Bio-energetica en de oxidatieve Burst: Protocollen voor de Isolatie en evaluatie van menselijke leukocyten en bloedplaatjes
27 maart 2014
Bloed leukocyten en bloedplaatjes kunnen worden gebruikt als een marker van algemene bio-energetische gezondheid van een individu en dus de potentie om pathologische processen en het effect van behandeling te controleren. Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren en meten mitochondriale functie en de oxidatieve uitbarsting in deze cellen.
In het volgende protocol wordt de meting van de bio-energetische profielen en oxidatieve burstreacties van humane bloedmonocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes gedemonstreerd. Dit wordt bereikt door eerst de buffycoat en de trombocytren rijke plasmafracties van vers getrokken bloed te verzamelen. Als tweede stap wordt de heterogene witte bloedcelpopulatie gescheiden in mononucleaire en polymorfkernige cellagen door middel van dichtheidsgradiënt.
Vervolgens worden de zuivere monocyte, neutrofiel en lymfocytpopulaties verder geïsoleerd door middel van maximale scheiding en vervolgens geplaatst voor extracellulaire flux- of XF-analyse. Uiteindelijk kan de gevoelige en reproduceerbare meting van de mitochondriale functie in monocyten, lymfocyten en bloedplaatjes, evenals de oxidatieve burst van monocyte en neutrofiel zuurstofverbruik, worden gemeten door middel van XF-technologie. Het voordeel van de techniek die we u vandaag laten zien, is dat u uit een klein bloedmonster alle belangrijke cellen kunt bereiden die zich in het bloed van de patiënt bevinden.
Dit zijn bloedplaatjes en de leukocyten in een zuivere geïnactiveerde vorm en hun mitochondriale functie meten. Dit, denken we, kan vervolgens verschillende ziekten en toestanden binnen de patiënt in realtime weerspiegelen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen over metabolisme te beantwoorden, zoals wat de rol is van levensstijl, voeding en pathologische stress op mitochondriale functie.
Dit protocol combineert meerdere technologieën voor de isolatie en bepaling van cellulaire bio-energetica in verschillende leukocytenpopulaties en in bloedplaatjes. Deze stap van het protocol is erg cruciaal omdat de dichtheidsgradiënt en magnetische scheiding nauwkeurig pipetten vereist. Bovendien moet u zich ervan bewust zijn waar de celpopulaties zich bevinden tijdens de fractievorming.
We zullen de isolatie van perifere bloedcellen en de analyse van cellulaire bio-energetica demonstreren op de 24-well extracellulaire flux analyzer of de XF 24. Deze methode kan echter ook worden uitgevoerd op de XF 96. Ten minste twee uur voor het begin van de procedure. Hydrateer de XF sensor cartridge-sondes met XF cran-oplossing.
Spin vervolgens het vers getrokken volledige bloed gedurende 15 minuten bij 500 keer G en kamertemperatuur in een centrifuge met een schommelende emmerrotor. Gebruik een overdrachtspijp om de bovenste laag met het trombocytren rijke plasma te verwijderen tot er een centimeter plasma boven de erytrocyt buffycoatlaag blijft en zet het plasma op kamertemperatuur opzij voor latere verwerking. Breng vervolgens de Buffycoat over naar een steriele 50 milliliter conische buis en verdun de witte bloedcellen tot 24 milliliter.
Voeg vervolgens, met basale RPMI, drie milliliter van lage dichtheid, zijn ondoorzichtige 1.077 toe aan elk van de drie 15 milliliter conische buizen. Plaats vervolgens de punt van een vijf milliliter smalle pijp in de bodem van elke buis. Draai vervolgens langzaam drie milliliter van hoge dichtheid, zijn ondoorzichtige 1.119 los.
Gebruik nu een geautomatiseerde pijp om voorzichtig acht milliliter van het verdunde bloed toe te voegen aan elke gradiënt zonder de lagen te verstoren. Er is blauwe kleurstof toegevoegd aan de lagedichtheidsgradiënt voor visualisatie van alle gradiëntlagen. Nadat de cellen door centrifugatie gescheiden zijn, verzamel de mononucleaire en polymorfkernige cellen met steriele glazen pipetten zonder de andere celbanden te verstoren.
Verzamel de mononucleaire en polymorfkernige celpopulaties van elke buis in afzonderlijke steriele 50 milliliter conische buizen voor elk celtype, en voeg vier volumes van RPMI toe aan beide buizen. Na het spinnen van de cellen, breng de pellets over naar een 1,5 milliliter buis, pelleteer opnieuw en suspendeer in 80 microliter verse RPMI aangevuld met BSA. Voeg vervolgens 20 microliter magnetisch parelketlabelde anti CD 14 en anti CD 15 antilichamen toe aan de mononucleaire en polymorfkernige celfracties respectievelijk.
Incubeer elke celsuspensie gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en was vervolgens elke buis met één milliliter van R-P-M-I-B-S-A media, suspendeer de pellets in 500 microliter van R-P-M-I-B-S-A. Breng vervolgens de celsuspensies aan op individuele R-P-M-I-B-S-A gewassen LS-kolommen en was elke kolom drie keer met drie milliliter van R-P-M-I-B-S-A media. Verzamel de celsuspensie doorstromingen en kolomwassingen in steriele buizen om de monocyten en neutrofielen te isoleren, verwijder de kolommen uit het magnetische veld na de laatste was en eluteer de positief geselecteerde cellen in een steriele buis met vijf milliliter van R-P-M-I-B-S-A. Om de lymfocyten te isoleren, pelleteer de doorstromende wasfractie van de celkolom, suspendeer de celpellet in 80 microliter van R-P-M-I-B-S-A en incubeer de cellen in 20 microliter van CD 61 en CD 2 35 A antilichamen gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.
Herhaal vervolgens de max-scheiding zoals eerder en verzamel de doorstroming die de lymfocyten bevat om de bloedplaatjes te isoleren, centrifugeer het gereserveerde trombocytren rijke plasma en verwijder vervolgens het plasma en was de celpellet eenmaal met vijf milliliter steriele PBS aangevuld met één microgram per milliliter prostaglandine I twee. Suspendeer de trombocytpelletje in één milliliter verse PBS prostaglandine I twee buffer om de geïsoleerde monocyten, lymfocyten, neutrofielen en bloedplaatjes te plateren. Tel eerst de cellen en breng ze naar een geschikt volume in XF-assaymedium om een zaaidensity van 2,5 keer 10 tot de vijfde cellen per putje in een 200 microliter volume mogelijk te maken. In een 24-well XF-celcultuur microplaat bedekt met cel-T voor bloedplaatjes zaai 2,5 keer 10 tot de zevende cellen per putje in een 200 microliter volume.
Na het spinnen van de cellen op de plaat, breng de uiteindelijke putvolumes tot 660 microliter met XF-medium en incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten voorafgaand aan de XF-assay. Tijden
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren en meten van mitochondriale functie en oxidatieve burst in humane bloedleukocyten en bloedplaatjes. Deze metingen kunnen dienen als indicatoren van de bioenergetische gezondheid van een individu en kunnen helpen bij het monitoren van verschillende pathologische processen.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Bio-energetica
Achtergrond
- Bloedleukocyten en bloedplaatjes zijn potentiële markers voor bio-energetische gezondheid.
- Het monitoren van mitochondriale functie kan inzicht geven in ziektetoestanden.
- Oxidatieve burst-responses zijn cruciaal voor het begrijpen van immuunfunctie.
- De methode maakt real-time beoordeling van cellulair metabolisme mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om verschillende leukocytenpopulaties uit bloed te isoleren.
- Om mitochondriale functie in deze cellen te meten.
- Om de oxidatieve burst in monocyten en neutrofielen te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van buffy coat en bloedplaatjesrijk plasma uit bloedmonsters.
- Afscheiding van witte bloedcellen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie.
- Isolering van monocyten, lymfocyten en neutrofielen met behulp van magnetische scheiding.
- Meting van mitochondriale functie en oxidatieve burst met behulp van XF-technologie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van pure leukocytenpopulaties uit kleine bloedmonsters.
- Reproduceerbare metingen van mitochondriale functie tussen celtypen.
- Aangetoonde oxidatieve burst-responses in monocyten en neutrofielen.
- Mogelijke toepassingen in het monitoren van metabole gezondheid en ziekte.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een betrouwbare aanpak om bio-energetische gezondheid te beoordelen.
- Het kan de impact van levensstijl en pathologische stress op cellulair metabolisme weerspiegelen.
- Deze techniek kan helpen bij het begrijpen van verschillende ziekten in real-time.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial bioenergetics and oxidative burst in human leukocytes and platelets enables mechanistic de-risking at the interface of immunometabolism and disease pathology. This workflow supports predictive confidence in early discovery and translational research by providing real-time, cell-type-specific metabolic readouts from minimal patient samples. The approach enhances portfolio decision-making by linking systemic metabolic alterations to disease-relevant cellular phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of metabolic pathways in primary human immune cells and platelets.
- Supports functional target validation by quantifying mitochondrial and oxidative burst responses.
- Facilitates biological de-risking through direct measurement of cellular bioenergetics under disease-relevant conditions.
- Provides predictive confidence for triaging targets linked to immunometabolic dysfunction.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, non-activated primary cell systems for downstream metabolic assays.
- Standardizes oxygen consumption and oxidative burst measurements across replicates and cell types.
- Enables high-throughput, quantitative readouts using microplate-based extracellular flux analysis.
- Supports reproducible compound evaluation in immune-metabolic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular bioenergetic profiles with disease-relevant systemic and immune biomarkers.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling patient-derived sample analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on real-time metabolic phenotyping.
- Offers mechanistic de-risking for immunometabolic targets in translational pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and translational research by enabling robust metabolic phenotyping of primary human cells. It integrates seamlessly with immunometabolic target validation and preclinical biomarker strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in immune and platelet bioenergetics.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible systems for quantitative metabolic readouts.
- Analytics: Delivers oxygen consumption and oxidative burst data normalized to protein content for cross-condition comparison.
- Translational Research: Enables alignment of cellular metabolic function with clinical and biomarker endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic profiling across diverse disease models and patient cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immunometabolic research.
- Operational Value: Standardizes and scales metabolic assays using minimal blood volumes and high-throughput instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by linking cellular metabolism to disease mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunometabolic targets and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, magnetic separation, and extracellular flux analysis.
- Needs access to high-throughput microplate respirometry platforms and validated assay reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization of cell handling and normalization protocols.
- Adaptable to various disease models and patient-derived samples with attention to activation state.
- Dependent on maintaining sterile technique and biosafety compliance when handling human samples.
