Name: Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Leer longitudinale meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D tumor modellen met particle-tracking microreologie. Deze niet-destructieve methode kwantificeert ruimtelijke veranderingen in mechanische eigenschappen tijdens tumorprogressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We dankbaar de open-source delen van MATLAB-deeltje volgen code die door Maria Kilfoil (erkennen <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil/</a> ), samen met de eerdere IDL code en uitgebreide documentatie die door John C. Crocker en Eric R. Weeks. Dit werk werd mogelijk gemaakt door financiële steun van het National Cancer Institute (NCI / NIH), K99CA155045 en R00CA155045 (PI: JPC).

1. Kweken bolvormige tumoren <ol><li> Meng 10 ml van celkweek kwaliteit water met 0,1 g agarose tot een 1% agarose oplossing te verkrijgen. </li><li> Warmte agarose oplossing boven 70 ° C (ongeveer 14 seconden in een standaard magnetron of met een verwarmingsplaat) voor aliquoting 40 ul van agarose oplossing in een goed op een 96-wells plaat. </li><li> Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende ten minste 1 uur tijdens het oogsten van cellen onder toepassing van standaardtechnieken. </li><li> Gebruik een hemacytometer om de concentratie van cellen te bepalen in de suspensie. </li><li> Verdunde celsuspensie tot 1000 cellen / ml en voeg 100 ul van deze verdunning naar de put met de uitgeharde agarose bed. </li><li> Plaats het monster op een schudder overnacht in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO2. </li><li> Verwijder monster uit shaker en voeg 100 ul van media voor celkweek. </li><li> Incubeer sferoïden totdat gewenste diameter is bereikt. Bijvoorbeeld, na 9 dagen, spheroid zal ongeveer 450 micrometer in doorsnede zijn. Gedurende deze tijd kan verse groeimedia worden toegevoegd aan de putjes maar aspiratie moet worden vermeden omdat dit zal resulteren in verwijdering van de sferoïde. </li></ol> 2. Voorbereiden 3D bolvormige tumoren Ingebed in ECM <ol><li> Bereid een werkplek met benodigde materialen in een laminaire stroming kap. </li><li> Bereid een verdund mengsel van carboxylaat gemodificeerde 1 micrometer diameter fluorescerende tracer sondes door toevoeging van 2 delen voorraad sondes (2% vaste stof) tot 25 delen steriel water. </li><li> Verwijderen van een fles van 3,1 mg / ml collageen uit de koelkast en plaats deze op het ijs. </li><li> Aliquot 125 ul van collageen in een lege 2 ml flacon. </li><li> Voeg 50 ul van verdunde tracer probe-oplossing aan de flacon met het collageen en vortex kort probes verspreiden. </li><li> Voeg 235 ul van geschikte celkweek medium dat fenolrood (die geel zal blijken) voor een totaal volume van 410 ml en vortex kort voordat u 205 ml (helft van het totale volume) en het in een nieuwe 2 ml flacon. Vial 1 zal de tumor spheroïde bevatten en Vial 2 zal een controle mengsel zijn. </li><li> Voeg ~ 2 ui 1 M NaOH tot injectieflacon 1 om de oplossing terug naar neutrale pH (kweekmedium dat fenol rood moeten terugkeren naar rood) te brengen. Merk op dat dit zal leiden tot het mengsel begint genezen als het niet op ijs gehouden. Vortex kort te mengen, dan onmiddellijk terug naar ijs rack. OPMERKING: De sferoïde is nauwelijks zichtbaar met het blote oog na 9 dagen kweken en nadat het uit de agarose bed is een moeilijke taak. Gebruik van een dissectie microscoop kan nuttig zijn voor sommige gebruikers. Behoud van de integriteit van de bolvormige tijdens de overdracht van het grootste belang. </li><li> Met behulp van een brede mond pipet tip, verwijder voorzichtig 40 ul van media uit het putje met de tumor spheroïde. Bewaar deze 40 ui tijdens het uitvoeren van de volgende stap. </li><li> Controleer het goed om te zien of de bolvormigewerd in de vorige stap. Als het was, voeg de 40 pl met de bolvormige om injectieflacon 1. Indien niet, dan plaatst de 40 pi terug in de put en herhaal de vorige stap. </li><li> Roer Vial 1 (geen risico vortexen, kan het bolvormige beschadigen) alvorens het mengsel in 60 ui porties in drie putjes van een 96-wells plaat. Inspecteer elk putje met een microscoop na het toevoegen van het mengsel te bepalen die goed bevat sferoïde. </li><li> Voeg ~ 2 ul 1 M NaOH en 40 pi celkweekmedium te Vial 2 en vortex voor aliquotting 60 ul van dit mengsel een lege put in de plaat met 96 putjes en etikettering als controle. </li><li> Plaats de plaat in een 37 ° C incubator uitharden ten minste 1 uur. </li></ol> 3. Construct Grid van Bemonsteringspunten en Neem een ​​video op elk punt <ol><li> Breng het monster plaat uit de incubator aan de microscoop podium. Laat 10 min voor het monster te equilibrate de kamertemperatuur wanneer een verwarmde stadium niet beschikbaar. </li><li> Let op de monster met laag vermogen objectief lenzen om zeker te zijn is intact en klaar voor de beeldvorming. Bepaal de tumor positie binnen de put. </li><li> Beslissen hoeveel meetpunten te nemen. Meestal zal de 20 meetpunten in elk putje, verdeeld in concentrische ringen rond de bolvormige voldoende gedetailleerde resultaten te produceren. </li><li> Verplaats de fase op elke gewenste positie gebruiken microscoop interface software om de x en y coördinaten (of opnemen coördinaten handmatig als interface software niet beschikbaar) opnemen. </li><li> Schakel de microscoop om een ​​hoog aangedreven objectief (meestal 100X), en selecteer de juiste filter kubus voor de golflengte van de tracer sondes. Gebruik de lijst van punten gemaakt in stap 3.4 om naar het eerste punt in het net. </li><li> Pas de focus naar de bodem van de put te vinden, dan omhoog naar een gezichtsveld (FOV) met meerdere in-focus trac vindener probes. </li><li> Let op de intensiteit histogram en de belichting in intensiteit en tijd om de grootste dynamisch bereik mogelijk met dien verstande dat het beeld niet verzadigd raken. </li><li> Het verkrijgen van een video sequentie bij een framerate van 20-30 msec per frame (ongeveer 800 frames of 16-24 sec in lengte wordt aanbevolen om voldoende statistische gegevens voor robuuste MSD berekening evenwicht met de noodzaak voor het minimaliseren van acquisitie tijd op elke ruimtelijke roosterpunt bieden) en slaan met een passende overeenkomst. Tijdens de opname, hoeft de microscoop of tafel niet aan. </li><li> Herhaal stap 3,6-3,9 voor elk monsterpunt in het raster. </li><li> Herhaal stap 3,3-3,10 voor elke wel in het experiment. </li></ol> 4. Analyseer videogegevens Bereken reologische eigenschappen van elk monster Point <ol><li> Kopieer alle videogegevens een analyse-map (eventueel op een andere computer). </li><li> Beeldgegevens importeren in MATLAB of andere analyse software. NOTE: Uitgebreide documentatie met betrekking tot de set van MATLAB hier aangenomen deeltje volgen routines is beschikbaar op <a href="http://people.umass.edu/kilfoil/">http://people.umass.edu/kilfoil</a> . Het gebruik van een aangepaste aanroepende functie voor het automatisch verwerken van meerdere bestanden op verschillende posities wordt aanbevolen. </li><li> Kalibreer de software door het analyseren van verschillende frames van de video om adequaat te bepalen selectie en afwijzing parameters (grootte, bandpass, etc.) voor het identificeren sonde center posities. Uitgebreide achtergrond voor deze cruciale stappen wordt beschreven door Crocker en Grier. </li><li> Gebruik de software om elke probe positie voor alle videobeelden automatisch te bepalen en vervolgens deze posities ook in trajecten. </li><li> Gebruik de baangegevens de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) berekenen als functie van de vertraging, waarbij u de geschikte ruimtelijke kalibratiefactor (micrometer per pixel) Voor het specifiek objectieflens elke pixel binning, enz. (gewoonlijk uitgevoerdmeta-data). </li><li> Bereken G * (met behulp van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein relatie rekening gehouden met de grenzen van de toepasbaarheid van GSER voor een bepaald monster 24,28,43. Alternatief gebruikers willen ECM eigenschappen rechtstreeks van MSD interpreteren door eenvoudig de macht wet schaalvergroting, plateau waarden, indexen van heterogeniteit of andere parameters. </li><li> Herhaal stap 4.2 tot 4.6 voor elke FOV in het experiment. </li><li> Positiegegevens co-register uit stap 3.4 met visco-elastische modulii op een bepaalde frequentie van belang. Afhankelijk van de fabrikant van de gebruikte microscoop, kan deze stap worden vergemakkelijkt door een aangepaste routine die microscoop metagegevens of positiegegevens handmatig worden getabelleerd leest. </li><li> Gebruik 3D-interpolatie functies om een ​​ruimtelijke reologie kaart van de ECM te genereren. </li></ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit protocol introduceren we een robuuste en breed toepasbare strategie voor het longitudinaal volgen van lokale veranderingen in de ECM stijfheid in 3D tumor modellen. Wij voorzien dat deze methodologie door kanker biologen en biofysici geïnteresseerd in mechanosensitive gedrag betrokken bij matrix remodeling tijdens tumorgroei en invasie processen kan worden aangenomen. Precieze kwantificering van matrix afbraakkinetiek kan bijzonder waardevol zijn om die het bestuderen van de activiteit van matrixmetalloproteases,...

Uit een groeiende hoeveelheid bewijs in de literatuur dat kankercellen, zoals met niet-maligne zoogdiercellen epitheelcellen, zijn zeer gevoelig voor de mechanische en biofysische eigenschappen van de omringende extracellulaire matrix (ECM) en andere micro componenten 1-9. Elegant mechanistische studies hebben inzichten in de rol van extracellulaire stijfheid als een complex mechanosensitive signalering partner die kwaadaardige groei en de morfogenese 2,3,10,11 regelt. Dit werk is in het bijzonder bevorderd door de ontwikkeling van 3D in vitro tumormodellen die biologisch opnieuw relevant weefselarchitectuur en kunnen worden gekweekt in scaffold materialen met instelbare mechanica en afgebeeld door optische microscopie 12-19. De andere zijde van deze mechanoregulatory dialoog tussen tumor en micro waardoor kankercellen beurt de reologie van hun omgeving te wijzigen, ietwatmoeilijker te bestuderen. Bijvoorbeeld, tijdens invasieprocessen cellen aan de omtrek van een tumor kan ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en verhoging expressie van matrix metalloproteasen (MMP&#39;s) die plaatselijke afbraak van ECM 20-22, die van invloed mechanosensitive groei gedrag veroorzaken andere proximale tumorcellen. Via allerlei biochemische processen, kankercellen voortdurend bellen de lokale stijfheid van hun omgeving op en neer om verschillende processen aan te passen op verschillende tijdstippen. De hier beschreven methode is ingegeven door de behoefte aan analytische instrumenten die lokale veranderingen in de stijfheid en de naleving van de ECM tijdens de groei, die kan worden geïntegreerd met 3D tumor modellen en lengterichting gecorreleerd met biochemische en fenotypische veranderingen zonder beëindiging van de cultuur te melden. Op zoek naar een geschikte techniek te implementeren in deze context, particle-tracking-microrheology (PTM) naar voren als een sterke kandidaat.Deze methode, bereidde aanvankelijk door Mason en Weitz 23,24, gebruikt de beweging van tracer probes ingebed in een complex fluïdum de frequentieafhankelijke complexe viscoelastische afschuifmodulus G * (ω) melden bij micron lengteschalen. Deze algemene benadering is ontwikkeld met meerdere variaties geschikt voor verschillende toepassingen in zachte gecondenseerde materie, colloïden, biofysica en polymeerfysica 25-31. PTM heeft bepaalde voordelen boven andere werkwijzen, aangezien uitlezingen lokale visco-elasticiteit worden door niet-destructieve beeldvorming van video biochemisch actieve tracer probes die zijn opgenomen bij de bereiding en de plaats blijft gedurende langere perioden van groei. Dit in tegenstelling tot de gouden standaard metingen met een oscillerende shear bulk reometer, die noodzakelijkerwijs beëindiging van de kweek en rapporteert de grootste macroscopische reologie van het monster plaats puntmetingen in het complex 3D tumor microenvirlieu. Inderdaad een aantal studies hebben illustreerde het nut van uitlegging metingen van bewegingen verklikstof peilstift in of rond kanker of niet-kankercellen te vervormingen geassocieerd met celmigratie 32, mechanische stress veroorzaakt door een expanderende sferoïde 33, intracellulaire reologie 34,35 meten, en om mechanische belastingen in gemanipuleerde weefsels 36, en de relatie tussen poriegrootte en invasie snelheid: 37 kaart. Andere technieken voor microrheology zoals atomaire kracht microscopie (AFM) kan worden uitgevoerd, maar hoofdzakelijk voor tasten op het monsteroppervlak en kunnen ook cultuur steriliteit dat longitudinale metingen compliceren 38 vormen. We beschrijven hier een uitgebreid protocol omvat methoden voor de groei van 3D bolvormige tumoren geschikt voor overdracht in ECM met ingebouwde fluorescerende probes voor video particle-tracking en analysemethoden voor het betrouwbaar in kaart brengen van ruimtelijkeveranderingen in microrheology loop van de tijd in cultuur. In de onderhavige uitvoering worden 3D tumormodellen gekweekt in meerdere putjes formaat met een uitzicht op integratie van microrheology metingen met andere traditionele testen (bijvoorbeeld cytotoxiciteit) die dit formaat is bevorderlijk. In deze representatieve illustratie van deze methodologie we cultuur in vitro 3D sferoïden met PANC-1 cellen, een gevestigde pancreaskanker cellijn bekend sferoïden 39, maar alle metingen hierin beschreven vormen zijn breed toepasbaar te bestuderen van vaste tumoren met verschillende cellijnen geschikt voor 3D-cultuur. Omdat deze methode wordt inherent beeldvorming-gebaseerde het wordt bij uitstek geschikt voor co-registratie van microrheology data met grote doorvallend-lichtvelden van mening dat veranderingen in de groei cel, migratie en fenotype rapporteren hoge-resolutie. De implementatie van PTM geïntegreerd met doorvallend licht microscopie op deze manier veronderstelt reproduceerbare positionering van de microscoop podium which is typisch beschikbaar op gemotoriseerde commerciële Widefield epifluorescentie biologische microscopen. Het onderstaande protocol ontwikkeld kan worden uitgevoerd met elk redelijk uitgerust geautomatiseerde fluorescentie biologische microscoop. Dit is een inherent data-intensieve methode, die verwerving van gigabyte digitale video-microscopie gegevens voor offline verwerking vereist. In het volgende protocol Protocol 1 betrekking op de initiële bereiding van bolvormige tumoren die hier beschreven middels agarose overlay maar kan worden gesubstitueerd met een verscheidenheid aan andere methoden, zoals opknoping druppel 40 of roterende cultuur 41 technieken. Protocol 2 beschrijft het proces om sferoïden in een collageen steiger hoewel alternatief kunnen in vitro 3D tumoren worden geteeld door het inkapselen en insluiten van cellen geresuspendeerd in ECM 12,15, in plaats van enkele voorgevormde niet-hechtende sferoïden. Bijbehorende protocollen beschrijven procedures voor obtaining tijdsopgeloste microrheology metingen door het verwerven en verwerken van video microscopie data, respectievelijk. Gegevensverwerking beschreven MATLAB, maken gebruik van open source routines voor PTM gebaseerd op algoritmen oorspronkelijk beschreven door Crocker en Grier 42, die ook uitgebreid ontwikkeld voor verschillende software platforms (zie http://www.physics.emory.edu/ ~ weken / IDL /).

<table><tbody><tr><td>Bovine type 1 collageen</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>American Type Cell Culture, Manassas, VA</td><td>CRL1469</td><td>of andere geschikte celtype</td></tr><tr><td>Fluorescente microspheres</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td>906906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences, Bedford, MA</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>C12H18O9</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Bioreagents, Waltham, MA</td><td>NC0480985</td><td></td></tr><tr><td>96-well beeldplaten</td><td>Corning Inc., Corning, NY</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone, Waltham, MA</td><td>SH30243.01</td><td>of geschikte celkweekmedia</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObsever Microscoop</td><td>Zeiss, Oberkochen, Duitsland</td><td></td><td>inclusief high-speed camera en beeldsoftware</td></tr><tr><td>MATLAB software</td><td>The Mathworks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

longitudinale meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3d tumor modellen met-particle tracking microreologie

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

De mechanische micro is getoond om als cruciale regulator van tumorgroei gedrag en signalering, die zelf is gerenoveerd en aangepast als onderdeel van een reeks van complexe, tweezijdige mechanosensitive interacties. Terwijl de ontwikkeling van biologisch relevante 3D tumormodellen mechanistische studies over het effect van matrix reologie op tumorgroei hebben vergemakkelijkt, het inverse probleem in kaart brengen van veranderingen in de mechanische omgeving veroorzaakt door tumoren blijft uitdagend. Hier beschrijven we de toepassing van deeltjes volgen microrheology (PTM) in combinatie met 3D-modellen van pancreaskanker als onderdeel van een robuuste en levensvatbare oplossing voor longitudinaal meten van fysische veranderingen in de tumor micro-omgeving in situ. De hier beschreven methode integreert een systeem voor het bereiden van in vitro 3D-modellen ingebed in een model extracellulaire matrix (ECM) steiger van type I collageen met fluorescent gelabelde probes gelijkmatig verspreid poling-en tijdsafhankelijke microrheology metingen in de hele specimen. In vitro tumoren worden verzilverd en gemerkt parallel omstandigheden met behulp multiwell beeldverwerkingsplaten. Op basis van gevestigde methoden, worden video&#39;s van tracer sonde bewegingen omgezet via de gegeneraliseerde Stokes Einstein Relatie (GSER) om de complexe frequentie-afhankelijke visco-elastische shear modulus, G * (ω) melden. Omdat deze aanpak is op basis van beeldvormingstechnieken, wordt de mechanische karakterisering ook afgebeeld op grote uitgezonden licht ruimtelijke velden zich gelijktijdig kwalitatieve veranderingen in 3D tumorgrootte en fenotype. Representatieve resultaten tonen contrasterende mechanische respons in de subregio&#39;s in verband met gelokaliseerde-invasie veroorzaakte matrixafbraak evenals kalibratie van het systeem, zijn validatie data gepresenteerd. Ongewenste uitkomsten van gemeenschappelijke experimentele fouten en oplossen van deze problemen worden ook gepresenteerd. De 96-well 3D cultuur plating formaat in dit protocol geïmplementeerd is conducive om correlatie van microrheology metingen met therapeutische screeningstesten of moleculaire beeldvorming tot nieuwe inzichten in effecten van behandelingen of biochemische stimuli op de mechanische micro-omgeving te krijgen.

Om de geldigheid van G * (ω) metingen bij gelokaliseerde posities binnen een complex model tumormicromilieu controleren werden twee eerste validatie-experimenten uitgevoerd. Ten eerste, we wilden onze metingen te valideren tegen de &quot;gouden standaard&quot; van bulk oscillerende shear reometrie. We bereidden identieke monsters van collageen matrix (zonder cellen) in een concentratie van 1,0 mg / ml collageen. Deze monsters werden onderzocht met een bulk reometer (TA Instruments AR-G2, met 40 mm parallelle pl...

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van longitudinale veranderingen in de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix in driedimensionale kankermodellen. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen te oogsten en het tumorsferoïde via een geschikte methode te laten groeien totdat de gewenste grootte is bereikt. De tweede stap bestaat uit het inbedden van het tumorsferoïde in collageen of een andere geschikte extracellulaire matrix.Vervolgens wordt het raster van monsterpunten geconstrueerd en wordt op elk punt een video opgenomen. De laatste stap is het analyseren van de videodata en het berekenen en coregistreren van reële logische eigenschappen op elk ruimtelijk punt. Uiteindelijk gebruikt dit protocol de analyse van tracer-probe-trajecten om ruimtelijke veranderingen in de mechanica van de extracellulaire matrix op een niet-destructieve manier longitudinaal te kwantificeren.Het idee is dat door beeldvormingsgebaseerde metingen van radiologie van de extracellulaire matrix te combineren met in vitro 3D-tumormodellen, die interacties van de extracellulaire matrix herstellen, deze benadering kwantitatieve inzichten kan bieden in tijdsafhankelijke veranderingen in de mechanische micro-omgeving die gepaard gaan met tumorgroei, invasieprocessen en de respons op behandeling. De in deze video getoonde methode hanteert een aros-overlaybenadering om niet-adherente 3D-OID's te genereren vanuit de gevestigde pancreaskanker-cellijn pan one. Meng ter begin 10 milliliters celcultuurwater met 0,1 gram aros om een 1% aros-oplossing te verkrijgen.Verwarm de aros-oplossing tot boven de 70 °C vóór het aliquoteren. Pipetteer 40 µL van de oplossing in elke put van een 96-wells plaat en incubeer de plaat één uur bij 37 °C. Oogst de kankercellen via trypsinisatie en bereid een suspensie van enkelvoudige cellen voordat de celsuspensie wordt verdund tot 1000 cellen per mL. Voeg 100 µL van deze verdunning toe aan de put met het uitgeharde aros-bed.Plaats het monster na incubatie gedurende de nacht op een schudapparaat in een incubator ingesteld op 37 °C en 5%CO2. Haal het monster van het schudapparaat, voeg 100 µL celkweekmedium toe en incubeer het resulterende organoïde totdat de gewenste diameter is bereikt. Na negen dagen zal een organoïde bijvoorbeeld een diameter van ongeveer 450 µm hebben.Begin met het inrichten van een werkstation in een laminaire flowkast met twee vials van twee milliliter. Vial één bevat het tumorsteroïde en vial twee dient als celvrije controle. Bereid een verdunde mengeling van carboxylaat-gemodificeerde fluorescente tracer-probes met een diameter van één micron door twee delen stock-probes toe te voegen aan 25 delen steriel water.Haal een flesje rundercollageen (3,1 mg/mL) uit de koelkast en plaats deze op ijs. Aliquoteer 125 µL collageen, gevolgd door 50 µL verdunde tracer-probe-oplossing, in buisje één en vortex kort om de probes te distribueren. Voeg vervolgens 235 µL van het geschikte celkweekmedium met fenolrood toe voor een totaalvolume van 410 µL en vortex kort voordat u 205 µL verwijdert en in buisje twee plaatst. Voeg daarna ongeveer 2 µL van 1 M natriumhydroxide toe aan het buisje.Zodra de oplossing terug is naar een neutrale pH, kortstondig vortexen om te mengen. Plaats het mengsel vervolgens onmiddellijk terug in het ijsrek om te voorkomen dat het uithardingsproces begint. Verwijder voorzichtig 40 µL medium uit de put met het tumorsteroïde.Bewaar deze 40 µL tijdens het uitvoeren van de volgende stap. Controleer de well om te zien of het steroïd in de vorige stap is verwijderd. Zo niet, plaats de 40 µL terug in de well en herhaal de vorige stap.Indien dit het geval was, voeg dan de 40 µL met het steroïd toe aan het vial. Roer het vial voorzichtig om voordat het mengsel in porties van 60 µL over drie afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat wordt overgebracht; inspecteer elk putje met een microscoop na het toevoegen van het mengsel om te bepalen welk putje het steroïd bevat. Voeg vervolgens ongeveer 2 µL van 1 M natriumhydroxide en 40 µL celkweekmedium toe aan vial twee en vortex voordat u deze overbrengt.Pipetteer 60 µL van dit mengsel in een lege well van de 96-well plaat en label deze als celvrije controle. Plaats de plaat in een incubator op 37 °C om gedurende ten minste één uur te harden voor het maken van een raster van monsterpunten. Verplaats vervolgens de monsterplaat van de incubator naar de microscooptafel.Laat het monster 10 minuten equilibreren naar kamertemperatuur als er geen verwarmde tafel beschikbaar is. Observeer het monster met objectieven met een lage vergroting om er zeker van te zijn dat het intact is en klaar is voor beeldvorming. Bepaal de positie van de tumor in de well en leg dit vast met een transmissiebeeld voor daaropvolgende ruimtelijke co-registratie.Doorgaans zullen 20 monsterpunten in elke put, verdeeld in concentrische ringen rond de S-sferoïde, voldoende gedetailleerde resultaten opleveren. Verplaats de tafel naar elke gewenste positie en gebruik de interface-software van de microscoop om de XNY-coördinaten te registreren. Schakel de microscoop over naar een objectief met een hoge vergroting en selecteer de juiste filterkubus voor de excitatiegolflengte van de tracer-probes.Ga, met behulp van de lijst met aangemaakte punten, naar het eerste punt in het raster. Pas de focus aan om de bodem van de well te vinden voordat u omhoog beweegt. Zoek naar een gezichtsveld waarin meerdere tracer-probes in focus zijn.Observeer het intensiteitshistogram en pas de belichtingsintensiteit en -tijd aan om het grootst mogelijke dynamische bereik te verkrijgen, terwijl wordt gewaarborgd dat het beeld niet verzadigd raakt. Neem een videosequentie op met een framerate van 20 tot 30 milliseconden per frame en sla deze op volgens een passende naamgevingsconventie. Raak de microscoop of de tafel tijdens de opname niet aan.Herhaal de opname voor elk monsterpunt in het raster. Herhaal vervolgens dit proces om voor elke well in het experiment een raster te construeren en voer het gehele proces opnieuw uit voor elk tijdstip gedurende de longitudinale monitoring.Om met de data-analyse te beginnen: kopieer alle videodata naar een analysemap. Importeer de beeldata in MATLAB of een andere analyse-software.Kalibreer de software door verschillende frames van de video te analyseren om de selectie- en rejectieparameters voor het identificeren van de middenposities van de probes correct te bepalen. Gebruik vervolgens de software om de positie van elke probe voor alle videoframes automatisch te bepalen en koppel deze posities vervolgens tot trajecten. Gebruik de trajectgegevens om de gemiddelde kwadratische verplaatsing of MSD te berekenen als functie van de vertragingstijd, waarbij u erop let dat de juiste ruimtelijke kalibratiefactor wordt toegepast voor de specifieke objectieflens of voor eventuele pixel-binning.Bereken G Star met behulp van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein-relatie, rekening houdend met de toepasbaarheidsgrenzen van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein-relatie voor een specifiek monster. Herhaal de analysestappen voor elk gezichtsveld in het experiment. Coregistreer de positiedata met de visco-elastische modulus I bij een specifieke frequentie van belang, afhankelijk van de fabrikant van de gebruikte microscoop.Deze stap kan worden vergemakkelijkt door een aangepaste routine die microscoopmetadata uitleest, of positiegegevens kunnen handmatig worden getabelleerd. Videosequenties worden verkregen op meerdere ruimtelijke posities binnen een representatieve well met een 3D-tumorknobbeltje en worden aan elkaar gekoppeld om een ruimtelijke microradiologiekaart van het monster te verkrijgen wanneer celpopulaties aan de periferie van de pan longitudinaal worden gemonitord. De steroïden die in dit voorbeeld worden gebruikt, zullen spontaan de omringende collageenvezels afbreken en binnen enkele dagen binnendringen in de extracellulaire matrix.In dit voorbeeld biedt co-registratie van microscopie een kwantitatieve uitlezing van de duidelijke invasie in de matrix die links van het steroïde plaatsvindt, maar niet rechts ervan. Longitudinale monitoring van deze verschillende ruimtelijke regio's laat een daling zien in het reële component van de complexe visco-elastische schuifmodulus van ongeveer vier grootteordes, gelijktijdig met de invasie. De volledige frequentieafhankelijke gegevens tonen het contrast in reologische eigenschappen van het materiaal in regio één en regio twee op dag vier.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om veelvoorkomende valkuilen bij de analyse van sondetrajecten te vermijden, die tot onjuiste conclusen kunnen leiden. Wij moedigen lezers aan om te refereren naar de hier geciteerde PTM-literatuur, waarin overwegingen zoals monsterdrift en de interpretatie van heterogeniteit worden behandeld. Deze procedure kan worden gecombineerd met aanvullende longitudinale of terminale fluorescentie-imaging om andere vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop mechanische remodellering correleert met belangrijke signaleringsgebeurtenissen of de cytotoxische respons op een interventie.

longitudinal-measurement-extracellular-matrix-rigidity-3d-tumor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

This protocol describes a technique for monitoring extracellular matrix rigidity changes by using particle-tracking microrheology (PTM). This is done by culturing 3D pancreatic tumor spheroids into ECM with embedded fluorescent probes for video particle-tracking and analysis.

PTM Based Tumor Microenvironment Monitoring: A Method for Tracking Changes in ECM Rigidity Using Tumor Spheroids

This video showcases quantitative time-lapse microscopy for evaluating extracellular matrix stiffness-dependent Listeria monocytogenes dissemination through endothelial cells. A softer hydrogel facilitates faster bacterial dissemination through endothelial cells compared to stiffer counterparts, highlighting the influence of matrix stiffness on bacterial dissemination.

Quantitative Time-Lapse Microscopy for Assessing Extracellular Matrix Stiffness-Dependent Bacterial Dissemination

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Deeltjesvolg-microreologie onderzoekt de viscoëlasticiteit van materialen. Hier wordt de techniek gebruikt om de viscoëlasticiteit, creep-compliantie en effectieve crosslinking-rollen van verschillende matrixcomponenten van een bacteriële biofilm te bepalen. De matrix bestaat uit polymere stoffen die door de bacteriën worden uitgescheiden en de componenten bepalen de structuur en mechanische eigenschappen van de biofilm.

In Situ Mapping van de mechanische eigenschappen van Biofilms per Particle volgen Microreologie

Hier leggen we een protocol voor het modelleren van de biofysische micro-omgeving waar de verknoping en verhoogde stijfheid van het basaal membraan (BM) geïnduceerd door geavanceerde glycatie eindproducten (AGE's) heeft pathologische relevantie.

Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

We hebben een multi goed formaat polyacrylamide gebaseerde assay voor het effect van extracellulaire matrix stijfheid op bacteriële infectie van Adherente cellen indringende ontwikkeld. Deze test is compatibel met stroom cytometry immunokleuring en tractie kracht microscopie, waardoor voor kwantitatieve metingen van de biomechanische interacties tussen cellen, hun extracellulaire matrix en pathogene bacteriën.

Een multi goed formaat Polyacrylamide gebaseerde Assay voor het bestuderen van het Effect van extracellulaire Matrix stijfheid op de bacteriële infectie van Adherente cellen

Optische coherentie tomografie (OCT), een driedimensionale imaging technologie, werd gebruikt om te controleren en te karakteriseren de kinetiek van de groei van meercellige tumor spheroïden. Precieze volumetrische kwantificering van tumor spheroïden met behulp van een voxel tellen aanpak, en label-vrije dood weefsel detectie in de spheroïden op basis van intrinsieke optische demping daarentegen werden gedemonstreerd.

Longitudinale morfologische en fysiologische Monitoring van driedimensionale Tumor spheroïden met behulp van optische coherentie tomografie

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Leer longitudinale meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D tumor modellen met particle-tracking microreologie. Deze niet-destructieve methode kwantificeert ruimtelijke veranderingen in mechanische eigenschappen tijdens tumorprogressie.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Meer video's verkennen