Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Het algemene doel van deze procedure is om beeldvorming en analyse van neurale progenitor mitose uit te voeren in levende muisbreinslices. Dit wordt bereikt door eerst hersenen uit embryo's te dissecteren. De tweede stap is het voorbereiden van hersenslices met een vibrato.

Vervolgens wordt de live beeldvorming van hersenslices uitgevoerd. De laatste stap is het extraheren van informatie uit films om mitoseparameters van belang te analyseren. Uiteindelijk wordt tijds-lapse microscopie gebruikt om te laten zien hoe voorlopercellen van de hersenen zich in realtime delen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, zoals vaste analyse, is dat men significant inzicht kan krijgen in de temporele dynamiek van neuro-voorloperceleding in levende hersenslices. Het kan ook worden gebruikt om te begrijpen hoe genetische verstoringen de deling van voorlopercellen kunnen beïnvloeden. Hoewel we deze methode gebruiken om corticale ontwikkeling te begrijpen, kan de analyse die we beschreven hebben, worden toegepast op de studie van mitose van stamcellen in andere hersengebieden of zelfs buiten de hersenen.

De demonstratie van deze procedure zal worden gegeven door Louis Y, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium. Begin deze procedure door muisembryo's te verzamelen en de embryonale hersenen uit te snijden, inclusief de achterhersenen en de vier hersenen met de twee cerebrale hemisferen. Maak in een emmer met ijs een gat in het ijs voor de inbeddingsvormen.

Giet vervolgens 3% aros medium in een plastic mal en plaats die mal in het gat in het ijs. Roer het aros medium met de punt van een digitale thermometer tot de temperatuur 35 graden Celsius bereikt. Breng de hersenen vervolgens onmiddellijk over in het inbeddingsmedium om overtollig HBSS bij de interface tussen de hersenen en de aros te verwijderen.

Roteer de hersenen voorzichtig en zachtjes herhaaldelijk in de inbeddingsoplossing. Met de pincet zal een kussen van gegeleerde aros zich vormen op de bodem van de mal in contact met het ijs. Zodra het kussen met de punt van de pincet kan worden gevoeld terwijl de hersenen worden geroerd, plaats de hersenen met de dorsale kant omhoog, de hersenen mogen niet tot de bodem van de mal zinken.

Laat de aros minimaal vijf minuten in het ijs hard worden voordat u de hoeken van de mal met een scheermes snijdt. Snijd voorzichtig een arosblok rond de hersenen en probeer het aantal sneden te minimaliseren om verstoring van de ingebedde hersenen te voorkomen. Met de VT 1000 s Viome genereer 200 tot 250 micron slices.

Verdun nu cyto 11 tot een eindconcentratie van 0,5 tot één micromolar in het slicecultuurmedium aangevuld met groeifactoren en een 12-well plaat incubeer slices van één hersenen in 2,5 milliliter van de kleuroplossing in elk putje gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Was vervolgens de slices in 2,5 milliliter slicecultuurmedium zonder kleuroplossing gedurende 20 minuten. Om de hersensecties te monteren, plaats een druppel collageenoplossing op de bodem van een 35 millimeter glasbodem microwell plaat.

Spreid het met een pipettepunt uit om het formaat van de slice te matchen. Breng vervolgens een slice over in een druppel collageen. Laat de slices 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen voordat u ze overbrengt naar een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide.

Na 20 minuten bij een totaal van 1,2 milliliter slicecultuurmedium in de glasbodem micro, giet 600 microliter medium per keer in het well plaat en spreid het met een pipettepunt uit. Laat de slices ten minste één uur en 30 minuten in de incubator herstellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide voordat u ze overbrengt naar de incubatiekamer van de spinning disc confocale microscoop met dezelfde omstandigheden. Gebruik voor live beeldvorming een 60 x siliconenolië objectief met een werkafstand van 300 micron en een numerieke opening van 1,3.

Voor celbeeldvorming beeld de cellen af in een 30 micron Z stack met het centrum van de Z stack, gelegen ongeveer 40 micron onder het oppervlak van de slice. Pas indien nodig de laservermogen en belichtingstijden aan om fotobleken te beperken en gebruik de belichtingstijd variërend van 30 tot 200 milliseconden afhankelijk van de intensiteit van het cyto 11 signaal. Hier is representatief gegevens dat men kan bereiken uit deze analyse om de mitotische figuren in image J te identificeren. Na het openen van de dataset voor één positie als een hyper stack, selecteer een Z vlak waar het weefsel en de cellen er gezond uitzien.

Scroll terug in de tijd om het tijdstip te identificeren waarop de cel de mitose binnengaat. De cel kan over Z vlakken bewegen, maar de temporele resolutie en de Zack-parameters die eerder zijn beschreven, zijn geoptimaliseerd om dit proces mogelijk te maken. Noteer in een spreadsheet de vier D-coördinaten van de cel in de hyper stack terwijl deze de mitose binnengaat.

Door deze coördinaten te kennen, voorkomt u dat dezelfde cel meerdere keren wordt geteld. Scroll vooruit in de tijd en noteer het tijdstip waarop de cel van de ene fase naar de andere overgaat. Documenteer de duur van elke mitotische fase voor een bepaalde cel om een 3D-reconstructie van de cellen en kwantificering van rotatie tijdens metafase uit te voeren.

Nadat meerdere mitotische cellen zijn geïdentificeerd, gebruik de coördinaten van een cel en scroll vooruit in de tijd tot het begin. Draai de hele hyper stack tijdens metafase zodat de ventrikelgrens vlak is. Gebruik het hoekgereedschap om de hoek te bepalen die voor deze rotatie moet worden toegepast.

Identificeer het Z-vlak waar de cel van belang het meest zichtbaar is in dat vlak. Gebruik het rechthoekselectiegereedschap om een selectie te tekenen die de hele cel omvat. Identificeer vervolgens de Z-vlakken die de cel van belang omvatten en gebruik de opdracht afbeelding dupliceren om een sub stack te maken.

Laat in het dialoogvenster duplicaat hyper stack gecontroleerd de plakken. De Z-parameter komt overeen met de Z-vlakken, inclusief de hele cel en de frames. De T-parameter komt overeen met het huidige tijdstip. Genereer vervolgens een