2,5 mL van de kleuringsoplossing per well. Was vervolgens de coupes gedurende 20 minuten in 2,5 mL kweekmedium voor coupes zonder kleuringsoplossing. Om de brensecties te monteren, wordt een druppel collageenoplossing op de bodem van een 35 mm glass-bottom microwell-dish geplaatst.

Verspreid het met een pipetpunt zodat het overeenkomt met de grootte van de plak. Plaats vervolgens een plak in een druppel collageen. Laat de plakken 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur voordat ze worden overgebracht naar een incubator van 37 °C met 5% carbon dioxide.

Voeg na 20 minuten in totaal 1,2 milliliters kweekmedium voor coupes toe aan de glazen bodem micro-wellplaat, telkens 600 microliters medium per keer, en verspreid dit met een pipetpunt. Laat de coupes minstens één uur en 30 minuten herstellen in de incubator bij 37 degrees Celsius met 5%carbon dioxide voordat ze worden overgebracht naar de incubatiekamer van de spinning disc confocale microscoop onder dezelfde condities. Gebruik voor live imaging een 60 x siliconenolie-objectief met een werkafstand van 300 microns en een numerieke apertuur van 1,3.

Voor celbeeldvorming worden de cellen in een Z-stapel van 30 micron gefotografeerd, waarbij het centrum van de Z-stapel zich ongeveer 40 micron onder het oppervlak van de plak bevindt. Pas indien nodig de lasersterkte en belichtingstijden aan om fotobleken te beperken en gebruik een belichtingstijd variërend van 30 tot 200 milliseconden, afhankelijk van de intensiteit van het cyto 11-signaal. Hieronder volgen representatieve gegevens die met deze analyse kunnen worden behaald om mitotische figuren in ImageJ te identificeren. Nadat de dataset voor één positie als hyperstack is geopend, selecteert u één Z-vlak waarin het weefsel en de cellen er gezond uitzien.

Scroll terug in de tijd om het tijdstip te identificeren waarop de cel in de mitose gaat. De cel kan zich over Z-vlakken bewegen, maar de temporele resolutie en de eerder beschreven Zack-parameters zijn geoptimaliseerd om dit proces mogelijk te maken. Noteer in een spreadsheet de vier D-coördinaten van de cel in de hyperstack op het moment dat deze in de mitose gaat.

Door deze coördinaten te kennen, kan worden voorkomen dat dezelfde cel meerdere keren wordt geteld. Scroll vooruit in de tijd en noteer het tijdstip waarop de cel van de ene fase naar de andere overgaat. Documenteer de duur van elke mitotische fase voor een specifieke cel om een 3D-reconstructie van de cellen uit te voeren en de rotatie tijdens de metafase te kwantificeren.

Nadat meerdere mitotische cellen zijn geïdentificeerd, gebruikt u de coördinaten van een cel en scrollt u vooruit in de tijd tot aan het begin van de metafase. Roteer de volledige hyperstack zodat de ventriculaire rand vlakker wordt. Gebruik de hoektool om de hoek te bepalen die moet worden toegepast voor deze rotatie.

Identificeer het Z-vlak waarin de cel van belang het meest zichtbaar is. Gebruik de rechthoekige selectietool om een selectie te maken die de gehele cel omvat. Identificeer vervolgens de Z-vlakken die de cel van belang bevatten en gebruik het commando 'duplicate image' om een sub-stack te maken.

Laat in het dialoogvenster het vakje duplicate hyper stack aangevinkt voor de slices. De Z-parameter komt overeen met de Z-vlakken, inclusief de gehele cel, en de T-parameter komt overeen met het huidige tijdspunt. Genereer daarna een 3D-reconstructie van de cel.

Op het huidige tijdstip. De plakafstand komt overeen met het interval tussen elk van de Z-vlakbeelden in microns. Gebruik de schuifbalk om de resulterende 3D-reconstructie zo te draaien dat de rand van de metafaseplaat zichtbaar is.

Het framenummer komt overeen met de bètahoek. Noteer dit getal. Meet vervolgens de hoek tussen de horizontale lijn en de uitlijningsassen.

Het loodrecht doorsneden van de metafaseplaat. Dit is de opname van hoek alfa. Deze hoeken voor alle metafase-tijdstippen van de betreffende cel.

De rotatiehoek tussen tijdstippen t en t minus één is gelijk aan de absolute waarde van het verschil tussen een hoek op t en deze hoek op T minus één langs de dorsoventrale as. Mitose kan het eenvoudigst worden in beeld gebracht in dorsale regio's van hersencoupjes, omdat het basale uitlopers van RGC's korter zijn en dus minder snel door een viroom worden doorgesneden. Langs de ROS-caudale as geven coupes in de caudale regio's van de dorsale cortex de meest consistente resultaten.

Dit zijn voorbeelden van een goede en een slechte regio voor beeldvorming. In een goede regio zijn de kernen elliptisch van vorm en worden er voor aanvang van de time-lapse beeldvorming veel mitotische cellen waargenomen aan de rand van het ventrikel; in een slechte regio worden er zeer weinig mitotische cellen waargenomen aan de rand van het ventrikel en zijn de kernen rond.

Hier is een voorbeeld van een goede coupesdoorsnede waargenomen met een microscoop bij lage vergroting voorafgaand aan live imaging, en hier zijn enkele voorbeelden van met cyto 11 gelabelde cellen in verschillende fasen van de mitose. Hier wordt een montage getoond van een gebied aan de rand van het ventrikel waar twee neurale progenitorcellen de verschillende fasen van de mitose doorlopen, gemarkeerd in verschillende kleuren na het volgen van deze procedure. Andere methoden, zoals neutrale elektroporatie van DNA-constructen, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, waaronder wat het lot is van delende cellen en hoe het cytoskelet zich gedraagt.

Het is daarnaast raadzaam om naast CY 11 ook secundaire methoden te gebruiken voor het volgen van mitose, zoals H2VGFP-transgene muizen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u hersencoupes hanteert, welke matchingsparameters het beste zijn en hoe u de gegevens analyseert.