Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Het algemene doel van deze video is om een multiplex assay met een hoge output te demonstreren om het begin van apoptose te bepalen, gemeten aan de hand van caspase-3,7. Eerst worden hypothalamische neuronen blootgesteld aan het apoptose-inducerende verzadigde vetzuur palmitinezuur.

Vervolgens wordt de levensvatbaarheid van de neuronen gemeten met behulp van een fluorescent reagens en een microplaatlezer na het begin van apoptose. Het luminescente substraat, DEVD, een aminozuurvolgorde die door caspase 3 wordt gesplitst, wordt aan de cellen toegevoegd. De laatste stap van de procedure is het meten van de luminescentie met een microplaatlezer om de caspase-activiteit te bepalen, welke toeneemt in cellen die apoptose ondergaan.

Uiteindelijk kan een ratio van caspase-activiteit per levensvatbare cel in minder dan vijf tot zes uur worden bepaald, in een 96-well formaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals western blots of lysis, is dat het een snelle, goedkope assay is waarmee caspase-3/7-activiteit direct in meerdere well-formaten kan worden gemeten.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied, zoals het bepalen van primaire modulatoren van apoptose. Het nut van deze techniek is dat deze multiplexing kan worden gebruikt als een nauwkeurige methode voor het beoordelen van cytotoxiciteit en viabiliteit. Hoewel de assay vrij eenvoudig is, is een visuele demonstratie van deze methode essentieel om te waarborgen dat de assay succesvol wordt voltooid.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in neurodegeneratie, kan ze ook worden toegepast op andere ziekten en in vitro-modellen, zoals die welke in kankeronderzoek worden gebruikt. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen deze techniek moeten optimaliseren, aangezien de eindpunten afhankelijk zijn van de cellijn en de agonist. De caspase 3/7-activiteit is transiënt.

Afhankelijk van de effectiviteit van de celstressfactor kan het bepalen van het juiste tijdstip voor het analyseren van de caspase-activiteit daarom enige inspanning vergen. Begin hiermee door bevroren A12-cellen snel te ontdooien in een waterbad van 37 °C. Pipetteer de ontdooide cellen voorzichtig in een geventileerde kweekfles van 75 cm² en voeg 10 mL warm DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) toe; incubeer de fles gedurende één nacht in een incubator met 5% koolstofdioxide bij 37 °C.

Haspireer na 24 uur het medium en vervang dit door vers medium; de cellen kunnen verder groeien tot er na twee tot drie dagen groei een confluentie van 70 tot 80% is bereikt. Om de cellen te tellen, worden DMEM en een 1x trypsine-EDTA-oplossing eerst opgewarmd tot 37 °C. Haspireer het medium uit de kolf en was deze twee keer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Voeg 500 µL tryine-oplossing toe vóór het incuberen bij 37 °C gedurende twee tot vijf minuten. Los de cellen van de fles los met een scraper en suspendeer de cellen in 5 mL medium. Leid de cellen door een cellzeef in een schone kolf van 50 mL.

Het kan noodzakelijk zijn om de cellen meer dan één keer door de zeef te halen, maar herhaal dit niet meer dan drie keer nadat de cellen met een hemocytometer zijn geteld. Zaai 6.000 cellen per well in een clear bottom zwarte of witwandige 96-well plaat in een eindvolume van 100 µL medium en incubeer de plaat bij 5% CO2 en 37 °C gedurende 24 uur. Breng palmitinezuur over naar een steriel glazen flesje van 5 mL en solubiliseer dit in 100% DMSO.

Nadat de palmitinezuur-stockoplossing 1:10 is verdund in DMSO, wordt deze toegevoegd aan VOORVERWARMD DMEM om een uiteindelijke werconcentratie van 0,1 millimolaire palmitinezuur voor controlemedia te verkrijgen; voeg dezelfde concentratie DMSO toe aan media die geen palmitinezuur bevatten. Verwijder het medium uit elke wel en vervang dit door 50 microliters medium met of zonder palmitinezuur, en incubeer de plaat bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius gedurende twee uur. Voeg vervolgens vijf microliters harsreagentia toe en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Laad de plaat na incubatie in een multimode microplate-reader en registreer de fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 560 nanometers en een emissiegolflengte van 590 nanometers.

Om de cellevensvatbaarheid te meten, worden de resultaten weergegeven als relatieve fluorescentie-eenheden voor dezelfde plaat. Voeg 55 µL DEVD-assayreagens toe en incubeer twee uur bij kamertemperatuur. Registreer vervolgens met de microplaatlezer de luminescentie om de caspase-3/7-activiteit te meten; de resultaten worden weergegeven als relatieve luminescentie-eenheden, waarbij de luminescentie direct proportioneel is aan caspase-3/7. Om de caspase-3/7-activiteit te normaliseren naar het celaantal, wordt de cellevensvatbaarheid gedeeld door de caspase-3/7-activiteit.

Dit protocol beschrijft de resultaten van het multiplexen van twee afzonderlijke assays om mechanismen van celdood door apoptose te bepalen. De caspase-activiteit was significant verhoogd in cellen die waren blootgesteld aan palmitinezuur. Na een incubatie van twee uur is de integriteit van het celmembraan zichtbaar veranderd in de aanwezigheid van palmitinezuur.

Hier wordt het potentiële pad getoond waarlangs palmitinezuur apoptose induceert. Inzicht in de onderliggende mechanismen van de stressor die gebruikt wordt om apoptose op te wekken, helpt bij het bepalen van de incubatietijd van de stressor. Aangezien caspase-enzymen geactiveerd moeten worden voordat ze met het DEVD-substraat interageren, kan deze techniek, zodra deze onder de knie is, in minder dan vijf tot zes uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in het uitvoeren van een multiplex caspase-3 en -7 activiteitsassay met behulp van een in vitro hypothalamus-neuronaal celcultuurmodel. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de incubatietijden afhankelijk zijn van de celtypen en de gebruikte stressoren of agonisten. De ontwikkeling van deze techniek stelt onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen in staat om een betrouwbare en tijdbesparende methode te gebruiken voor apoptotische studies. Na deze procedure kunnen aanvullende farmacologische assays die gericht zijn op specifieke eiwitten binnen het apoptotische proces worden uitgevoerd om de onderliggende mechanismen die degeneratieve ziekten initiëren te definiëren.