Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility
28 maart 2014
Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.
Het algemene doel van het volgende experiment is om elektrische celsubstraatimpedantiesensing, bekend als eis, te gebruiken om cellulair gedrag te karakteriseren. Dit wordt bereikt door cellen op elektroden in een array te laten groeien en metingen te doen in verschillende modi om de vorming, rijping en functiemanipulaties van het endotheliale barrière te kwantificeren. Aanpassingen zoals elektrische wonden en het toevoegen van stimulanten worden vervolgens gemaakt om celmobiliteit en barrièrefunctie te testen. Resultaten worden verkregen die celbevestiging, proliferatie, migratie, detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-, cel- en celsubstraatcontacten op basis van esis beschrijven.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het celbiologische veld te beantwoorden, zoals het online genereren van kwantitatieve gegevens, het karakteriseren van cellen in hun natuurlijke confluentietoestand in hun standaard celkweekomstandigheden. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat de onderliggende theorie complex lijkt en u moet op verschillende basisoverwegingen letten voordat u een experiment start. Om te beginnen moeten de arrays worden gereinigd en gestabiliseerd om elektrodedrift te voorkomen, de reproduceerbaarheid te verbeteren en de signaalsterkteverhouding te verhogen.
Voeg daarom 200 microliter 10 millimolar EL ine toe aan elk putje van een achtputtenarray na 15 minuten. Bij kamertemperatuur verwijdert u de EL cystine met twee ultrapure waterwassingen, geen fosfaatbuffers. Stel ook de elektroden niet bloot aan serumbevattende oplossingen voordat u coat, omdat deze de eiwitabsorptie kunnen verstoren. Voeg vervolgens 200 microliter verwarmde 1%gelatine toe aan elk putje en incubeer de array gedurende een half uur bij 37 graden Celsius.
Om de gelatine te verwijderen, gebruikt u ultrapuur water en laat de elektrodeoppervlakken niet uitdrogen. Vul vervolgens de putjes met 400 microliter volledig kweekmedium, dat nu serum kan bevatten. Laad de array in de houder.
Controleer de negen gouden vierkanten. Ze moeten contact maken met de POGO-pinnen. Bevestig de array voorzichtig op zijn plaats met de hand en draai de afstelschroef op de computer vast.
Open de meetsoftware. Druk op instellen en controleer vervolgens onder de sectie gegevens verzamelen om een snelle impedantiemeting van elk putje uit te voeren op de standaardfrequentie van 4.000 hertz. De waarden worden opgeslagen in de opmerkingensectie.
Zorg ervoor dat de controle nauwkeurig het type EISs-array in gebruik aanwijst onder de sectie putconfiguratie op het arraydiagram. Rood en groen geven de functionaliteit van de verbindingen aan. Als het reinigen en coderen succesvol waren, zouden acht W een E sys-arrays ongeveer vijf tot zes NANOFARAD en acht W 10 E-arrays moeten registreren.
50 tot 60 nanofarad basisweerstand vóór celzaaien is dus ongeveer 2000 ohm. Om de gegevens te modelleren met behulp van RB alpha en cm, start u een MFT-opname met de mislukte mediumarray. Neem 15 minuten celvrije gegevens en voltooi het experiment om de cellen toe te voegen.
Verwijder nu de array en zaai 400 microliter enkele celsuspensie in elk putje. Om celgroei te bestuderen, zaait u 10.000 cellen per vierkante centimeter om te beginnen met een bijna confluente populatie, zaait u 60.000 cellen per vierkante centimeter. Nadat de array in de houder is geladen, selecteert u onder de sectie putconfiguratie de putjes om te meten.
Ga vervolgens naar de opties voor gegevensverzameling en selecteer een meetmodus voor een tijdreeks bij een vaste frequentie selecteer SFT en kies de meetfrequentie om de elektrodebedekkking te meten en RB en alpha te modelleren. Selecteer MFT en het apparaat zal automatisch metingen verrichten bij alle beschikbare frequenties. Voer de meting zoveel mogelijk uit in de multifrequentiemodus. Dit vereist gegevens bij alle beschikbare frequenties en biedt daarmee de meeste inzichten.
Voor microbewegingsanalyse selecteert u RTC en past u de bemonsteringsfrequentie aan. De standaard temporele resolutie is één hertz, maar kan worden verhoogd om snelle veranderingen in impedantie bij te houden. De waarde kan worden verhoogd tot 25 hertz voor de z theta.
Om microbeweging sequentieel uit veel putjes te meten, selecteert u het helpmenu. Kies vervolgens expert-werkbalkmenu-items weergeven en verkrijg en multi-well RTC. Zorg ervoor dat u in de sectie gegevensverzameling de tijdslimiet in uur opgeeft.
Wanneer u deze instelling gebruikt, vraagt de software na het starten van de gegevensverzameling om het aantal cycli. Bij het verzamelen van gegevens met behulp van SFT of MFT, selecteert u het tijdsinterval tussen metingen dat in seconden is opgegeven. Laat deze optie ongemarkeerd voor maximale gegevensverzameling.
Druk nu op start en geef op waar de gegevens moeten worden opgeslagen. De run wordt gestopt door op voltooien te drukken. Door op pauze te drukken, stopt de gegevensverzameling, maar blijft de experimentele klok lopen.
Verwijder nu de array en manipuleer de putjes onder een laminare stromingshaak. Nadat de array in de houder is teruggezet, klikt u op verbinding controleren om elektrische verbindingen te verifiëren en gaat u verder met het experiment om gegevens te blijven verzamelen. Als de cellen na manipulatie niet steriel hoeven te zijn, kan een stimulus zoals trombine direct tijdens de gegevensverzameling aan een putje worden toegevoegd.
Dergelijke geïntroduceerde variaties kunnen op de experimentele klok worden gemarkeerd door op markeren te drukken en een opmerking toe te voegen. Een andere optie is om de cellen elektrisch te verwonden. De instellingen hiervoor moeten enigszins worden aangepast om het correct te krijgen om korte verwondingstijd en het is niet effectief te lang, en u kunt de elektroden beschadigen.
Begin gewoon met de standaardinstellingen die de software biedt en ga van daaruit verder. Ga naar de sectie wondelektroparade-setup en schakel wond in. Selecteer nu de putjes om te wonden onder putconfiguratie.
Alleen de gecontroleerde putjes worden verwond. Door op activeren te klikken, verschijnt er een pop-upvenster om
Overzicht
Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is een in vitro techniek die wordt gebruikt om het gedrag van adherente cellagen te monitoren en te kwantificeren door de elektrische impedantie over gouden elektroden te meten. Deze methode maakt real-time, geautomatiseerde analyse mogelijk van celaanhechting, proliferatie, migratie, barrièrefunctie en reacties op diverse stimuli. Het artikel biedt een uitgebreid protocol voor ECIS, inclusief de experimentele opstelling, meetmodi, data-analyse en representatieve toepassingen met endotheelcellen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Bio-elektrische meting
- Endotheelcelonderzoek
Achtergrond
- ECIS meet impedantieveranderingen die worden veroorzaakt door celaanhechting en celgedrag op elektrode-oppervlakken.
- De techniek is gevoelig voor eigenschappen van het celmembraan en voor cel-cel- en cel-substraatinteracties.
- Het maakt non-invasieve, continue monitoring van de integriteit en functie van de cellaag mogelijk.
- Een correct experimental ontwerp en begrip van de ECIS-theorie zijn cruciaal voor betrouwbare resultaten.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor ECIS-experimenten, van de opstelling tot de data-analyse.
- Om toepassingen van ECIS te demonstreren bij het bestuderen van celaanhechting, proliferatie, migratie en barrièrefunctie.
- Om experimentele overwegingen, voordelen en beperkingen van het ECIS-systeem te bespreken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding en reiniging van elektrode-arrays om reproduceerbaarheid en signaalkwaliteit te waarborgen.
- Coating van elektroden met gelatine en het zaaien van endotheelcellen bij gedefinieerde dichtheden.
- Het gebruik van verschillende ECIS-meetmodi (SFT, MFT, RTC) voor tijdreeks- en frequentieafhankelijke data-acquisitie.
- Toepassing van elektrische wonding en chemische stimuli (bijv. trombine) om celmigratie en barrière-responsen te beoordelen.
- Datamodellering met behulp van RB- (cel-cel-weerstand) en alpha-parameters (cel-elektrode-impedantie) binnen de ECIS-software.
Belangrijkste resultaten
- ECIS maakt kwantificering van celadhesie, proliferatie en migratie in real-time mogelijk.
- Elektrische wondaanmaak veroorzaakt een karakteristieke daling in de impedantie, gevolgd door herstel wanneer cellen migreren om de wond te genezen.
- Toepassing van vasoactieve stoffen zoals trombine verhoogt tijdelijk de permeabiliteit van de cellaag, wat detecteerbaar is als impedantieveranderingen.
- RB- en alfamodellering maakt onderscheid tussen de bijdragen van cel-cel- en cel-matrixadhesie aan de barrièrefunctie.
Conclusies
- ECIS is een krachtig en gevoelig instrument voor het bestuderen van het dynamische gedrag van adherente cellen onder fysiologische en experimentele omstandigheden.
- Een zorgvuldige experimentele opzet en data-interpretatie zijn essentieel voor betekenisvolle resultaten.
- De techniek is breed toepasbaar op diverse celtypen en onderzoeksvragen met betrekking tot de integriteit en functie van de cellaag.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) maakt een real-time, kwantitatieve beoordeling mogelijk van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en motiliteit, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij vroege ontdekking en targetvalidatie. Door geautomatiseerde, labelvrije monitoring van celgedrag onder fysiologische en verstoorde condities, biedt ECIS inzicht voor mechanische risicoanalyse en beslissingen over portfoliotriage. De gevoeligheid voor cel-cel- en cel-matrixinteracties positioneert ECIS als een essentieel instrument voor het evalueren van therapeutische hypothesen en het optimaliseren van assayontwikkeling in biofarmaceutische R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van de integriteit van de endotheelbarrière en cellulaire proliferatie mogelijk.
- Ondersteunt mechanistieke risicoreductie door onderscheid te maken tussen de bijdragen van cel-cel- en cel-matrixadhesie.
- Verhoogt de voorspellende zekerheid bij de selectie van targets via real-time functionele read-outs.
- Levert geautomatiseerde, reproduceerbare gegevens voor hypothese-gestuurde triage van portfolio's.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde high-content readouts voor celhechting, spreiding en motiliteit.
- Maakt reproduceerbare kwantificering van wondgenezing en respons op vasoactieve stimuli mogelijk.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en het hergebruik van platforms voor verschillende types adherente cellen.
- Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro metingen van de barrièrefunctie uit met ziekterelevante endotheelmodellen.
- Biedt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van vasculaire targets.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve gegevens over barrière en motiliteit.
- Ondersteunt de translationele ontwikkeling van biomarkers voor vasculaire permeabiliteit en herstel.
Integratie van Pipeline en Workflow
ECIS integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetesten tot leadidentificatie en preklinische validatie, en biedt een herbruikbaar platform voor functionele celgebaseerde analyses.
- Discovery Biology: Kwantificeert celproliferatie, barriervorming en motiliteit om pathway-functies te verduidelijken en risico's bij targets te verminderen.
- Screening: Standardiseert assay-outputs voor een reproduceerbare evaluatie van de effecten van verbindingen op het celgedrag.
- Analytics: Levert impedantie-, resistentie- en capaciteitsmetingen voor een robuuste statistische vergelijking van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro endotheliale functie en preklinische modellen van vasculaire integriteit.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbare, geautomatiseerde capaciteit voor diverse celgebaseerde R&D-workflows.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in de endotheliale biologie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van celgebaseerde assays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het leveren van kwantitatieve realtime-gegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van programma's gericht op het vaatstelsel.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in impedantietheorie en datamodellering voor een accurate interpretatie.
- Vereist gespecialiseerde elektrode-arrays, omgevingscontrole en compatibele analytische software.
- Vereist strikte protocollen voor reiniging, coating en het uitzaaien van cellen voor reproduceerbaarheid.
- Moet worden aangepast aan verschillende types adherente cellen en experimentele condities.
- Zeer gevoelig voor omgevingsschommelingen zoals temperatuur en pH.
