Split-en-zwembad Synthese en karakterisatie van peptide Tertiaire amide Bibliotheek

Het algemene doel van deze procedure is om aan te tonen hoe combinatorische bibliotheken kunnen worden gesynthetiseerd die peptide tertiaire amide- of PTA-eenheden bevatten. Dit wordt bereikt door eerst een PTA-submonomeer te prepareren uit natuurlijke aminozuren. De tweede stap is het synthetiseren van een peptide-linkerregio op een vaste drager.

Vervolgens wordt een combinatorische bibliotheek gesynthetiseerd die PTA- en peptide-subeenheden bevat. De laatste stap is het karakteriseren van de gesynthetiseerde bibliotheek om de kwaliteit van de synthese te waarborgen. Uiteindelijk wordt een combinatorische bibliotheek gesynthetiseerd die conformationeel beperkte PTA-subeenheden bevat; een dergelijke bibliotheek kan worden gebruikt voor high-throughput screening om proteïneliganden te verkrijgen en tot de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen te leiden.

De chemie die het onderwerp is van dit artikel werd ontwikkeld in een poging moleculen te vinden die veel stijver waren dan enkele van de peptiden en andere stoffen waarmee we eerder hadden gewerkt. De gedachte is dat als men bibliotheken van stijvere moleculen identificeert, deze met veel hogere affiniteiten aan eiwitdoelen zullen binden, en we dachten dat dit zeer belangrijk was bij het ontwikkelen van toekomstige geneesmiddelen of zelfs interessante sonde-moleculen. Een visuele demonstratie van deze PTA-suborder-synthese is essentieel, aangezien de synthese moeilijk aan te leren is omdat de temperatuur- en timingscontrole cruciaal zijn voor een succesvolle synthese.

Voeg eerst 8,9 gram dine en 11,9 gram kaliumbromide toe aan een driehals ronde bodemkolf van 500 milliliter met een magnetische roerstaf. Voeg vervolgens 100 milliliter van een vooraf bereide 30% waterstofbroomzuuroplossing toe aan de kolf. Nadat de kolf in een bad van ethyleenglycol en droogijs bij -10 °C is geplaatst, wordt er gedurende 10 minuten argon via een lange naald vanaf de bodem van de kolf door de oplossing geleid.

Roer de oplossing met de magnetische roerstaf bij 300 RPM. Voeg vervolgens een vooraf bereide natriumnitrietoplossing toe aan een druktrogelijk dropping-trechter die is bevestigd aan de driehalsronde kolf en sluit deze af met een septum. Open langzaam het ventiel van de dropping-trechter, zodat de natriumnitrietoplossing in de kolf kan druppelen.

Bedien de kraan om de druppelsnelheid aan te passen naar ongeveer twee druppels per seconde. Nadat de toevoeging van natriumnitriet is voltooid, blijft de oplossing nog drie uur geroerd worden, waarbij de temperatuur geleidelijk stijgt van -10 °C naar kamertemperatuur. Indien de kleur van de oplossing te donker is, wordt een vacuüm aangelegd om de overtollige stikstofoxiden en mogelijk gevormd broom tijdens de reactie te verwijderen.

Zodra de oplossing is overgebracht naar een scheitrechter, wordt het product drie keer geëxtraheerd met 35 milliliters diethyl ether. Na het samenvoegen van de organische fase en het wassen met verzadigde pekel, wordt deze opgevangen in een kolf en zes uur gedroogd over natriumsulfaat. Na filtratie van het natriumsulfaat wordt het oplosmiddel onder vacuüm verdampt om een heldere tot lichtgele olie te verkrijgen.

Zuiver het ruwe product via silica-gel kolomchromatografie met hexaan en ethylacetaat in een verhouding van drie op één. Los voor isotopische markering 300 mg L-alanine op in 10 mL gedeutereerd water in een polyethyleenbuis van 50 mL. Voeg 10 mg alfa-ketoglutaraat toe als cosubstraat en verwarm de buis vervolgens tot 37 °C. Stel na afloop de pH bij naar 8,5 tot 8,7 met behulp van een 1 M natriumdeuteroxide-oplossing en pH-teststrips.

Voeg vervolgens 0,1 milligram alanine-transaminase toe aan de oplossing. Plaats de buis in een incubator op 37 °C en incubeer deze gedurende de nacht met matig schudden bij 10 tot 30 RPM. Zwel op dit punt één gram 90 micron, 10 gel-beads met Rink-linker op in 10 milliliter dimethylformamide gedurende drie uur in een spuitreactor van 12 milliliter met matig schudden, draineer het dimethylformamide uit de reactor en voeg 10 milliliter van een 20% piperidine dimethylformamide-oplossing toe om de Fmoc-groep van de Rink-amide-linker te deprotecteren.

Nadat de kralen 30 minuten zijn geschud met de 20% Pepperdine-oplossing, worden ze vijf keer gewassen met dimethylformamide om alle Pepperdine te verwijderen. Verwijder vervolgens enkele kralen uit de spuit en test deze met een chlooraaltest. Voeg twee milliliter van een twee molar bromoazijnzuur-dimethylformamide-oplossing toe aan de kralen en schud voorzichtig.

Voeg vervolgens twee milliliters van een twee molar diisopropylcarbodiimide dimethylformamide-oplossing toe aan de beads. Nadat de spuit met een zuiger is afgesloten, worden de beads 10 minuten lang op een shaker geschud. Zodra de beads grondig zijn gewassen met dimethylformamide, worden twee milliliters van een vooraf bereide één molar methoxyethyl dimethylformamide-oplossing toegevoegd.

Nadat de kralen zijn geschud en vijf keer zijn gewassen met dimethylformamide, wordt een aantal kralen gecontroleerd met een chloraaltest. Voeg vervolgens 10 milliliters van een één-op-één dichloormethaan-dimethylformamide-oplossing toe aan de eerder gebruikte spuit. Verdeel alle één gram kralen gelijkmatig over drie vijf milliliters spuiten-reactoren met behulp van een 1000 microliter pipet met een afgeknotte pipetpunt.

Nadat de drie spuiten drie keer zijn gewassen met chloormethaan, wast u de spuiten met het label r en s drie keer met watervrij tetrahydrofuran en de spuit met het label B drie keer met dimethylformamide. Voeg voor de tristine-koppeling van bromopropaan-NOIC-zuur ongeveer 200 milligram tristine toe aan een vial in een zuurkast. Nadat het vial is afgesloten, weegt u de hoeveelheid tristine in het vial.

Voeg vervolgens de juiste hoeveelheid watervrij tetrahydrofuraan toe aan het vials om een triphosgeentetrahydrofuraanoplossing van 20 mg/mL te maken. Om het mengsel van bromo-zuren en triphosgeen voor te bereiden, voegt u 89 µL R-2-broompropionzuur en S-2-broompropionzuur-d4 afzonderlijk toe aan twee kleine vials; voeg aan elk vial 5 mL van de triphosgeentetrahydrofuraanoplossing toe. Plaats de vials na het afsluiten gedurende 20 minuten in een vriezer van -20 °C.

Voeg ondertussen 1.125 µL van een tetrahydrofuraandiisopropylamine-oplossing in een verhouding van twee op één toe aan spuit r en s. Voeg apart 356 µL 2,4,6-trimethylpurine toe aan elk van de vials die de gekoelde mengsels van broomzuur en fosgeen bevatten, waarbij witte neerslagen ontstaan. Breng de overeenkomstige suspensie onmiddellijk direct aan op de gefunctionaliseerde beads en plaats deze vervolgens op een schudmachine om twee uur lang te schudden bij 120 RPM.

Voor de koppeling van broomazijnzuur met di-isopropylcarbodiimide voegt u vijf milliliter van een twee molar broomazijnzuuroplossing in dimethylformamide toe aan spuit B. Na het schudden voegt u vijf milliliter van een twee molar di-isopropylcarbodiimide-oplossing in dimethylformamide toe aan dezelfde spuit en schudt u deze voorzichtig; plaats spuit B vervolgens op dezelfde schudmachine als spuit R en S. Schud de spuiten daarna gedurende twee uur, nadat de spuiten grondig zijn gewassen met dichloormethaan en dimethylformamide. Verzamel alle kralen uit spuiten R, S en B in één reactor-spuit van 12 milliliter.

Nadat de beads vijf keer zijn gewassen met dimethylformamide, voegt u 10 milliliters van een één-op-één dichloormethaan-dimethylformamide-oplossing toe aan de spuit. Verdeel alle beads gelijkmatig over zeven individuele spuiten van twee milliliter met behulp van een 1000 microliter pipette met een afgeknotte pipetpunt voor het overbrengen; voeg vijf milliliters van zeven vooraf bereide twee molar amine-oplossingen toe aan de overeenkomstige spuit. Incubeer alle zeven spuiten overnacht in een incubator van 60 degree Celsius onder schudcondities na de incubatie.

Was de kralen die gesplitst moeten worden vijf keer met dichloormethaan. Na het 15 minuten schudden van de kralen en het opnieuw wassen met dichloormethaan, wordt het dichloormethaan uit de spuit afgevoerd. Breng vervolgens elke individuele kraal over naar een 96-wellplaat.

Bedek de 96-wellplaat met een dekglas met behulp van een lichtmicroscoop en een pipet met een afgeknotte tip, en plaats deze gedurende 15 minuten in de vriezer bij -20 °C. Zodra de plaat uit de vriezer is gehaald, voegt u 20 µL van een vooraf bereide, gekoelde 1:1 TFA-dichloormethaanoplossing toe aan elke well die een bead bevat. Plaats het dekglas terug en zet de 96-wellplaat op een schudmachine terug in de vriezer bij -20 °C.

Haal na 20 minuten schudden de 96-well plaat uit de vriezer en verwijder de afdeklaag. Blaas het dichloormethaan uit elke well door er lucht overheen te blazen. Wanneer er bij kamertemperatuur wordt gesplitst met een 50% TFA dichloormethaan-oplossing, wordt er aanzienlijke degradatie waargenomen.

Pieken 593 en 484 komen respectievelijk overeen met de linker en het PTA-trimeer, wat aantoont dat het volledige molecuul succesvol op de kraal is gesynthetiseerd, maar is afgebroken tijdens de splitsing. Wanneer de splitsing plaatsvindt onder lage temperatuuromstandigheden zoals hierboven beschreven, wordt de hoeveelheid door TFA geïnduceerde degradatie sterk onderdrukt. Het splitsingsmechanisme is beschreven in eerdere literatuur en men gaat ervan uit dat dit via een olaine-tussenproduct verloopt. PTA-moleculen kunnen worden gesequenced via Ms.MS, en het fragmentatiepatroon is vergelijkbaar met dat van peptiden en peptiden.

PTA-moleculen gesynthetiseerd met S-2-broompropionzuur-D4 geven over het algemeen bredere pieken in MS en MS/MS-spectra vanwege de aanwezigheid van onvolledige reactieproducten zoals S-2-broompropaan-NOIC-zuur-D3; dit zou kunnen dienen als indicatie voor de aanwezigheid van het R-chiraal centrum tijdens de sequentierprocedure. PTA-moleculen hebben bovendien de neiging om meer genaat-adducten te vormen dan peptiden. Daarom hebben water met een laag natriumgehalte en plastic apparatuur de voorkeur.

Een ander potentieel bijproduct is het acrylamide dat wordt gevormd door de broomeliminatie tijdens de aminering. Zodra het acrylamide is gevormd, wordt de sequentie beëindigd. Dit kan worden opgelost door de concentratie van het primaire amine te verlagen naar 1 M om de oplossing te reduceren.

Zodra de basisbeheersing is bereikt, kan een bibliotheek van aanzienlijke omvang in twee dagen worden klaargemaakt, mits dit correct wordt uitgevoerd. Nu deze chemie volledig is ontwikkeld en de synthese zeer effectief is, hoop ik dat andere onderzoekers deze krachtige technologie zullen adopteren om conformationeel beperkte peptide-mimetica te maken voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en probes.