Name: Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-16T15:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Leer een multiplex caspase-3/7 activiteitstest om apoptose te meten in hypothalamische neuronen na oxidatieve stress door palmitinezuur. Deze methode biedt snelle, betrouwbare resultaten voor apoptoseonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het hier beschreven onderzoek werd gefinancierd door het Amerikaanse Department of Veterans Affairs Biomedische Laboratorium Onderzoek en Ontwikkeling BX001686-1A1 en VA Revalidatie Onderzoek en Ontwikkeling.

1. Plating en onderhoud van Cultuur van de Cel <ol><li> Warm Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) cultuur media (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine / Neomycine) tot 37 ° C. </li><li> Verkrijgen voorraad van bevroren A12 cellen van -80 ° C. </li><li> Snel ontdooien cellen in 37 ° C waterbad; eenmaal ontdooid, zachtjes pipet cellen over te dragen aan een 75 cm 2 geventileerde kolf en voeg 10 ml van de cultuur media. </li><li> Incubeer kolf overnacht in 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. Zuig media na 24 uur en te vervangen door vers medium. Blijven groeien cellen tot 70-80% confluentie verkregen (2-3 dagen groei). </li></ol> 2. Tellen en Plating Cellen <ol><li> Warm DMEM en 1x met trypsine-EDTA-oplossing tot 37 ° C. </li><li> Zuig media uit cellen en was tweemaal met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Voeg 500 pi van trypsine-oplossing en incubeer bij 37 ° C gedurende 2-5 minuten. </li><li> Losmakencellen van kolf met een schraper en suspendeer de cellen in 5 ml medium. Passeren cellen door zeef en passeren cel zeef in een schone 50 ml tube. Kan nodig zijn om de cellen meer dan een keer passeren zeef, maar niet herhalen meer dan drie keer. </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer om hoeveelheid cellen vast cultuur tot 6.000 cellen / putje zaad in een 96-well clear bottom zwart of wit ommuurde plaat in een eindvolume van 100 ul medium. Incubeer plaat in 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 24 uur. </li></ol> 3. Bepalen levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 Activiteit <ol><li> Breng PA een steriele 5 ml glazen flesje en oplosbaar in 100% dimethylsulfoxide (DMSO). Verdun voorraad PA oplossing 01:10 in DMSO toevoegen aan DMEM voorverwarmd tot een uiteindelijke werking concentratie van 0,1 mM PA verkrijgen. Voor controle-media, voeg dezelfde concentratie van DMSO die wordt toegevoegd aan media met PA. </li><li> Verwijder de media in elk putje en te vervangen door 50 ul media + / -PA. Incubeer de plaat gedurende 2 uur in 5% CO2 bij 37 ° C. Voeg vervolgens 5 ul resazurin reagens en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van een multimode microplaataflezer, opnemen fluorescentie (560 EX / 590 EM) levensvatbaarheid van de cellen te meten. Resultaten worden gepresenteerd als relatieve fluorescentie-eenheden (RFU). </li><li> Om dezelfde plaat, voeg 55 ul van caspase reagens en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Nogmaals met de microplaatlezer, opnemen luminescentie tot caspase-3/7 activiteit te meten. Resultaten worden gepresenteerd als relatieve luminescentie-eenheden (RLU) met luminescentie recht evenredig met caspase-3/7 activiteit. </li><li> Om caspase-3/7 activiteit normaliseren om celgetal, verdeel cel levensvatbaarheid (RFU) door caspase-3/7 activiteit (RLU). </li></ol>

<ol><li>Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAkil%2C+L+%22J.+Health+Care+Poor+Underserved%22">J. Health Care Poor Underserved</a>. 22, 61-72 (2011).</li>
<li>Posey, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proinflammatory+lipid+accumulation%2C+inflammation%2C+and+insulin+resistance+in+rats+fed+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Moraes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet+induces+apoptosis+of+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Mayer, C. M., Belsham, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitate+attenuates+insulin+signaling+and+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+apoptosis+in+hypothalamic+neurons%3A+rescue+of+resistance+and+apoptosis+through+adenosine+5%27+monophosphate-activated+protein+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation.</a> Endocrinology. 151, 576-585 (2010).</li>
<li>Benoit, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+mediates+hypothalamic+insulin+resistance+by+altering+PKC-theta+subcellular+localization+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents.</a> J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).</li>
<li>Thaler, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+is+associated+with+hypothalamic+injury+in+rodents+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).</li>
<li>Williams, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nutr.+Soc%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic dysfunction in obesity.</a> Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+phenotypic+array+of+hypothalamic+neuronal+cell+models+to+study+complex+neuroendocrine+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders.</a> Endocrinology. 145, 393-400 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+A+decreases+lipid+peroxidation+and+apoptosis+in+a+novel+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model.</a> Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.+Assay+Drug+Dev%5BTitle%5D)+AND+%22Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev.</a> Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+viability+and+cytotoxicity+testing+and+same-well+multi-parametric+combinations+for+high+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Chem.+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening.</a> Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).</li>
<li>Steffen, W., Linck, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunoblot%3A+a+sensitive+technique+to+stain+proteins+and+detect+multiple+antigens+on+a+single+two-dimensional+replica%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica.</a> Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).</li>
<li>Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+and+quantitation+of+proteins+on+western+blots+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes.</a> Biotechniques. 29, 636-642 (2000).</li>
<li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time%2C+dose+of+toxin%2C+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).</li>
<li>Smyth, P. G., Berman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+apoptosis%3A+methods+for+elucidating+the+mechanism+of+apoptotic+cell+death+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system.</a> Biotechniques. 32, 648-650 (2002).</li>
<li>Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+pharmacological+manipulation+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Caspases: pharmacological manipulation of cell death.</a> J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

De multiplex test is een algemeen aanvaarde techniek die is gebruikt door wetenschappers in talrijke toepassingen zoals PCR microarrays, immunodetectie en andere op eiwit gebaseerde detectiemethoden 13, 14. Onlangs hebben multiplexing assays steeds gebruikt in in vitro-plaat gebaseerde experimenten en zijn gevalideerd als een nauwkeurige methode om de cytotoxiciteit en de levensvatbaarheid 12. In het bovenstaande protocol, we tonen de effectiviteit van multiplexing TL-en lichtgeve...

Diëten rijk aan verzadigde vetzuren zoals palmitinezuur (PA) zijn verbonden met obesitas en andere comorbiditeiten, waaronder cardiovasculaire ziekte en diabetes 1, 2. Vetrijke diëten hebben ook aangetoond dat oxidatieve stress, apoptose en neuronale degeneratie in de hypothalamus, een belangrijke regulator van de eetlust en het energieverbruik verhogen 3-7. Inzicht in het mechanisme waardoor blootstelling vetrijke dieet induceert hypothalamus ontregeling is dus belangrijk voor de ontwikkeling van farmacologische behandelingen voor zwaarlijvigheid. Echter, de cellulaire mechanismen waardoor vet in de voeding van invloed op neuronale functie blijven onduidelijk. Een beter begrip van hoe vetten zoals PA begin van de hypothalamus apoptoseroutes zou kunnen leiden is een noodzakelijke eerste stap in de richting van dit doel. Het doel van dit artikel is om een multiplex assay voor in vitro testen van neuronale respons op PA belichting, ontwikkeld voor gebruik in studies van h beschrijvenypothalamic neurodegeneratie. Wij geven een gedetailleerde beschrijving van een in vitro 96-well formaat multiplex assay voor het meten caspase 3/7 activiteit per totaal aantal cellen in een gedifferentieerde geïmmortaliseerde volwassen muis hypothalamus cellijn (aangeduid A12) na challenge met oxidatieve PA 8. In het kort wordt levensvatbaarheid van de cellen bepaald volgens PA uitdaging via een resazurin gebaseerde test. Resazurin is een cel permeabele stof die enzymatische reductie van metabool actieve cellen ondergaat, een werkwijze verondersteld op te treden via de mitochondriën 9. Levensvatbare cellen continu omzetten Resazurin te resorufine, produceren een fluorescent signaal evenredig met het aantal levensvatbare cellen. Caspase-3/7 Activiteit vervolgens geanalyseerd met een DEVD-gebaseerde lumogenic assay. DEVD is een aminozuursequentie (Asp-Glu-Val-Asp) gesplitst door caspase-3. Wanneer deze sequentie is gekoppeld met een lumogenic stof, na activatie van intracellulaire caspase-3/7 en daaropvolgende splitsingvan DEVD substraat, wordt het lichtgevende product uitgebracht. Deze reactie is evenredig met caspase activiteit en daarmee de inductie van apoptose. Dode cellen niet kan produceren caspase, caspase-3/7 activiteit is van nature van voorbijgaande aard; Daarom analyse moet verrichten tussen 30 minuten tot 4 uur na challenge, afhankelijk van de effectiviteit van de cel stressor. Cellevensvatbaarheid is omgekeerd evenredig met caspase-3/7 activiteit en kunnen worden gebruikt om mechanismen van celdood bepalen. Zo heeft deze methode eerder gebruikt dat voorbehandeling met het peptide hormoon orexin vermindert apoptose in hypothalamus cellen geprikkeld met waterstofperoxide, wat suggereert dat de mechanismen die door deze behandeling zijn belangrijk in het beschermen tegen oxidatieve beschadiging 10 te tonen. Het is belangrijk op te merken deze tests zijn cellijn-en weefsel-afhankelijke, als ze vertrouwen op mitochondriale activiteit assay reagentia verlagen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor volwassen muis hypothalamus (A12) cellen; echter,beschreven werkwijzen kunnen worden gewijzigd om te passen onder soortgelijk onderzoek. Multiplexing testen van een kweekputje biedt een voordeel boven de traditionele methode om afzonderlijke tests om verschillende redenen. Naast het besparen van tijd, celsteekproeven en cultuur reagentia, kan multiplexing assays ook kennis van de overleving van de cel en de dood, bieden interne controles, en elimineren de noodzaak voor herhaalde experimenten 11, 12. Alternatieve werkwijzen ingeroepen Western blots of ELISA&#39;s, waarvoor betrouwbare tests zijn, maar zijn duur en tijdrovend (1-2 dagen), vooral bij gebruik van een 96-putjes. Exclusief de tijd die het kost om de cultuur cellen voor de multiplexing-assay, de totale tijd is minder dan 3 uur. Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met A12 cellen kunnen worden aangepast voor gebruik in andere modellen maar vergeet factoren die cel integriteit kunnen beïnvloeden. Afschrikkenmijnbouw of dit protocol zou werken voor een reeks experimenten afhankelijk van het aantal monsters en proefomstandigheden en geplande downstream experimenten.

<table><tbody><tr><td>Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2&nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle&rsquo;s Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Palmitic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Dimethy Sulfoxide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td> PrestoBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>Caspase-Glo 3/7 Assay Systems</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>96 W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gebruik van een caspase multiplexing test van apoptose bepalen in een hypothalamus cell model

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

De mogelijkheid om multiplex assays in studies van complexe cellulaire mechanismen elimineert de noodzaak voor herhaalde experimenten, verschaft interne controles en vermindert afval kosten en reagentia. Hier beschrijven we optimalisatie van een multiplex assay apoptose beoordelen na een palmitinezuur (PA) uitdaging in een in vitro model hypothalamus, waarbij zowel fluorescerende en luminescerende gebaseerde bepalingen om levensvatbare cellen en caspase-3/7 te meten in een 96 putjes microtiterplaatformaat. Na PA uitdaging, werden levensvatbare cellen bepaald door een-resazurin gebaseerde fluorescentie. Caspase-3/7 activiteit werd vervolgens bepaald met een luminogenic substraat, DEVD en genormaliseerd naar het aantal cellen. Dit multiplexing test is een nuttige techniek voor het bepalen van veranderingen in caspase activiteit na een apoptotische stimulus, zoals verzadigde vetzuren uitdaging. De verzadigde vetzuren PA kan verhogen hypothalamus oxidatieve stress en apoptose, met vermelding van de mogelijke invoernce assays zoals beschreven hier bestuderen van verbanden tussen verzadigde vetzuren en neuronale functie.

Het protocol hierboven beschreven resultaten multiplexing twee assays mechanismen van celdood bepalen. Figuur 1 toont een overzicht van het protocol levensvatbaarheid van de cellen en caspase-3/7 activiteit te bepalen. Caspase activiteit significant verhoogd in cellen geprikkeld met PA na 2 uur incubatie (Figuur 2A en tabel 1). Verlies van celmembraanintegriteit een morfologische verandering geassocieerd met de inductie van apoptose, die zichtbaar is in cellen na 2 uur ...

Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Het algemene doel van deze video is om een multiplex assay met een hoge output te demonstreren om het begin van apoptose te bepalen, gemeten aan de hand van caspase-3,7. Eerst worden hypothalamische neuronen blootgesteld aan het apoptose-inducerende verzadigde vetzuur palmitinezuur.Vervolgens wordt de levensvatbaarheid van de neuronen gemeten met behulp van een fluorescent reagens en een microplaatlezer na het begin van apoptose. Het luminescente substraat, DEVD, een aminozuurvolgorde die door caspase 3 wordt gesplitst, wordt aan de cellen toegevoegd. De laatste stap van de procedure is het meten van de luminescentie met een microplaatlezer om de caspase-activiteit te bepalen, welke toeneemt in cellen die apoptose ondergaan.Uiteindelijk kan een ratio van caspase-activiteit per levensvatbare cel in minder dan vijf tot zes uur worden bepaald, in een 96-well formaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden, zoals western blots of lysis, is dat het een snelle, goedkope assay is waarmee caspase-3/7-activiteit direct in meerdere well-formaten kan worden gemeten.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het vakgebied, zoal

use-caspase-multiplexing-assay-to-determine-apoptosis-hypothalamic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

This video describes an in vitro Caspase-3/7 luminescent assay to quantify cell death or apoptosis. The assay measures luminescence produced following caspase-3/7 cleavage of a pro-luminescent DEVD substrate. The luminescence generated is proportional to caspase-3/7 activity.

Caspase-3/7 Assay: A Luminescence-Based Assay to Quantify Apoptosis by Measuring Caspase-3/7 Activities in Frog Skin Explants

Het begrip anastasis verwijst naar het fenomeen waarbij stervende cellen in een laat stadium een celdoodproces omkeren, zichzelf repareren en uiteindelijk overleven. Hier demonstreren we protocollen voor het detecteren en volgen van cellen die anastasis ondergaan.

Strategieën voor Tracking Anastasis, A Cell Survival verschijnsel dat apoptose Keert

Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.

In Vivo Tracks Biosensor Non-apoptotische caspase activiteit in Drosophila

Anastasis is technisch uitdagende te detecteren in vivo omdat de cellen die de cel dood proces hebben omgekeerd morfologisch niet te onderscheiden van normale gezonde cellen kunnen. Hier beschrijven we protocollen voor het opsporen en volgen van cellen die anastasis in levende dieren ondergaan met behulp van ons nieuw ontwikkelde in vivo CaspaseTracker biosensor systeem.

Opsporen van Anastasis In Vivo door CaspaseTracker Biosensor

Dit protocol beschrijft caspase Bimolecular fluorescentie complementatie (BiFC); een door de imaging gebaseerde methode die kan worden gebruikt voor het visualiseren van geïnduceerde nabijheid van initiatiefnemer caspases, die is de eerste stap in hun activering.

Verlichting van de trajecten voor Caspase activeren met behulp van fluorescentie Bimolecular complementatie

Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.

Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex

Dit protocol beschrijft de workflow om monocyten-afgeleide macrofagen (MDM) te verkrijgen uit menselijke bloedmonsters, een eenvoudige methode om inflammatoire caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) -verslaggevers efficiënt in menselijke MDM te introduceren zonder de levensvatbaarheid en het gedrag van cellen in gevaar te brengen, en een op beeldvorming gebaseerde benadering om inflammatoire caspase-activering in levende cellen te meten.

Visualisatie van inflammatoire caspasen geïnduceerde nabijheid in menselijke monocyt-afgeleide macrofagen

Dit protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het beoordelen van caspase-activering (caspase-1, caspase-3, caspase-7, caspase-8, caspase-9 en caspase-11) in reactie op zowel in vitro als in vivo (bij muizen) modellen van infectie, steriele beledigingen en kanker om de initiatie van celdoodroutes te bepalen, zoals pyroptose, apoptose, necroptose en PANoptose.

Evaluatie van Caspase-activering om aangeboren immuunceldood te beoordelen

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Leer een multiplex caspase-3/7 activiteitstest om apoptose te meten in hypothalamische neuronen na oxidatieve stress door palmitinezuur. Deze methode biedt snelle, betrouwbare resultaten voor apoptoseonderzoek.

Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model

Meer video's verkennen