Name: Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Leer RNA-interferentie in muizenmacrofagen voor het bestuderen van aangeboren immuniteit met behulp van siRNA-transfectie en LPS-stimulatie. Deze methode maakt efficiënt genonderzoek in immunologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dank aan Brad Lackford voor de hulp bij het optimaliseren van enkele van de technieken die in dit manuscript worden beschreven.

1. Onderhoud van macrofaagcellijnen <ol><li> Groeien RAW264.7 en J774A.1 cellijnen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2. Om steriliteit te behouden, voeg 1% penicilline / streptomycine (pen / strep) aan de media (hoewel dit niet strikt noodzakelijk). </li><li> Kritische stap: Zorg ervoor dat de macrofagen groeien in een gezonde staat voor een efficiënte transfectie en siRNA-geïnduceerde gen-knockdown. Gebruik cellen tussen passages 3 en 10 na de verse ontdooien, omdat deze macrofagen lijnen vertonen de beste transfectie-efficiëntie en onderhouden robuuste post-transfectie overleven in deze fase; geen gebruik maken van een hogere passage aantal (&gt; 20), zoals transfectie-efficiëntie en gen knockdown beide verminderen sterk. </li><li> Voor optimale siRNA transfectie cellaag bij 20% confluentie groeien en één of twee dagen tot de cellen niet meer dan 80% confluentie bereiken. Overgrown cellen zullen niet transfecteren efficiently. </li></ol> 2. Het programmeren van de 96-well Shuttle Systeem voor Transfection <ol><li> Start de 96-well shuttle-software op de computer is aangesloten op de shuttle. Selecteer nieuwe parameter file vanaf linksboven bestand menu. </li><li> Markeer de putjes die worden getransfecteerd op de getoonde 96-well plaat schema. Een groen vakje geeft aan welke bronnen zijn geselecteerd. </li><li> Selecteer het programma dat overeenkomt met de macrofaag cellijn gebruikt (DS-136 voor RAW264.7 of DS-130 voor J774A.1) en selecteer toepassing, onder de diagramed 96-well plaat gelegen. Merk op dat na het selecteren van een programma, de putten op het schema plaat wordt gekleurd donkerblauw. Lege cirkels geven putten die niet zijn toegewezen aan een programma en zal niet geschokt. </li></ol> 3. Voorbereiden van de reagentia voor transfectie <ol><li> Bereid de werkende Nucleofector ™ oplossing door het mengen van SF-cellijn 96-well Nucleofector ™ -oplossingmet de volledige inhoud van de bijgevoegde supplement buis. Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan overtollige volledige Nucleofector ™ oplossing bij 4 ºC gedurende maximaal 3 maanden voor toekomstig gebruik. </li><li> Voorverwarmen het DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsine / EDTA, en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C alvorens met de macrofagen voor transfectie. </li><li> Bereid de siRNA voor transfectie door ontdooien op ijs. Om het aantal vries dooi van de siRNA minimaliseren bevriezen nieuwe siRNA in aliquots de eerste keer gebruikt. </li><li> In eerste experimenten gebruikt siRNA bij een relatief hoge dosis van 2 uM (verdund 1:10 van 20 uM voorraden). Vervolgens titreren siRNA&#39;s die robuuste gen knockdown neer op lagere doses veroorzaken, hoewel doorgaans hogere doseringen nodig zijn voor een efficiënte gen knock-down in macrofagen in vergelijking met andere soorten cellen. OPMERKING: siRNA&#39;s zijn verkrijgbaar uit vele bronnen; vrij robuust gen knock-down kan worden verkregengebruik siGenome SMARTPOOLs die pools vier siRNAs targeting elk gen. Als negatieve controle, gebruik een van de verschillende niet-targeting siRNA zwembaden of siRNA&#39;s. </li><li> De transfectie-efficiëntie te controleren, of het transfecteren pmaxGFP controle plasmide (verschaft in de Amaxa kits) of fluorescentie-gemerkt siRNA parallel aan de experimentele siRNA. Verwacht 30-50% transfectie van het GFP plasmide (bepaald met microscopie of flowcytometrie de dag na transfectie) en&gt; 99% transfectie van fluorescent-gelabelde siRNA (geanalyseerd door flow cytometrie onmiddellijk na transfectie en herstel). </li></ol> 4. Voorbereiding van de macrofagen voor Transfection <ol><li> Los aanhangend macrofagen uit de celkweek gerechten door behandeling met trypsine. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 10 ml PBS. Na verwijdering van het PBS, incubeer de cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm schaal) gedurende 1-2 min tot cellen beginnen te los. Tik voorzichtig de plaat en beweeg de oplostie tijdens de incubatie trypsine maximaliseren. </li><li> Na de incubatie, voeg 9 ml DMEM + FBS media, meng voorzichtig op en neer, en verzamel de cellen door pipetteren in een steriele buis. </li><li> Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een hemocytometer. Verwachten ongeveer 10 miljoen macrofagen per 10 cm plaat. Bereken het aantal macrofagen nodig; elke put op de 96-well shuttle vereist 200.000 cellen. Vergeet niet om de waarde van de cellen van een paar extra putten &#39;toe te staan ​​voor pipetteren verliezen. </li><li> Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 min bij 150 xg bij kamertemperatuur. Wees niet te snel centrifugeren als deze macrofagen gezondheid en transfectie-efficiëntie zal afnemen. </li></ol> 5. Nucleofection van macrofagen met siRNA <ol><li> Met behulp van een steriele 96-well ronde bodemplaat (dat vergemakkelijkt het mengen terwijl het minimaliseren van reagens verlies), voeg 2 pi van elke siRNA aan elk putje te zijn transfweerspiegelde. Opmerking: Afhankelijk van het aantal siRNAs, kan dit worden bereikt tijdens de macrofaag centrifugatiestap. </li><li> Zuig het medium van de cellen gecentrifugeerd. Voorzichtig resuspendeer de cellen in Nucleofector ™ oplossing SF (bevattende het supplement oplossing), met 20 gl per 200.000 cellen gepelleteerd. Eenmaal geresuspendeerd, gebruiken de cellen onmiddellijk voor optimale transfectie. </li><li> Transfer geresuspendeerd cellen in een steriele trog; met een multichannel pipet 20 ul van de geresuspendeerde cellen mengsel in elk putje van de 96-well plaat met de siRNA. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren. </li><li> Overdracht 20 ul van de cel / siRNA mengsel in de 96-well Nucleocuvette ™ plaat Kritische stap:. Vermijd genereren bubbels tijdens de overdracht stap als deze fouten tijdens Nucleofection kan induceren. </li><li> Na het plaatsen van alle experimentele monsters in de transfectie, bovenkap de 96-well plaat met de ontvangen deksel en very tik zachtjes op een hard oppervlak om eventuele luchtbellen uit de monsters te verwijderen. </li><li> Plaats 96-well plaat met deksel in de 96-well Nucleofector shuttle en selecteer &#39;uploaden en start&#39; in de rechterbenedenhoek van het scherm programma. Voorafgaand aan Nucleofection, volgt het programma prompt om de resultaten op te slaan. Opmerking: Bij het Nucleofection proces putjes succes getransfecteerd worden afgebeeld op de 96-well schema op het scherm een ​​groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met mintekens een fout aangeeft, waarschijnlijk door luchtbellen of verkeerd pipetteren de juiste hoeveelheid reagentia. </li></ol> 6. Herstel en Plating van macrofagen <ol><li> Onmiddellijk na Nucleofection, met een multichannel pipet wordt 80 ul voorverwarmde (37 ° C) RMP1-1640 medium aan elk putje. Voeg de media aan de zijkant van elk putje, waarbij de media langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, die zeer gevoelig in dit stadium. Laat de media niet toe te snel, want dit zalsterk verminderen levensvatbaarheid. </li><li> Plaats de 96-well platen met getransfecteerde monsters en RPMI-1640 in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 2 min; Dit is essentieel om de cellen voorafgaand aan manipulatie verdere herstellen. </li><li> Verwijder de 96-well plaat uit de incubator en zorgvuldig overbrengen van het mengsel uit elk putje in een 96-well weefselkweek plaat met een multichannel pipet. </li><li> Met een multichannel pipet, voeg 100 ul voorverwarmde (37 ° C) DMEM + FBS medium in elk putje. </li><li> Incubeer de 96-well weefselkweek plaat met monsters in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24-36 uur (optimaliseren precieze timing individuele siRNA, hoewel dit tijdsbereik algemeen goed werkt). </li></ol> 7. Stimulatie van macrofagen met LPS <ol><li> Na de 24-36 uur na Nucleofection incubatie, bereiden LPS (of andere PAMPs) in vers medium. Bereid voldoende vers medium van alle putjes (200 ul media / putje van de 96-well plaat plus een beetje extra voor pipetteren). LPS verdunnen tot een eindconcentratie van 20 ng / ml in DMEM + FBS. </li><li> Zorgvuldig aspireren media van de 96-well plaat en voeg de vers medium met de LPS aan de cellen. </li><li> Monitor de respons op LPS of andere PAMPs op verschillende tijdstippen na stimulatie. 6 uur is voldoende om een ​​robuuste inflammatoire cytokine respons op cytokinen zoals IL-6 en TNFa genereren. </li></ol> 8. Controle op de Induced aangeboren immuunrespons, Gene Knockdown en levensvatbaarheid in macrofagen <ol><li> Bewaken LPS geïnduceerde cytokineproductie, pipet het supernatant van de cellen in een 96-wells plaat. Cytokineproductie kan dan gemeten door ELISA. </li><li> Nadat de supernatant wordt verwijderd, monitoren cellevensvatbaarheid met fluoresceïne diacetaat (indien gesplitst door cellulaire esterasen in levende cellen, deze verbinding wordt fluorescerend). Identificeer siRNA&#39;s die genen te richten dat de levensvatbaarheid van cellen te controleren met behulp van de tzijn aanpak. Opmerking: de transfectie proces zelf moet weinig effect hebben op de levensvatbaarheid indien goed uitgevoerd. <ol><li> Voeg fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml voorraad in aceton) aan elke well (1: 100 eindverdunning in PBS). </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één tot vijf minuten en vervolgens controleren fluorescentie in de cellen met behulp van een plaatlezer (460 nm excitatie, 515 nm emissie). </li><li> Optioneel: Om de fluorescentie in de putten uniform, lyseren van de cellen met buffers zoals RIPA; Dit verschaft een uniform fluorescent signaal in de put, zoals sommige plaatlezers zijn geconfigureerd om slechts een klein deel van de put te controleren; als de cellen niet gelijkmatig zijn bedekt, zou de fluoresceïnediacetaat een onjuiste lezing te geven. </li></ol></li><li> Als alternatief voor controle cellevensvatbaarheid, monitor-siRNA geïnduceerd gen knockdown door qPCR met RNA afkomstig van de hechtende cellen. <ol><li> Nadat het supernatant van de cellen verwijderd (stap 8.1), add RLT buffer (die wordt gebruikt voor lysis en conservering van RNA) direct aan de hechtende cellen te lyseren. </li><li> Isoleer RNA met een RNA-preparaat kit zoals de RNeasy mini-kit en gebruik qPCR met genspecifieke primers bewaken gen knockdown opzichte van siRNA behandeling controleren. Gebruik primers Βactin of GAPDH voor normalisatie. </li></ol></li><li> Als een ander alternatief voor andere aspecten van de aangeboren immuunrespons controleren, bewaken de fagocytische capaciteit van macrofagen door toevoeging van FITC-gelabelde E. coli deeltjes direct op de hechtende cellen met een kit. Naar aanleiding van de fabrikant protocol, dat slechts een paar uur duurt, bewaken fagocyterende opname met behulp van een plaat lezer of microscopie. </li></ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel werd gesponsord door Lonza, Inc.

Talrijke studies gepubliceerd waarin individuele genen zijn het doelwit van siRNA in murine macrofagen. Terwijl lipide gemedieerde transfectie is gebruikt om siRNA leveren macrofaagcellijnen individueel, deze methoden lijden mogelijke effecten op de levensduur beperkt gen knockdown en variabiliteit van gen tot gen. Robuustere assays die kunnen worden gebruikt om genen in middel- of high-throughput fashion gericht ontwikkelen, optimaliseerden we technieken met de Amaxa Nucleofector 96 putjes pendelsysteem, die meer samen...

In dit protocol beschrijven we efficiënte methoden om genen in muizen macrofaag cellijnen met siRNA remmen en de effecten van de behandelingen die de aangeboren immuunrespons. Deze procedures worden uitgevoerd in 96-well formaat, waardoor RNAi schermen in middel- of high-throughput wijze. In reactie op infectie, mens zet onmiddellijk aangeboren immuunrespons en een trager, maar specifieker adaptieve immuunrespons. Deze snelle aangeboren immuunrespons impliceert de werving en activering van fagocyterende aangeboren immuuncellen waaronder macrofagen 1. Klassiek geactiveerde macrofagen betrokken zijn bij acute ontstekingsreacties en produceren antimicrobiële eiwitten en verbindingen, cytokinen en chemokinen, en presenteren antigenen 2,3. Alternatief geactiveerde macrofagen een rol spelen bij het ​​reguleren van de immuniteit, het handhaven tolerantie, weefselherstel en wondgenezing 4-8. Vanwege hun gemak functies, Macrofagen een rol in talrijke ziekten zoals atherosclerose, artritis, kanker en 9 spelen. Zo is de studie van macrofagen is een belangrijk onderzoeksgebied enige tijd in diverse ziektecategorieën. Ondanks hun belang in de aangeboren immuunrespons, kan macrofagen uitdagend cellen om mee te werken. In het bijzonder is het moeilijk om doelmatige transfectie met lipide reagentia in macrofagen te verkrijgen zonder geassocieerde toxiciteit 10,11. Zelfs wanneer siRNA efficiënt afgeleverd macrofagen, de robuustheid van RNAi-geïnduceerde gen vaak knockdown kan tamelijk gematigd zijn en kunnen variëren van gen tot gen. Om deze technische uitdagingen te overwinnen, hebben wij transfectie en knock-down technieken 12-16 geoptimaliseerd in twee muis macrofaag cellijnen, RAW264.7 17 en J774A.1 18. Deze aanpak maakt gebruik van de Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem voor transfectie; dit systeemeen combinatie van speciale reagentia en elektroporatie cellen in 96-well formaat 19 transfecteren. Na transfectie, beschrijven we methoden om cel herstel en de levensvatbaarheid te maximaliseren en de daaropvolgende siRNA-geïnduceerde gen knockdown maximaliseren. Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze benadering beschrijven we een protocol voor siRNA levering aan deze macrofaag cellijnen, stimuleren deze cellen met lipopolysaccharide (LPS), en bewaken de aangeboren immuunrespons op het productieniveau van verscheidene pro-inflammatoire cytokines. Wij bieden sample data in welke doelgroep we de Toll-like receptor (TLR) familie, waarvan de leden voelen LPS en andere pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), om aangeboren immuniteit te regelen.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 mouse macrophage cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 mouse macrophage cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varies depending on gene</td><td></td></tr><tr><td>Non-targeting control siRNA pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Block-iT fluorescent oligo for electroporation</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom sterile plates (not coated)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td><td>R&amp;D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF&alpha; Duoset ELISA kit</td><td>R&amp;D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Phagocytosis Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van rna-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrofagen zijn belangrijke fagocytische aangeboren immuuncellen. Wanneer macrofagen een ziekteverwekker tegenkomen, produceren ze antimicrobiële eiwitten en verbindingen om de ziekteverwekker te doden, produceren ze verschillende cytokinen en chemokinen om andere immuuncellen aan te trekken en te stimuleren, en presenteren ze antigenen om de adaptieve immuunrespons te stimuleren. Daarom is het belangrijk om macrofagen efficiënt te kunnen manipuleren met technieken zoals RNA-interferentie (RNAi) om deze belangrijke aangeboren immuuncel te onderzoeken. Macrofagen kunnen echter technisch uitdagend zijn om te transfecteren en kunnen een inefficiënte RNAi-geïnduceerde gen-knockdown vertonen. In dit protocol beschrijven we methoden om twee muismacrofagen-cellijnen (RAW264.7 en J774A.1) efficiënt te transfecteren met siRNA met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System en beschrijven we procedures om het effect van siRNA op gen-knockdown te maximaliseren. Bovendien zijn de beschreven methoden aangepast om in 96-well formaat te werken, waardoor middelgrote en hoogdoorvoerstudies mogelijk zijn. Om de bruikbaarheid van deze aanpak te demonstreren, beschrijven we experimenten die RNAi gebruiken om genen te remmen die lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde cytokineproductie reguleren.

Om de efficiëntie van transfectie deze aanpak demonstreren we gevolgd opname van FITC-gemerkt siRNA met een flow cytometer (figuur 1). Ter illustratie van het nut van onze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons, transfecteerden wij siRNAs targeting bekend aangeboren immuun regulerende genen in de RAW264.7 macrofaag cellijn, de cellen gestimuleerd met LPS, en vervolgens gecontroleerd productie van pro-inflammatoire cytokines IL 6 en TNFa. Verschillende TLR&#3...

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-interferentie te gebruiken om het effect van kandidaatgenen op de aangeboren immuunrespons te onderzoeken. Om dit in muismacrofagen te doen, worden muismacrofagen-cellijnen getrypsiniseerd en gecombineerd met transfectedoplossing en de relevante siRNA's; het mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een nucleoFECT 96-wellplaat en er wordt gebruikgemaakt van een Maxa 96-welltransfectiesysteem om siRNA in de macrofagen te transfecteren. Na incubatie met celkweekmedium worden LPS of andere activatoren van de aangeboren immuniteit toegevoegd aan de getransfecteerde macrofagen om deze te stimuleren. Ten slotte worden ELISA's uitgevoerd om de cytokinproductie te monitoren en het effect van de siRNA-behandeling op de aangeboren immuunrespons te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van lipide-gemedieerde transfectie is dat onze assay robuust is en in high-throughput processen op veel genen kan worden toegepast. De sleutel tot deze methode is om met gezonde cellen te werken, deze voorzichtig te behandelen en efficiënt te werken tijdens het transfectieproces. Zoals we zullen aantonen, maakt dit protocol gebruik van de RAW 264.7 muismacrofagen-cellijn, die wordt gekweekt zoals beschreven in het bijbehorende document.Ter voorbereiding van de INA-transfectieplaat worden de cellen bij een confluentie van 20% uitgezaaid en gedurende één of twee dagen gekweekt totdat de cellen maximaal 80% confluent zijn. Het is belangrijk om cellen te gebruiken die zich tussen passage drie en 10 bevinden. Start na het ontdooien deze procedure door het 96-wells shuttle-systeem te programmeren dat voor de transfectie zal worden gebruikt.Om dit te doen, start u de software voor de 96-well shuttle via het bestandmenu linksboven op de computer die aan de shuttle is gekoppeld. Selecteer een nieuw parameterbestand. Markeer de wells die getransfecteerd zullen worden op het weergegeven schema van de 96-wells plaat.Een groen kader geeft de geselecteerde wells aan. Kies het programma dat overeenkomt met de gebruikte macrofaag-cellijn voor raw 2 64 0.7-cellen. Selecteer DS 1 36 en kies apply.Let op dat na het selecteren van een programma de wells op de schematische plaat gekleurd worden. Donkerblauwe lege cirkels geven wells aan die geen programma hebben toegewezen gekregen en niet zullen worden geschokt. Bereid vervolgens de werkende nucleo-effectoroplossing door de SF-cellijn 96-well nucleo-effectoroplossing te mengen met de volledige inhoud van de bijgevoegde supplementbuis.Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur. Warm het D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25%trypsine EDTA en de PBS op tot 37 °C. Bereid het experimentele S-I-R-N-A-P max GFP-controleplasmid of de fluorescentiegelabelde siRNAs voor door ze op ijs te ontdooien om adherente macrofagen van de celkweekschalen los te maken.S吸ireer het medium af en was de cellen twee keer met 10 milliliters PBS. Verwijder vervolgens de PBS en incubeer de cellen met één milliliter voorverwarmde 0,25% tripsin EDTA per plaat totdat de cellen beginnen los te laten. Dit duurt één tot twee minuten.Tik voorzichtig op de plaat en beweeg de oplossing tijdens de incubatie om de trypsinisatie te maximaliseren. Nadat de cellen zijn losgekomen, voegt u voorzichtig negen milliliter DMEM plus FBS-mix toe door herhaaldelijk te pipetteren, en verzamel vervolgens de cellen door ze in een steriele buis te pipetteren. Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een Hema-cytometer.Reken op ongeveer 10 miljoen macrofagen per plaat van 10 centimeter. Bereken het totale aantal benodigde macrofagen; elke well op de 96-well shuttle vereist 200 000 cellen. Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis.Centrifugeer de cellen 10 minuten bij 150 G bij kamertemperatuur in een steriele 96-wells plaat met ronde bodem, wat het mengen vergemakkelijkt en reagentiaverlies minimaliseert. Voeg twee µL van elke siRNA toe aan elke well die getransfecteerd moet worden. Houd er rekening mee dat dit, afhankelijk van het aantal siRNAs, tijdens de centrifugatiestap van de macrofagen kan worden uitgevoerd.Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de electroporatie; de sleutels zijn om de cellen zeer voorzichtig te behandelen en zeer snel te werken. Zodra de cellen zich in een toxische transfectie-oplossing bevinden, wordt het medium van de gecentrifugeerde cellen geaspireerd, waarna ze voorzichtig worden geresuspendeerd in de nucleo effector-oplossing. SF met toevoeging van de supplementoplossing.Breng de cellen onmiddellijk over naar een steriel reservoir met behulp van een multikanalspipet. Breng 20 µL van het resuspenderde cellengemengsel over naar elke put van de 96-well plaat die de siRNAs bevat, waarbij voorzichtig wordt gemengd door op en neer te pipetteren. Breng vervolgens 20 µL van het cellen-INA-mengsel over naar de 96-well nucleofectieplaat. Het is cruciaal om het ontstaan van bellen tijdens deze stap te vermijden, aangezien dit fouten tijdens de nucleofectie kan veroorzaken.Nadat alle experimentele monsters in de transfectieplaat zijn geplaatst, wordt deze afgedekt met het meegeleverde deksel en zeer voorzichtig op een hard oppervlak getikt. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, wordt de 96-wellsplaat in de 96-wells nucleo effector shuttle geplaatst, waarna rechtsonder op het programmascherm 'upload' en 'start' wordt geselecteerd. Volg vervolgens de aanwijzingen van het programma om de resultaten op te slaan tijdens het proces van nucleo affection in de wells.Getransfecteerde cellen worden op het schema van de 96-wellplaat op het scherm weergegeven door een groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met een minteken geeft een fout aan, waarschijnlijk veroorzaakt door luchtbellen of het pipetteren van een onjuist volume reagentia direct na nucleofectie. Gebruik een meerkanaalpipet om 80 µL voorverwarmd RPMI 1640 toe te voegen.Voeg het medium aan de zijkant van elk putje toe. Laat het medium langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, aangezien deze in dit stadium zeer kwetsbaar zijn. Het te snel toevoegen van het medium zal de levensvatbaarheid aanzienlijk verminderen.Plaats de 96-wellplaat met getransfecteerde monsters en RPMI 1640 in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor twee minuten of langer. Het is essentieel om de cellen te laten herstellen voordat verdere manipulaties worden uitgevoerd. Haal de plaat uit de incubator en gebruik een multikanalenpipet om het mengsel voorzichtig vanuit elke well over te brengen naar een 96-well plaat voor weefselkweek.Voeg vervolgens met de meerkanaalspipet 100 microliters DMEM met FBS toe aan elk putje. Incubeer gedurende 24 tot 36 uur; voer direct na transfectie en herstel flowcytometrie uit. Om de transfectie-efficiëntie van fluorescentielabelled SI irna te beoordelen, moeten meer dan 99% van de cellen de dag na de transfectie-assay getransfecteerd zijn. Voor de transfectie-efficiëntie van het GFP-plasmide moeten 30 tot 50% van de cellen GFP tot expressie brengen. Bereid na de incubatie van 24 tot 36 uur LPS of andere activatoren van de aangeboren immuniteit voor in vers medium; verdun het LPS tot een eindconcentratie van 20 nanograms per milliliter in DMEM met FBS.Aspire vervolgens voorzichtig het medium uit de 96-wells plaat en voeg het verse medium met LPS toe aan de cellen. Plaats de plaat in een incubator om de respons op LPS of andere stimulatoren van de aangeboren immuniteit op verschillende tijdstippen na stimulatie te monitoren. Pipetteer het supernatant van de cellen in een 96-wells bewaarplaat voor analyse via ELISA.Nadat het supernatant is verwijderd om de celviabiliteit te bewaken, voegt u 100 µL van een 1:100 verdunning van fluoresceïne-diacetaat in PBS toe aan elke well en incubeert u dit gedurende één tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Monitor de fluorescentie in de cellen met een platenlezer wanneer de stof door cellulaire esterases in levende cellen wordt gesplitst. Deze verbinding wordt fluorescent om het nut van deze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons te illustreren.siRNA's gericht op bekende regulatoire genen van de aangeboren immuniteit werden getransfecteerd in de RAW 264.7 macrofagen-cellijn. De cellen werden vervolgens gestimuleerd met LPS en de productie van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en TNF-α werd gemonitord via ELISA, zoals hier wordt getoond.Remming van toll-like receptor vier, de receptor voor LPS, maar niet van andere TLR's. Met behulp van SIR werd een sterk verminderde productie van LPS-geïnduceerde IL zes en TNF alfa waargenomen. Merk op dat remming van IL zes met irna de productie van IL zes verminderde, maar geen effect had op de productie van TNF alfa.Deze gegevens suggereren een goede effectiviteit en specificiteit van siRNA-gemedieerde knockdown van kandidaat-regulatoren van de aangeboren immuniteit. Het is belangrijk om te onthouden dat de sleutel tot een goede transfectie en een goed celherstel ligt in het werken met zeer gezonde cellen, deze voorzichtig te behandelen tijdens het transfectie- en herstelproces, en snel te werken zodra de cellen zich in een nucleo-effectoroplossing bevinden. Na deze procedure kunnen vele andere assays worden uitgevoerd, waaronder QPCR om de gen-knockdown te monitoren en diverse andere assays om de aangeboren immuunrespons te onderzoeken.

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a reporter cell-based assay for screening potential bioactive nanoparticles that inhibit Toll-like receptor (TLR) signaling. The assay involves introducing lipopolysaccharides (LPS) mixed with peptide-gold nanoparticle hybrids to reporter macrophages expressing the reporter proteins — secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) and luciferase. The reduction of LPS-induced TLR signal mediated by the hybrids is determined by measuring the reporter signals.

An Assay to Screen Bioactive Nanoparticles for Toll-Like Receptor Signaling Inhibition

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.

Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen In Vitro en In Vivo

Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Leer RNA-interferentie in muizenmacrofagen voor het bestuderen van aangeboren immuniteit met behulp van siRNA-transfectie en LPS-stimulatie. Deze methode maakt efficiënt genonderzoek in immunologie mogelijk.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Meer video's verkennen