Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility
March 28th, 2014
Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.
Het algemene doel van het volgende experiment is om elektrische celsubstraatimpedantiesensing, bekend als eis, te gebruiken om cellulair gedrag te karakteriseren. Dit wordt bereikt door cellen op elektroden in een array te laten groeien en metingen te doen in verschillende modi om de vorming, rijping en functiemanipulaties van het endotheliale barrière te kwantificeren. Aanpassingen zoals elektrische wonden en het toevoegen van stimulanten worden vervolgens gemaakt om celmobiliteit en barrièrefunctie te testen. Resultaten worden verkregen die celbevestiging, proliferatie, migratie, detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-, cel- en celsubstraatcontacten op basis van esis beschrijven.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het celbiologische veld te beantwoorden, zoals het online genereren van kwantitatieve gegevens, het karakteriseren van cellen in hun natuurlijke confluentietoestand in hun standaard celkweekomstandigheden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de onderliggende theorie complex lijkt en u moet op verschillende basisoverwegingen letten voordat u een experiment start. Om te beginnen moeten de arrays worden gereinigd en gestabiliseerd om elektrodedrift te voorkomen, de reproduceerbaarheid te verbeteren en de signaalsterkteverhouding te verhogen.
Voeg daarom 200 microliter 10 millimolar EL ine toe aan elk putje van een achtputtenarray na 15 minuten. Bij kamertemperatuur verwijdert u de EL cystine met twee ultrapure waterwassingen, geen fosfaatbuffers. Stel ook de elektroden niet bloot aan serumbevattende oplossingen voordat u coat, omdat deze de eiwitabsorptie kunnen verstoren. Voeg vervolgens 200 microliter verwarmde 1%gelatine toe aan elk putje en incubeer de array gedurende een half uur bij 37 graden Celsius.
Om de gelatine te verwijderen, gebruikt u ultrapuur water en laat de elektrodeoppervlakken niet uitdrogen. Vul vervolgens de putjes met 400 microliter volledig kweekmedium, dat nu serum kan bevatten. Laad de array in de houder.
Controleer de negen gouden vierkanten. Ze moeten contact maken met de POGO-pinnen. Bevestig de array voorzichtig op zijn plaats met de hand en draai de afstelschroef op de computer vast.
Open de meetsoftware. Druk op instellen en controleer vervolgens onder de sectie gegevens verzamelen om een snelle impedantiemeting van elk putje uit te voeren op de standaardfrequentie van 4.000 hertz. De waarden worden opgeslagen in de opmerkingensectie.
Zorg ervoor dat de controle nauwkeurig het type EISs-array in gebruik aanwijst onder de sectie putconfiguratie op het arraydiagram. Rood en groen geven de functionaliteit van de verbindingen aan. Als het reinigen en coderen succesvol waren, zouden acht W een E sys-arrays ongeveer vijf tot zes NANOFARAD en acht W 10 E-arrays moeten registreren.
50 tot 60 nanofarad basisweerstand vóór celzaaien is dus ongeveer 2000 ohm. Om de gegevens te modelleren met behulp van RB alpha en cm, start u een MFT-opname met de mislukte mediumarray. Neem 15 minuten celvrije gegevens en voltooi het experiment om de cellen toe te voegen.
Verwijder nu de array en zaai 400 microliter enkele celsuspensie in elk putje. Om celgroei te bestuderen, zaait u 10.000 cellen per vierkante centimeter om te beginnen met een bijna confluente populatie, zaait u 60.000 cellen per vierkante centimeter. Nadat de array in de houder is geladen, selecteert u onder de sectie putconfiguratie de putjes om te meten.
Ga vervolgens naar de opties voor gegevensverzameling en selecteer een meetmodus voor een tijdreeks bij een vaste frequentie selecteer SFT en kies de meetfrequentie om de elektrodebedekkking te meten en RB en alpha te modelleren. Selecteer MFT en het apparaat zal automatisch metingen verrichten bij alle beschikbare frequenties. Voer de meting zoveel mogelijk uit in de multifrequentiemodus. Dit vereist gegevens bij alle beschikbare frequenties en biedt daarmee de meeste inzichten.
Voor microbewegingsanalyse selecteert u RTC en past u de bemonsteringsfrequentie aan. De standaard temporele resolutie is één hertz, maar kan worden verhoogd om snelle veranderingen in impedantie bij te houden. De waarde kan worden verhoogd tot 25 hertz voor de z theta.
Om microbeweging sequentieel uit veel putjes te meten, selecteert u het helpmenu. Kies vervolgens expert-werkbalkmenu-items weergeven en verkrijg en multi-well RTC. Zorg ervoor dat u in de sectie gegevensverzameling de tijdslimiet in uur opgeeft.
Wanneer u deze instelling gebruikt, vraagt de software na het starten van de gegevensverzameling om het aantal cycli. Bij het verzamelen van gegevens met behulp van SFT of MFT, selecteert u het tijdsinterval tussen metingen dat in seconden is opgegeven. Laat deze optie ongemarkeerd voor maximale gegevensverzameling.
Druk nu op start en geef op waar de gegevens moeten worden opgeslagen. De run wordt gestopt door op voltooien te drukken. Door op pauze te drukken, stopt de gegevensverzameling, maar blijft de experimentele klok lopen.
Verwijder nu de array en manipuleer de putjes onder een laminare stromingshaak. Nadat de array in de houder is teruggezet, klikt u op verbinding controleren om elektrische verbindingen te verifiëren en gaat u verder met het experiment om gegevens te blijven verzamelen. Als de cellen na manipulatie niet steriel hoeven te zijn, kan een stimulus zoals trombine direct tijdens de gegevensverzameling aan een putje worden toegevoegd.
Dergelijke geïntroduceerde variaties kunnen op de experimentele klok worden gemarkeerd door op markeren te drukken en een opmerking toe te voegen. Een andere optie is om de cellen elektrisch te verwonden. De instellingen hiervoor moeten enigszins worden aangepast om het correct te krijgen om korte verwondingstijd en het is niet effectief te lang, en u kunt de elektroden beschadigen.
Begin gewoon met de standaardinstellingen die de software biedt en ga van daaruit verder. Ga naar de sectie wondelektroparade-setup en schakel wond in. Selecteer nu de putjes om te wonden onder putconfiguratie.
Alleen de gecontroleerde putjes worden verwond. Door op activeren te klikken, verschijnt er een pop-upvenster om
Overzicht
Dit protocol bespreekt Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, een methode om het impedantiespectrum van aderente cellen vast te leggen en te analyseren voor de kwantificering van celadhesie, proliferatie, mobiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Elektrofysiologie
- Impedantiedetectie
Achtergrond
- Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (EIS) wordt gebruikt om cellulair gedrag te karakteriseren.
- Deze methode maakt de kwantificering van de vorming en rijping van de endotheelbarrière mogelijk.
- Het biedt inzichten in celmobiliteit en barrièrefunctie onder verschillende omstandigheden.
- Begrip van de onderliggende theorie is cruciaal voor effectieve toepassing.
Doel van de studie
- Om cellulair gedrag te karakteriseren met behulp van EIS.
- Om reacties op farmacologische en toxische stimuli te kwantificeren.
- Om het begrip van celadhesie, proliferatie en migratie te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Cellen worden gekweekt op elektroden in een array.
- Metingen worden in verschillende modi genomen om het celgedrag te beoordelen.
- Gegevens worden verzameld op verschillende frequenties om uitgebreide inzichten te bieden.
- Elektrisch wonden en toevoeging van stimuli worden gebruikt om celreacties te testen.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve gegevens over celadhesie en proliferatie werden gegenereerd.
- Endotheelpermeabiliteit en cel-celcontacten werden beoordeeld.
- Celmobiliteit werd gekenmerkt onder verschillende experimentele omstandigheden.
- Succesvolle reiniging en stabilisatie van arrays verbeterde de betrouwbaarheid van de gegevens.
Conclusies
- EIS is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamica.
- De methode verbetert het begrip van celgedrag in fysiologische omstandigheden.
- Een juiste experimentele opstelling is cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) enables real-time, quantitative assessment of endothelial proliferation, barrier function, and motility, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. By providing automated, label-free monitoring of cell behavior under physiological and perturbed conditions, ECIS informs mechanistic de-risking and portfolio triage decisions. Its sensitivity to cell-cell and cell-matrix interactions positions it as a critical tool for evaluating therapeutic hypotheses and optimizing assay development in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of endothelial barrier integrity and cellular proliferation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing cell-cell from cell-matrix adhesion contributions.
- Facilitates predictive confidence in target selection through real-time functional readouts.
- Provides automated, reproducible data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-content readouts for cell attachment, spreading, and motility.
- Enables reproducible quantification of wound healing and response to vasoactive stimuli.
- Supports assay scalability and platform reuse across adherent cell types.
- Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro barrier function measurements with disease-relevant endothelial models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of vascular targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative barrier and motility data.
- Supports translational biomarker development for vascular permeability and repair.
Pipeline & Workflow Integration
ECIS integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable platform for functional cell-based analytics.
- Discovery Biology: Quantifies cell proliferation, barrier formation, and motility to clarify pathway function and de-risk targets.
- Screening: Standardizes assay outputs for reproducible evaluation of compound effects on cell behavior.
- Analytics: Provides impedance, resistance, and capacitance measurements for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro endothelial function with preclinical models of vascular integrity.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, automated capability for diverse cell-based R&D workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in endothelial biology.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, real-time data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in impedance theory and data modeling for accurate interpretation.
- Needs specialized electrode arrays, environmental control, and compatible analytical software.
- Demands rigorous cleaning, coating, and cell seeding protocols for reproducibility.
- Must be adapted for different adherent cell types and experimental conditions.
- Highly sensitive to environmental fluctuations such as temperature and pH.
