Gebruik van een caspase Multiplexing Test van apoptose bepalen in een Hypothalamus Cell Model
16 april 2014
Multiplex testen kunnen nuttige informatie verschaffen voor basis cellulaire mechanismen en elimineren van verspilling van reagentia en onnodige herhaalde experimenten. We beschrijven hier een multiplex caspase-3/7 activiteit test, met fluorescerende-en-luminescente gebaseerde methoden, levensvatbaarheid van de cellen bepaald in een in vitro model hypothalamus na oxidatieve uitdaging palmitinezuur.
Het algemene doel van deze video is om een multiplex-assay met hoog rendement te demonstreren om het begin van apoptose te bepalen zoals gemeten door caspase. Caspase drie zeven. Eerst worden hypothalamusneuronen uitgedaagd met het apoptose-inducerende verzadigde vetzuur, palmitinezuur.
Vervolgens wordt de cellevensvatbaarheid van de neuronen gemeten met behulp van een op fluorescentie gebaseerd reagens en een microplaatlezer na het begin van apoptose. De lumino substraat, DEVD, dat een aminozuursequentie is die door caspase drie wordt gekliefd, wordt toegevoegd aan de cellen. De laatste stap van de procedure is om luminescentie te meten met behulp van een microplaatlezer om de caspase-activiteit te bepalen, die toeneemt in cellen die apoptose ondergaan.
Uiteindelijk kan een verhouding van caspase-activiteit per levensvatbare cel worden verkregen in minder dan vijf tot zes uur. In een 96-wells formaat. Het belangrijkste voordeel van deze techniek van onze bestaande methoden, zoals western blots of lysis, is dat het een snelle, goedkope assay is die caspase drie zeven-activiteit direct kan meten in meerdere welformaten.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld, zoals het bepalen van primaire modulatoren van apoptose. De bruikbaarheid van deze techniek is dat deze multiplexing kan worden gebruikt als een nauwkeurige methode voor het beoordelen van cytotoxiciteit en levensvatbaarheid. Hoewel de assay redelijk eenvoudig is, is een visuele demonstratie van deze methode cruciaal om ervoor te zorgen dat de assay met succes wordt voltooid.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in neurodegeneratie, kan deze ook worden toegepast op andere ziekten en in vitro-modellen zoals die worden gebruikt in kankeronderzoek. Personen die nieuw zijn bij deze methode zullen deze techniek moeten optimaliseren omdat de eindpunten afhankelijk zijn van de cellijn en agonist. Caspase drie zeven-activiteit is van voorbijgaande aard.
Daarom, afhankelijk van de effectiviteit van de celstressor, kan het bepalen van het juiste tijdstip om castbase-activiteit te meten enige inspanning vergen Om snel te beginnen. Ontdooi bevroren 12 cellen in een waterbad van 37 graden Celsius. Eenmaal ontdooid, pipet de cellen voorzichtig in een 75 centimeter vierkante ontluchtingscultuurkolf en voeg 10 milliliter warme delcos, gemodificeerd arendsmiddel of DMEM toe, incubeer de kolf een nacht in een 5% koolstofdioxide-incubator bij 37 graden Celsius.
Na 24 uur aspireert u het medium en vervangt het door vers medium. U kunt cellen blijven kweken tot tussen 70 en 80% confluency is bereikt na twee tot drie dagen groei. Om de cellen te tellen, warmt u eerst DMEM en een x trypsin, EDTA-oplossing op tot 37 graden Celsius. Aspireer het medium uit de kolf en was twee keer met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing.
Voeg 500 microliter tryine-oplossing toe voordat u incubeert bij 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten. Los de cellen los van de kolf met behulp van een schraper en suspendeer cellen in vijf milliliter medium. Haal de cellen door een celstrainer in een schone 50 milliliter buis.
Het kan nodig zijn om de cellen meer dan eens door de zeef te halen, maar herhaal niet meer dan drie keer na het tellen van de cellen met behulp van een hemo cytometer. Zaai 6.000 cellen per putje in een 96-wells heldere bodem zwarte of witte wandplaat in een eindvolume van 100 microliters medium, incubeer de plaat bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Breng palmitinezuur over naar een steriele vijf milliliter glazen fles en lost op in 100% DMSO.
Na het verdunnen van de stockoplossing van palmitinezuur een op tien in DMSO, voegt u het toe aan PREWARM DMEM om een eindconcentratie van 0,1 millimolair palmitinezuur voor controlemedia te verkrijgen. Voeg dezelfde concentratie DMSO toe die werd toegevoegd aan media met palmitinezuur. Verwijder het medium in elke put en vervang het door 50 microliters medium plus of min tic zuur en incubeer de plaat bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius gedurende twee uur. Voeg vervolgens vijf microliters harsreagentia toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie, laad de plaat op een multimode Microplate-lezer en registreer fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 560 nanometer en een emissiegolflengte van 590 nanometer.
Om celschade te meten, worden de resultaten gepresenteerd als relatieve fluorescentie-eenheden naar dezelfde plaat. Voeg 55 microliters DEVD-castreagens toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Gebruik de Microplate-lezer opnieuw om luminescentie te registreren om caspase drie zeven-activiteit te meten. De resultaten worden gepresenteerd als relatieve luminescentie-eenheden, waarbij luminescentie direct evenredig is aan caspase drie zeven. Om caspase drie zeven-activiteit te normaliseren op celtelling, deel cellevensvatbaarheid door caspase drie zeven-activiteit.
Dit protocol beschrijft resultaten in multiplexing van twee afzonderlijke assays om mechanismen van celdood door apoptose te bepalen. Caspase-activiteit was significant verhoogd in cellen uitgedaagd met palmitinezuur. Na een incubatie van twee uur is de integriteit van het celmembraan zichtbaar veranderd in de aanwezigheid van palmitinezuur.
Hier wordt de mogelijke route getoond waarin palmitinezuur apoptose induceert. Het begrijpen van de onderliggende mechanismen van de stressor die wordt gebruikt om apoptose te induceren, helpt bij het bepalen van de lengte van de incubatietijd van de stressor. Omdat caspase-enzymen geactiveerd moeten worden voordat ze kunnen interageren met het DEVD-substraat. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in minder dan vijf tot zes uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een multiplex-caspase drie zeven-activiteitsassay uitvoert met behulp van een in vitro hypothalamus-neuronaal celcultuurmodel. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een multiplex caspase-3/7 activiteitsassay om de celviabiliteit in hypothalamische neuronen te beoordelen na oxidatieve stress geïnduceerd door palmitinezuur. De assay maakt gebruik van zowel fluorescente als luminescente methoden om inzicht te verschaffen in apoptosemechanismen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Apoptose-onderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van apoptose is essentieel voor het bestuderen van neurodegeneratieve ziekten.
- Multiplex-assays kunnen de experimentele efficiëntie verhogen en reagensverspilling verminderen.
- Caspase-3/7 zijn belangrijke markers van apoptose.
- Palmitinezuur staat erom bekend oxidatieve stress in neuronen te induceren.
Doel van de studie
- Om een high-output multiplex-assay voor het meten van apoptose te demonstreren.
- Om de effecten van palmitinezuur op de levensvatbaarheid van hypothalamische neuronen te evalueren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het beoordelen van caspase-activiteit in vitro.
Gebruikte methoden
- Hypothalamische neuronen werden blootgesteld aan palmitinezuur om apoptose te induceren.
- De cellevensvatbaarheid werd gemeten met behulp van een fluorescent reagens.
- Het luminescente substraat DEVD werd toegevoegd om caspase-activiteit te detecteren.
- Metingen werden uitgevoerd met een microplatereader voor zowel fluorescentie als luminescentie.
Belangrijkste resultaten
- Een verhoogde caspase-activiteit werd waargenomen in neuronen die waren blootgesteld aan palmitinezuur.
- De multiplex-assay maakte effectief onderscheid tussen levensvatbare en apoptotische cellen.
- Fluorescente en luminescente methoden leverden complementaire gegevens op.
- De assay demonstreerde high-throughput mogelijkheden voor apoptoseonderzoek.
Conclusies
- De multiplex caspase-3/7-assay is een waardevolle tool voor het bestuderen van apoptose.
- Deze methode kan experimenten stroomlijnen en de kosten voor reagentia verlagen.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de cellulaire mechanismen van neurodegeneratie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Multiplex assays voor caspase-3/7 en viabiliteit maken een snelle, kwantitatieve beoordeling van apoptose in neuronale celmodellen mogelijk, wat onderzoek naar vroege neurodegeneratie en mechanische risicoreductie ondersteunt. Deze aanpak stroomlijnt discovery-workflows door experimentele redundantie te verminderen en interne controles te bieden, waardoor het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en cytotoxiciteitsstudies wordt vergroot. De schaalbaarheid en doorvoercapaciteit van de methode zijn direct relevant voor portfolio-triage en de continuïteit van translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe kwantificering van apoptose mogelijk via caspase-3/7-activiteit in reactie op gedefinieerde stressfactoren.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door cellulaire viabiliteit te koppelen aan activering van de apoptotische route.
- Faciliteert snelle hypothesetoetsing voor modulatoren van neuronale apoptose.
- Biedt interne normalisatie, wat het vertrouwen in gegevens over target engagement vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde, gemultiplexte resultaten voor zowel cellevensvatbaarheid als apoptose in een enkele workflow.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van de assay in 96-well formaten.
- Maakt high-throughput screening mogelijk van verbindingen die apoptotische pathways beïnvloeden.
- Vermindert reagentiaverspilling en experimentele tijd in vergelijking met sequentiële assays voor één enkele parameter.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro apoptosis-metingen in lijn met ziekte-relevante neurodegeneratiemodellen.
- Ondersteunt de continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van neuroprotectieve strategieën.
- Biedt een platform voor farmacologische analyse van apoptotische mechanismen in neuronale systemen.
- Maakt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve gegevens over de apoptotische respons.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze multiplex-assay integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door een snelle, kwantitatieve beoordeling van apoptose in neuronale modellen mogelijk te maken na specifieke uitdagingen.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothese-gestuurd onderzoek naar apoptotische paden en de effecten van stressfactoren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de evaluatie van verbindingen in high-throughput formaten.
- Analytiek: Genereert genormaliseerde caspase-activiteit per levensvatbare cel, wat een directe vergelijking tussen verschillende condities faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en ziekterelevante modellen van neurodegeneratie.
- Bedrijfmatige hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor de beoordeling van apoptose en levensvatbaarheid in diverse celsystemen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van apoptose-gerelateerde targets en mechanistische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert metingen van apoptose en levensvatbaarheid, waardoor de handmatige tijd en het gebruik van reagentia worden verminderd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen portfolio's voor neurodegeneratie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuroprotectieve programma's en cytotoxiciteitsprogramma's mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in neuronale celkweek en de optimalisatie van apoptose-assays.
- Toegang tot multimode microplaatlezers voor fluorescentie- en luminescentiedetectie is noodzakelijk.
- Standaardisatie van incubatietijden en stressorconcentraties tussen teams is vereist.
- De eindpunten van de assay zijn afhankelijk van de cellijn en de agonist, waardoor initiële optimalisatie voor nieuwe modellen noodzakelijk is.
- De kortstondige aard van caspase-activiteit vereist een nauwkeurige timing voor een correcte meting.
