Microinjectietechnieken bij zebravissen

Microinjectie van zebravisembryo's stelt onderzoekers in staat om oplossingen direct in het ontwikkelende dier te brengen, om zo genfuncties en ontwikkelingsdynamiek te bestuderen. Embryo's in het 1 tot 4-celstadium worden frequent gebruikt voor injectie. Omdat er in dit vroege stadium geen membranen zijn die de cellen en de dooier scheiden, zullen oplossingen die in één van de cellen of in de dooier worden geïnjecteerd, zich gelijkmatig over het organisme verspreiden. Door middel van microinjectie kunnen genen voor eiwitproductie worden tot expressie gebracht, of juist worden uitgeschakeld, afhankelijk van het type geïnjecteerd materiaal. Deze video demonstreert de voorbereiding van de pipet, het verzamelen van embryo's, de microinjectieprocedure, en bespreekt enkele manieren waarop deze techniek tegenwoordig in laboratoria wordt toegepast.

Laten we eerst de belangrijkste componenten van het micro-injectiesysteem bespreken: het stereoscoop, de micro-injector, de pipethouder en de micromanipulator.

De micro-injector brengt nauwkeurige volumes toe via luchtdrukpulsen, die door de gebruiker kunnen worden aangepast. De pipethouder bevestigt de pipet voor gebruik tijdens de procedure en verbindt deze met de luchtleiding van de injector. Gewoonlijk wordt de pipethouder in een micromanipulator geplaatst. Dit instrument stelt de onderzoeker in staat om kleine en nauwkeurige aanpassingen aan de positie van de pipet te maken tijdens de injectieprocedure. Een voetpedaal is verbonden met de injector, waardoor de onderzoeker de handen vrij kan houden terwijl tegelijkertijd de drukpuls voor het toedienen van het injectiemateriaal wordt geactiveerd. Ten slotte stelt de stereoscoop de onderzoeker in staat om de embryo's te zien en te focussen op de positie van de pipet tijdens de micro-injectieprocedure.

Voordat de microinjectie kan beginnen, moeten de glazen naalden worden geprepareerd. Microinjectienaalden moeten een consistente grootte hebben om een nauwkeurige toediening van de injectiematerialen mogelijk te maken. Een pipettrekker helpt om telkens fijne en scherpe pipetten te vervaardigen. De trekker verhit een glazen capillaire buis terwijl er een kracht wordt uitgeoefend die aan de buis trekt, wat resulteert in twee pipetnaalden.

Onder de microscoop wordt met een pincet de punt afgesneden op een manier die de toediening van een consistent volume vloeistof mogelijk maakt, terwijl de scherpte van de naald behouden blijft om het zebravisembryo te kunnen doorprikken.

Fenolrood, een kleurstof die wordt gebruikt om de injectieprocedure te visualiseren, kan worden gemengd met de injectieoplossing om een succesvolle injectie in het embryo te kunnen volgen.

Naalden kunnen via capillaire werking aan de puntzijde worden gevuld met de injectieoplossing, of ze kunnen via de achterzijde worden gevuld met een microloader-spuit. Zodra de naald is geladen voor injectie, kan deze in de pipethouder van de micromanipulator worden geplaatst.

Nadat de injectienaalden gereed zijn, worden de druk- en tijdsinstellingen van de microinjector aangepast om elke naald te kalibreren, wat een consistent volume per embryo waarborgt. Onder het stereoscoop wordt een kleine hoeveelheid oplossing geïnjecteerd in een druppel minerale olie op een objectglas. De grootte van de druppel wordt gemeten, waarna het door de naald verspreide volume kan worden berekend. Vervolgens kan de druk van de microinjector verder worden aangepast en het proces worden herhaald totdat er regelmatig een druppel van de gewenste grootte wordt verkregen.

Zodra de naalden zijn voorbereid en gekalibreerd, worden de embryo's verkregen en klaargezet voor injectie.

Embryo's moeten zorgvuldig worden gepositioneerd en tijdens de injectie stationair worden gehouden door middel van een microinjectiekamer. Om een microinjectiekamer te maken, worden mallen in een petrischaal geplaatst, waarna gesmolten agarose in de schaal wordt gegoten en mag uitharden. Zodra het is gestold, wordt de mal verwijderd en wordt het embryo-medium erbovenop gegoten. De embryo's kunnen met een transferpipet worden uitgelijnd in de geulen die door de mal zijn gecreëerd. Een alternatief voor het arrangeren van de embryo's in agarose is om ze langs de rand van een microscoopglas te lijnen, zodat ze in een kolom worden gepositioneerd voor microinjectie.

Zodra ze in positie zijn, zijn de embryo's klaar om te worden geïnjecteerd.

Embryo's kunnen worden geïnjecteerd in het dooiertje of in het cytoplasma van de cel. Injectie in het dooiertje is eenvoudiger en vereist een minder geavanceerde injectietechniek, terwijl injectie in het cytoplasma moeilijker is, maar robuustere resultaten oplevert. Om in het dooiertje te injecteren, wordt de micromanipulator gebruikt om de naald te bewegen zodat deze het chorion en vervolgens het dooiertje doorboort. Vervolgens wordt het voetpedaal kort ingedrukt om de inhoud van de naald in het dooiertje te injecteren. Cytoplasmatische stroming en diffusie zorgen ervoor dat de injectieoplossing de cel binnenstroomt.

Injectie in het cytoplasma vereist een nauwkeurige positionering van het embryo, zodat het cytoplasma effectief kan worden geraakt.

Na de injectie worden de embryo's overgebracht naar een nieuw schaaltje en geïncubeerd bij 28.5 °C. Ze worden regelmatig gecontroleerd om dode embryo's te verwijderen.

Om het succes van de injectie te bepalen, kunnen de embryo's worden geanalyseerd op basis van hun algemene uiterlijk, de aanwezigheid van een fluorescente marker en door te zoeken naar veranderingen in hun genoom middels genotypering.

Nu u begrijpt hoe u zebravissenembryo's injecteert, bekijken we hoe wetenschappers deze techniek kunnen gebruiken om de functie van genen te begrijpen.

Ten eerste kunnen wetenschappers gesynthetiseerde mRNA injecteren om bepaalde genen te overexpresseren en hun functie te bepalen door het fenotype te observeren. Dezelfde techniek kan ook worden gebruikt om eiwitten tot expressie te brengen die moleculaire gebeurtenissen markeren, zoals de reorganisatie van het cytoskelet die tijdens de ontwikkeling plaatsvindt.

Ten tweede kunnen genen worden uitgeschakeld door de injectie van morpholino's. Morpholino's zijn stabiele synthetische nucleïnezuuranalogen die zo kunnen worden ontworpen dat ze binden aan specifieke mRNA-sequenties via standaard nucleïnezuur-baseparing, waardoor de translatie wordt geblokkeerd. Dit leidt op zijn beurt tot het verlies van het eiwit dat door dat mRNA wordt geproduceerd. Dit effect stelt onderzoekers in staat om de rol van een specifiek gen in de ontwikkeling te begrijpen door te observeren hoe de ontwikkeling verandert bij afwezigheid ervan.

Injectie kan worden gebruikt om vreemd DNA in de zebravis in te brengen. Door sequenties te injecteren die herkenningsplaatsen bevatten voor DNA-modificerende enzymen, kunnen wetenschappers efficiënt "transgene" vissen genereren met gemodificeerde genomen, wat betekent dat vreemde genen worden doorgegeven aan toekomstige generaties. Afhankelijk van het ontwerp van de sequentie kan de genexpressie worden beperkt tot specifieke weefsels of specifieke tijdstippen in de ontwikkeling.

U heeft zojuist de introductie van JoVE over micro-injectie van vroege zebravissenembryo's bekeken. In deze video is de opstelling voor micro-injectie geïntroduceerd, is gedemonstreerd hoe micro-injectienaalden worden geprepareerd, is getoond hoe embryo's worden voorbereid voor micro-injectie, is de micro-injectietechniek uitgevoerd en zijn enkele toepassingen van micro-injectie besproken. Bedankt voor het kijken!