Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Het algemene doel van deze procedure is het meten van longitudinale veranderingen in de mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix in driedimensionale kankermodellen. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen te oogsten en het tumorsferoïde via een geschikte methode te laten groeien totdat de gewenste grootte is bereikt. De tweede stap bestaat uit het inbedden van het tumorsferoïde in collageen of een andere geschikte extracellulaire matrix.

Vervolgens wordt het raster van monsterpunten geconstrueerd en wordt op elk punt een video opgenomen. De laatste stap is het analyseren van de videodata en het berekenen en coregistreren van reële logische eigenschappen op elk ruimtelijk punt. Uiteindelijk gebruikt dit protocol de analyse van tracer-probe-trajecten om ruimtelijke veranderingen in de mechanica van de extracellulaire matrix op een niet-destructieve manier longitudinaal te kwantificeren.

Het idee is dat door beeldvormingsgebaseerde metingen van radiologie van de extracellulaire matrix te combineren met in vitro 3D-tumormodellen, die interacties van de extracellulaire matrix herstellen, deze benadering kwantitatieve inzichten kan bieden in tijdsafhankelijke veranderingen in de mechanische micro-omgeving die gepaard gaan met tumorgroei, invasieprocessen en de respons op behandeling. De in deze video getoonde methode hanteert een aros-overlaybenadering om niet-adherente 3D-OID's te genereren vanuit de gevestigde pancreaskanker-cellijn pan one. Meng ter begin 10 milliliters celcultuurwater met 0,1 gram aros om een 1% aros-oplossing te verkrijgen.

Verwarm de aros-oplossing tot boven de 70 °C vóór het aliquoteren. Pipetteer 40 µL van de oplossing in elke put van een 96-wells plaat en incubeer de plaat één uur bij 37 °C. Oogst de kankercellen via trypsinisatie en bereid een suspensie van enkelvoudige cellen voordat de celsuspensie wordt verdund tot 1000 cellen per mL. Voeg 100 µL van deze verdunning toe aan de put met het uitgeharde aros-bed.

Plaats het monster na incubatie gedurende de nacht op een schudapparaat in een incubator ingesteld op 37 °C en 5%CO2. Haal het monster van het schudapparaat, voeg 100 µL celkweekmedium toe en incubeer het resulterende organoïde totdat de gewenste diameter is bereikt. Na negen dagen zal een organoïde bijvoorbeeld een diameter van ongeveer 450 µm hebben.

Begin met het inrichten van een werkstation in een laminaire flowkast met twee vials van twee milliliter. Vial één bevat het tumorsteroïde en vial twee dient als celvrije controle. Bereid een verdunde mengeling van carboxylaat-gemodificeerde fluorescente tracer-probes met een diameter van één micron door twee delen stock-probes toe te voegen aan 25 delen steriel water.

Haal een flesje rundercollageen (3,1 mg/mL) uit de koelkast en plaats deze op ijs. Aliquoteer 125 µL collageen, gevolgd door 50 µL verdunde tracer-probe-oplossing, in buisje één en vortex kort om de probes te distribueren. Voeg vervolgens 235 µL van het geschikte celkweekmedium met fenolrood toe voor een totaalvolume van 410 µL en vortex kort voordat u 205 µL verwijdert en in buisje twee plaatst. Voeg daarna ongeveer 2 µL van 1 M natriumhydroxide toe aan het buisje.

Zodra de oplossing terug is naar een neutrale pH, kortstondig vortexen om te mengen. Plaats het mengsel vervolgens onmiddellijk terug in het ijsrek om te voorkomen dat het uithardingsproces begint. Verwijder voorzichtig 40 µL medium uit de put met het tumorsteroïde.

Bewaar deze 40 µL tijdens het uitvoeren van de volgende stap. Controleer de well om te zien of het steroïd in de vorige stap is verwijderd. Zo niet, plaats de 40 µL terug in de well en herhaal de vorige stap.

Indien dit het geval was, voeg dan de 40 µL met het steroïd toe aan het vial. Roer het vial voorzichtig om voordat het mengsel in porties van 60 µL over drie afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat wordt overgebracht; inspecteer elk putje met een microscoop na het toevoegen van het mengsel om te bepalen welk putje het steroïd bevat. Voeg vervolgens ongeveer 2 µL van 1 M natriumhydroxide en 40 µL celkweekmedium toe aan vial twee en vortex voordat u deze overbrengt.

Pipetteer 60 µL van dit mengsel in een lege well van de 96-well plaat en label deze als celvrije controle. Plaats de plaat in een incubator op 37 °C om gedurende ten minste één uur te harden voor het maken van een raster van monsterpunten. Verplaats vervolgens de monsterplaat van de incubator naar de microscooptafel.

Laat het monster 10 minuten equilibreren naar kamertemperatuur als er geen verwarmde tafel beschikbaar is. Observeer het monster met objectieven met een lage vergroting om er zeker van te zijn dat het intact is en klaar is voor beeldvorming. Bepaal de positie van de tumor in de well en leg dit vast met een transmissiebeeld voor daaropvolgende ruimtelijke co-registratie.

Doorgaans zullen 20 monsterpunten in elke put, verdeeld in concentrische ringen rond de S-sferoïde, voldoende gedetailleerde resultaten opleveren. Verplaats de tafel naar elke gewenste positie en gebruik de interface-software van de microscoop om de XNY-coördinaten te registreren. Schakel de microscoop over naar een objectief met een hoge vergroting en selecteer de juiste filterkubus voor de excitatiegolflengte van de tracer-probes.

Ga, met behulp van de lijst met aangemaakte punten, naar het eerste punt in het raster. Pas de focus aan om de bodem van de well te vinden voordat u omhoog beweegt. Zoek naar een gezichtsveld waarin meerdere tracer-probes in focus zijn.

Observeer het intensiteitshistogram en pas de belichtingsintensiteit en -tijd aan om het grootst mogelijke dynamische bereik te verkrijgen, terwijl wordt gewaarborgd dat het beeld niet verzadigd raakt. Neem een videosequentie op met een framerate van 20 tot 30 milliseconden per frame en sla deze op volgens een passende naamgevingsconventie. Raak de microscoop of de tafel tijdens de opname niet aan.

Herhaal de opname voor elk monsterpunt in het raster. Herhaal vervolgens dit proces om voor elke well in het experiment een raster te construeren en voer het gehele proces opnieuw uit voor elk tijdstip gedurende de longitudinale monitoring.

Om met de data-analyse te beginnen: kopieer alle videodata naar een analysemap. Importeer de beeldata in MATLAB of een andere analyse-software.

Kalibreer de software door verschillende frames van de video te analyseren om de selectie- en rejectieparameters voor het identificeren van de middenposities van de probes correct te bepalen. Gebruik vervolgens de software om de positie van elke probe voor alle videoframes automatisch te bepalen en koppel deze posities vervolgens tot trajecten. Gebruik de trajectgegevens om de gemiddelde kwadratische verplaatsing of MSD te berekenen als functie van de vertragingstijd, waarbij u erop let dat de juiste ruimtelijke kalibratiefactor wordt toegepast voor de specifieke objectieflens of voor eventuele pixel-binning.

Bereken G Star met behulp van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein-relatie, rekening houdend met de toepasbaarheidsgrenzen van de gegeneraliseerde Stokes-Einstein-relatie voor een specifiek monster. Herhaal de analysestappen voor elk gezichtsveld in het experiment. Coregistreer de positiedata met de visco-elastische modulus I bij een specifieke frequentie van belang, afhankelijk van de fabrikant van de gebruikte microscoop.

Deze stap kan worden vergemakkelijkt door een aangepaste routine die microscoopmetadata uitleest, of positiegegevens kunnen handmatig worden getabelleerd. Videosequenties worden verkregen op meerdere ruimtelijke posities binnen een representatieve well met een 3D-tumorknobbeltje en worden aan elkaar gekoppeld om een ruimtelijke microradiologiekaart van het monster te verkrijgen wanneer celpopulaties aan de periferie van de pan longitudinaal worden gemonitord. De steroïden die in dit voorbeeld worden gebruikt, zullen spontaan de omringende collageenvezels afbreken en binnen enkele dagen binnendringen in de extracellulaire matrix.

In dit voorbeeld biedt co-registratie van microscopie een kwantitatieve uitlezing van de duidelijke invasie in de matrix die links van het steroïde plaatsvindt, maar niet rechts ervan. Longitudinale monitoring van deze verschillende ruimtelijke regio's laat een daling zien in het reële component van de complexe visco-elastische schuifmodulus van ongeveer vier grootteordes, gelijktijdig met de invasie. De volledige frequentieafhankelijke gegevens tonen het contrast in reologische eigenschappen van het materiaal in regio één en regio twee op dag vier.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat er voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om veelvoorkomende valkuilen bij de analyse van sondetrajecten te vermijden, die tot onjuiste conclusen kunnen leiden. Wij moedigen lezers aan om te refereren naar de hier geciteerde PTM-literatuur, waarin overwegingen zoals monsterdrift en de interpretatie van heterogeniteit worden behandeld. Deze procedure kan worden gecombineerd met aanvullende longitudinale of terminale fluorescentie-imaging om andere vragen te beantwoorden, zoals de manier waarop mechanische remodellering correleert met belangrijke signaleringsgebeurtenissen of de cytotoxische respons op een interventie.