Name: Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Leer RNA-interferentie in muizenmacrofagen voor het bestuderen van aangeboren immuniteit met behulp van siRNA-transfectie en LPS-stimulatie. Deze methode maakt efficiënt genonderzoek in immunologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dank aan Brad Lackford voor de hulp bij het optimaliseren van enkele van de technieken die in dit manuscript worden beschreven.

1. Onderhoud van macrofaagcellijnen <ol><li> Groeien RAW264.7 en J774A.1 cellijnen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in aanwezigheid van 5% CO2. Om steriliteit te behouden, voeg 1% penicilline / streptomycine (pen / strep) aan de media (hoewel dit niet strikt noodzakelijk). </li><li> Kritische stap: Zorg ervoor dat de macrofagen groeien in een gezonde staat voor een efficiënte transfectie en siRNA-geïnduceerde gen-knockdown. Gebruik cellen tussen passages 3 en 10 na de verse ontdooien, omdat deze macrofagen lijnen vertonen de beste transfectie-efficiëntie en onderhouden robuuste post-transfectie overleven in deze fase; geen gebruik maken van een hogere passage aantal (&gt; 20), zoals transfectie-efficiëntie en gen knockdown beide verminderen sterk. </li><li> Voor optimale siRNA transfectie cellaag bij 20% confluentie groeien en één of twee dagen tot de cellen niet meer dan 80% confluentie bereiken. Overgrown cellen zullen niet transfecteren efficiently. </li></ol> 2. Het programmeren van de 96-well Shuttle Systeem voor Transfection <ol><li> Start de 96-well shuttle-software op de computer is aangesloten op de shuttle. Selecteer nieuwe parameter file vanaf linksboven bestand menu. </li><li> Markeer de putjes die worden getransfecteerd op de getoonde 96-well plaat schema. Een groen vakje geeft aan welke bronnen zijn geselecteerd. </li><li> Selecteer het programma dat overeenkomt met de macrofaag cellijn gebruikt (DS-136 voor RAW264.7 of DS-130 voor J774A.1) en selecteer toepassing, onder de diagramed 96-well plaat gelegen. Merk op dat na het selecteren van een programma, de putten op het schema plaat wordt gekleurd donkerblauw. Lege cirkels geven putten die niet zijn toegewezen aan een programma en zal niet geschokt. </li></ol> 3. Voorbereiden van de reagentia voor transfectie <ol><li> Bereid de werkende Nucleofector ™ oplossing door het mengen van SF-cellijn 96-well Nucleofector ™ -oplossingmet de volledige inhoud van de bijgevoegde supplement buis. Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur vóór gebruik. Slaan overtollige volledige Nucleofector ™ oplossing bij 4 ºC gedurende maximaal 3 maanden voor toekomstig gebruik. </li><li> Voorverwarmen het DMEM, RPMI-1640, 0,25% trypsine / EDTA, en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C alvorens met de macrofagen voor transfectie. </li><li> Bereid de siRNA voor transfectie door ontdooien op ijs. Om het aantal vries dooi van de siRNA minimaliseren bevriezen nieuwe siRNA in aliquots de eerste keer gebruikt. </li><li> In eerste experimenten gebruikt siRNA bij een relatief hoge dosis van 2 uM (verdund 1:10 van 20 uM voorraden). Vervolgens titreren siRNA&#39;s die robuuste gen knockdown neer op lagere doses veroorzaken, hoewel doorgaans hogere doseringen nodig zijn voor een efficiënte gen knock-down in macrofagen in vergelijking met andere soorten cellen. OPMERKING: siRNA&#39;s zijn verkrijgbaar uit vele bronnen; vrij robuust gen knock-down kan worden verkregengebruik siGenome SMARTPOOLs die pools vier siRNAs targeting elk gen. Als negatieve controle, gebruik een van de verschillende niet-targeting siRNA zwembaden of siRNA&#39;s. </li><li> De transfectie-efficiëntie te controleren, of het transfecteren pmaxGFP controle plasmide (verschaft in de Amaxa kits) of fluorescentie-gemerkt siRNA parallel aan de experimentele siRNA. Verwacht 30-50% transfectie van het GFP plasmide (bepaald met microscopie of flowcytometrie de dag na transfectie) en&gt; 99% transfectie van fluorescent-gelabelde siRNA (geanalyseerd door flow cytometrie onmiddellijk na transfectie en herstel). </li></ol> 4. Voorbereiding van de macrofagen voor Transfection <ol><li> Los aanhangend macrofagen uit de celkweek gerechten door behandeling met trypsine. Zuig het medium en was de cellen tweemaal met 10 ml PBS. Na verwijdering van het PBS, incubeer de cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine / EDTA (1 ml / 10 cm schaal) gedurende 1-2 min tot cellen beginnen te los. Tik voorzichtig de plaat en beweeg de oplostie tijdens de incubatie trypsine maximaliseren. </li><li> Na de incubatie, voeg 9 ml DMEM + FBS media, meng voorzichtig op en neer, en verzamel de cellen door pipetteren in een steriele buis. </li><li> Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een hemocytometer. Verwachten ongeveer 10 miljoen macrofagen per 10 cm plaat. Bereken het aantal macrofagen nodig; elke put op de 96-well shuttle vereist 200.000 cellen. Vergeet niet om de waarde van de cellen van een paar extra putten &#39;toe te staan ​​voor pipetteren verliezen. </li><li> Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen gedurende 10 min bij 150 xg bij kamertemperatuur. Wees niet te snel centrifugeren als deze macrofagen gezondheid en transfectie-efficiëntie zal afnemen. </li></ol> 5. Nucleofection van macrofagen met siRNA <ol><li> Met behulp van een steriele 96-well ronde bodemplaat (dat vergemakkelijkt het mengen terwijl het minimaliseren van reagens verlies), voeg 2 pi van elke siRNA aan elk putje te zijn transfweerspiegelde. Opmerking: Afhankelijk van het aantal siRNAs, kan dit worden bereikt tijdens de macrofaag centrifugatiestap. </li><li> Zuig het medium van de cellen gecentrifugeerd. Voorzichtig resuspendeer de cellen in Nucleofector ™ oplossing SF (bevattende het supplement oplossing), met 20 gl per 200.000 cellen gepelleteerd. Eenmaal geresuspendeerd, gebruiken de cellen onmiddellijk voor optimale transfectie. </li><li> Transfer geresuspendeerd cellen in een steriele trog; met een multichannel pipet 20 ul van de geresuspendeerde cellen mengsel in elk putje van de 96-well plaat met de siRNA. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren. </li><li> Overdracht 20 ul van de cel / siRNA mengsel in de 96-well Nucleocuvette ™ plaat Kritische stap:. Vermijd genereren bubbels tijdens de overdracht stap als deze fouten tijdens Nucleofection kan induceren. </li><li> Na het plaatsen van alle experimentele monsters in de transfectie, bovenkap de 96-well plaat met de ontvangen deksel en very tik zachtjes op een hard oppervlak om eventuele luchtbellen uit de monsters te verwijderen. </li><li> Plaats 96-well plaat met deksel in de 96-well Nucleofector shuttle en selecteer &#39;uploaden en start&#39; in de rechterbenedenhoek van het scherm programma. Voorafgaand aan Nucleofection, volgt het programma prompt om de resultaten op te slaan. Opmerking: Bij het Nucleofection proces putjes succes getransfecteerd worden afgebeeld op de 96-well schema op het scherm een ​​groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met mintekens een fout aangeeft, waarschijnlijk door luchtbellen of verkeerd pipetteren de juiste hoeveelheid reagentia. </li></ol> 6. Herstel en Plating van macrofagen <ol><li> Onmiddellijk na Nucleofection, met een multichannel pipet wordt 80 ul voorverwarmde (37 ° C) RMP1-1640 medium aan elk putje. Voeg de media aan de zijkant van elk putje, waarbij de media langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, die zeer gevoelig in dit stadium. Laat de media niet toe te snel, want dit zalsterk verminderen levensvatbaarheid. </li><li> Plaats de 96-well platen met getransfecteerde monsters en RPMI-1640 in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 2 min; Dit is essentieel om de cellen voorafgaand aan manipulatie verdere herstellen. </li><li> Verwijder de 96-well plaat uit de incubator en zorgvuldig overbrengen van het mengsel uit elk putje in een 96-well weefselkweek plaat met een multichannel pipet. </li><li> Met een multichannel pipet, voeg 100 ul voorverwarmde (37 ° C) DMEM + FBS medium in elk putje. </li><li> Incubeer de 96-well weefselkweek plaat met monsters in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 24-36 uur (optimaliseren precieze timing individuele siRNA, hoewel dit tijdsbereik algemeen goed werkt). </li></ol> 7. Stimulatie van macrofagen met LPS <ol><li> Na de 24-36 uur na Nucleofection incubatie, bereiden LPS (of andere PAMPs) in vers medium. Bereid voldoende vers medium van alle putjes (200 ul media / putje van de 96-well plaat plus een beetje extra voor pipetteren). LPS verdunnen tot een eindconcentratie van 20 ng / ml in DMEM + FBS. </li><li> Zorgvuldig aspireren media van de 96-well plaat en voeg de vers medium met de LPS aan de cellen. </li><li> Monitor de respons op LPS of andere PAMPs op verschillende tijdstippen na stimulatie. 6 uur is voldoende om een ​​robuuste inflammatoire cytokine respons op cytokinen zoals IL-6 en TNFa genereren. </li></ol> 8. Controle op de Induced aangeboren immuunrespons, Gene Knockdown en levensvatbaarheid in macrofagen <ol><li> Bewaken LPS geïnduceerde cytokineproductie, pipet het supernatant van de cellen in een 96-wells plaat. Cytokineproductie kan dan gemeten door ELISA. </li><li> Nadat de supernatant wordt verwijderd, monitoren cellevensvatbaarheid met fluoresceïne diacetaat (indien gesplitst door cellulaire esterasen in levende cellen, deze verbinding wordt fluorescerend). Identificeer siRNA&#39;s die genen te richten dat de levensvatbaarheid van cellen te controleren met behulp van de tzijn aanpak. Opmerking: de transfectie proces zelf moet weinig effect hebben op de levensvatbaarheid indien goed uitgevoerd. <ol><li> Voeg fluoresceïne diacetaat (5 mg / ml voorraad in aceton) aan elke well (1: 100 eindverdunning in PBS). </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende één tot vijf minuten en vervolgens controleren fluorescentie in de cellen met behulp van een plaatlezer (460 nm excitatie, 515 nm emissie). </li><li> Optioneel: Om de fluorescentie in de putten uniform, lyseren van de cellen met buffers zoals RIPA; Dit verschaft een uniform fluorescent signaal in de put, zoals sommige plaatlezers zijn geconfigureerd om slechts een klein deel van de put te controleren; als de cellen niet gelijkmatig zijn bedekt, zou de fluoresceïnediacetaat een onjuiste lezing te geven. </li></ol></li><li> Als alternatief voor controle cellevensvatbaarheid, monitor-siRNA geïnduceerd gen knockdown door qPCR met RNA afkomstig van de hechtende cellen. <ol><li> Nadat het supernatant van de cellen verwijderd (stap 8.1), add RLT buffer (die wordt gebruikt voor lysis en conservering van RNA) direct aan de hechtende cellen te lyseren. </li><li> Isoleer RNA met een RNA-preparaat kit zoals de RNeasy mini-kit en gebruik qPCR met genspecifieke primers bewaken gen knockdown opzichte van siRNA behandeling controleren. Gebruik primers Βactin of GAPDH voor normalisatie. </li></ol></li><li> Als een ander alternatief voor andere aspecten van de aangeboren immuunrespons controleren, bewaken de fagocytische capaciteit van macrofagen door toevoeging van FITC-gelabelde E. coli deeltjes direct op de hechtende cellen met een kit. Naar aanleiding van de fabrikant protocol, dat slechts een paar uur duurt, bewaken fagocyterende opname met behulp van een plaat lezer of microscopie. </li></ol>

<ol><li>Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufmann%2C+SHE+%22The+innate+immune+response+to+infection%22">The innate immune response to infection</a>. , ASM Press. (2004).</li>
<li>Adams, D. O., Hamilton, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of macrophage activation.</a> Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).</li>
<li>Fujiwara, N., Kobayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammation.+Current+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+allergy%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammation. Current drug targets.</a> Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).</li>
<li>Gordon, S., Martinez, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+mechanism+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: mechanism and functions.</a> Immunity. 32, 593-604 (2010).</li>
<li>Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%3A+an+immunologic+functional+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective.</a> Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).</li>
<li>Fairweather, D., Cihakova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophages+in+infection+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity.</a> Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).</li>
<li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization comes of age.</a> Immunity. 23, 344-346 (2005).</li>
<li>Burke, B., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+B+%22The+macrophage%22">The macrophage</a>. , 2nd edn, Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+methodologies+for+the+functional+study+of+signaling+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules.</a> PloS one. 4, (2009).</li>
<li>Carralot, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high-throughput+siRNA+transfection+in+raw+264.7+macrophages%3A+a+case+study+for+optimization+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+screening%22%5BJournal%5D)">Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure.</a> Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).</li>
<li>Alper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+innate+immunity+genes+and+pathways+using+a+comparative+genomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22ProcNatl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach.</a> ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).</li>
<li>De Arras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+innate+immunity+protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bio.+Chem%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network.</a> J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+regulators+of+the+systemic+response+to+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+innate+immune+genes+by+transcriptional+profiling+of+macrophages+stimulated+with+TLR+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands.</a> Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).</li>
<li>Yang, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+that+mediate+innate+immunity+using+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice.</a> Genetics. 183, 1535-1544 (2009).</li>
<li>Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+macrophage+cell+lines+transformed+by+Abelson+leukemia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus.</a> Cell. 15, 261-267 (1978).</li>
<li>Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysozyme+synthesis+by+established+human+and+murine+histiocytic+lymphoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines.</a> The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).</li>
<li>Zumbansen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+siRNA+library+screening+in+hard-to-transfect+HUVEC+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+RNAi+and+gene+silencing%22%5BJournal%5D)">First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells.</a> Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aliprantis, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+activation+and+apoptosis+by+bacterial+lipoproteins+through+toll-like+receptor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2.</a> Science. 285, 736-739 (1999).</li>
<li>Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+double-stranded+RNA+and+activation+of+NF-kappaB+by+Toll-like+receptor+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3.</a> Nature. 413, 732(2001).</li>
<li>Conforti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+effects+of+toll-like+receptor+%28TLR3%29+signaling+in+tumors+can+be+therapeutically+uncoupled+to+optimize+the+anticancer+efficacy+of+TLR3+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands.</a> Cancer Res. 70, 490-500 (2010).</li>
<li>Fernandez-Botran, R., Větvička, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFernandez-Botran%2C+R+%22Methods+in+Cellular+Immunology%22">Methods in Cellular Immunology</a>. 8, CRC Press. 8(2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. Dit artikel werd gesponsord door Lonza, Inc.

Talrijke studies gepubliceerd waarin individuele genen zijn het doelwit van siRNA in murine macrofagen. Terwijl lipide gemedieerde transfectie is gebruikt om siRNA leveren macrofaagcellijnen individueel, deze methoden lijden mogelijke effecten op de levensduur beperkt gen knockdown en variabiliteit van gen tot gen. Robuustere assays die kunnen worden gebruikt om genen in middel- of high-throughput fashion gericht ontwikkelen, optimaliseerden we technieken met de Amaxa Nucleofector 96 putjes pendelsysteem, die meer samen...

In dit protocol beschrijven we efficiënte methoden om genen in muizen macrofaag cellijnen met siRNA remmen en de effecten van de behandelingen die de aangeboren immuunrespons. Deze procedures worden uitgevoerd in 96-well formaat, waardoor RNAi schermen in middel- of high-throughput wijze. In reactie op infectie, mens zet onmiddellijk aangeboren immuunrespons en een trager, maar specifieker adaptieve immuunrespons. Deze snelle aangeboren immuunrespons impliceert de werving en activering van fagocyterende aangeboren immuuncellen waaronder macrofagen 1. Klassiek geactiveerde macrofagen betrokken zijn bij acute ontstekingsreacties en produceren antimicrobiële eiwitten en verbindingen, cytokinen en chemokinen, en presenteren antigenen 2,3. Alternatief geactiveerde macrofagen een rol spelen bij het ​​reguleren van de immuniteit, het handhaven tolerantie, weefselherstel en wondgenezing 4-8. Vanwege hun gemak functies, Macrofagen een rol in talrijke ziekten zoals atherosclerose, artritis, kanker en 9 spelen. Zo is de studie van macrofagen is een belangrijk onderzoeksgebied enige tijd in diverse ziektecategorieën. Ondanks hun belang in de aangeboren immuunrespons, kan macrofagen uitdagend cellen om mee te werken. In het bijzonder is het moeilijk om doelmatige transfectie met lipide reagentia in macrofagen te verkrijgen zonder geassocieerde toxiciteit 10,11. Zelfs wanneer siRNA efficiënt afgeleverd macrofagen, de robuustheid van RNAi-geïnduceerde gen vaak knockdown kan tamelijk gematigd zijn en kunnen variëren van gen tot gen. Om deze technische uitdagingen te overwinnen, hebben wij transfectie en knock-down technieken 12-16 geoptimaliseerd in twee muis macrofaag cellijnen, RAW264.7 17 en J774A.1 18. Deze aanpak maakt gebruik van de Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem voor transfectie; dit systeemeen combinatie van speciale reagentia en elektroporatie cellen in 96-well formaat 19 transfecteren. Na transfectie, beschrijven we methoden om cel herstel en de levensvatbaarheid te maximaliseren en de daaropvolgende siRNA-geïnduceerde gen knockdown maximaliseren. Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze benadering beschrijven we een protocol voor siRNA levering aan deze macrofaag cellijnen, stimuleren deze cellen met lipopolysaccharide (LPS), en bewaken de aangeboren immuunrespons op het productieniveau van verscheidene pro-inflammatoire cytokines. Wij bieden sample data in welke doelgroep we de Toll-like receptor (TLR) familie, waarvan de leden voelen LPS en andere pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), om aangeboren immuniteit te regelen.

<table><tbody><tr><td>Amaxa nucleofector 96-well shuttle system</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001S</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 mouse macrophage cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 mouse macrophage cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>siGenome smartpool siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>varies depending on gene</td><td></td></tr><tr><td>Non-targeting control siRNA pool</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-13-20</td><td></td></tr><tr><td>Block-iT fluorescent oligo for electroporation</td><td>Invitrogen</td><td>13750062</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure E. coli O111:B4 LPS</td><td>List Biological Laboratories</td><td>421</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin solution (Pen/Strep)</td><td>Fisher</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>96-well tissue culture plates</td><td>Fisher</td><td>07-200-89 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom sterile plates (not coated)</td><td>Fisher</td><td>07-200-745</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Duoset ELISA kit</td><td>R&amp;D Biosystems</td><td>DY406</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF&alpha; Duoset ELISA kit</td><td>R&amp;D Biosystems</td><td>DY410</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378</td><td></td></tr><tr><td>RLT buffer</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant Phagocytosis Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td>V-6694</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van rna-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrofagen zijn belangrijke fagocytische aangeboren immuuncellen. Wanneer macrofagen een ziekteverwekker tegenkomen, produceren ze antimicrobiële eiwitten en verbindingen om de ziekteverwekker te doden, produceren ze verschillende cytokinen en chemokinen om andere immuuncellen aan te trekken en te stimuleren, en presenteren ze antigenen om de adaptieve immuunrespons te stimuleren. Daarom is het belangrijk om macrofagen efficiënt te kunnen manipuleren met technieken zoals RNA-interferentie (RNAi) om deze belangrijke aangeboren immuuncel te onderzoeken. Macrofagen kunnen echter technisch uitdagend zijn om te transfecteren en kunnen een inefficiënte RNAi-geïnduceerde gen-knockdown vertonen. In dit protocol beschrijven we methoden om twee muismacrofagen-cellijnen (RAW264.7 en J774A.1) efficiënt te transfecteren met siRNA met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System en beschrijven we procedures om het effect van siRNA op gen-knockdown te maximaliseren. Bovendien zijn de beschreven methoden aangepast om in 96-well formaat te werken, waardoor middelgrote en hoogdoorvoerstudies mogelijk zijn. Om de bruikbaarheid van deze aanpak te demonstreren, beschrijven we experimenten die RNAi gebruiken om genen te remmen die lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde cytokineproductie reguleren.

Om de efficiëntie van transfectie deze aanpak demonstreren we gevolgd opname van FITC-gemerkt siRNA met een flow cytometer (figuur 1). Ter illustratie van het nut van onze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons, transfecteerden wij siRNAs targeting bekend aangeboren immuun regulerende genen in de RAW264.7 macrofaag cellijn, de cellen gestimuleerd met LPS, en vervolgens gecontroleerd productie van pro-inflammatoire cytokines IL 6 en TNFa. Verschillende TLR&#3...

In dit protocol beschrijven we methoden om efficiënt muis macrofaag cellijnen te transfecteren met siRNA's met behulp van het Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle Systeem, de macrofagen te stimuleren met lipopolysaccharide, en de effecten op de productie van inflammatoire cytokinen te monitoren.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-interferentie te gebruiken om het effect van kandidaatgenen op de aangeboren immuunrespons te onderzoeken. Om dit in muismacrofagen te doen, worden muismacrofagen-cellijnen getrypsiniseerd en gecombineerd met transfectedoplossing en de relevante siRNA's; het mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een nucleoFECT 96-wellplaat en er wordt gebruikgemaakt van een Maxa 96-welltransfectiesysteem om siRNA in de macrofagen te transfecteren. Na incubatie met celkweekmedium worden LPS of andere activatoren van de aangeboren immuniteit toegevoegd aan de getransfecteerde macrofagen om deze te stimuleren. Ten slotte worden ELISA's uitgevoerd om de cytokinproductie te monitoren en het effect van de siRNA-behandeling op de aangeboren immuunrespons te beoordelen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van lipide-gemedieerde transfectie is dat onze assay robuust is en in high-throughput processen op veel genen kan worden toegepast. De sleutel tot deze methode is om met gezonde cellen te werken, deze voorzichtig te behandelen en efficiënt te werken tijdens het transfectieproces. Zoals we zullen aantonen, maakt dit protocol gebruik v

using-rna-interference-to-investigate-innate-immune-response-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an assay to examine the toll-like receptor(TLR)-dependent activity of the transcription factors nuclear factor-kappa-B (NF-κB) and activator protein-1 (AP-1) in macrophages. The TLRs trigger a pro-inflammatory signaling cascade upon recognizing damage-associated molecular patterns (DAMPs), activating NF-κB and AP-1. The engineered reporter macrophages produce secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) enzyme upon NF-κB and AP-1 activation, which is detected via a...

An Assay for TLR-Dependent NF-&kcy;B/AP-1 Transcription Factor Signaling in Macrophages

This video demonstrates a reporter cell-based assay for screening potential bioactive nanoparticles that inhibit Toll-like receptor (TLR) signaling. The assay involves introducing lipopolysaccharides (LPS) mixed with peptide-gold nanoparticle hybrids to reporter macrophages expressing the reporter proteins — secreted embryonic alkaline phosphatase (SEAP) and luciferase. The reduction of LPS-induced TLR signal mediated by the hybrids is determined by measuring the reporter signals.

An Assay to Screen Bioactive Nanoparticles for Toll-Like Receptor Signaling Inhibition

We beschrijven een protocol bij de antivirale cytokine productie in muizen geïnfecteerd met een model herpesvirus, muizen gamma herpesvirus 68 (γ HV68) die nauw verwant aan humane Kaposi-sarcoom geassocieerde herpesvirus (KSHV) en Epstein-Barr virus (EBV) te meten. Gebruik makend van genetisch gemodificeerde muizen en muis embryonale fibroblasten (MEF) hebben we de antivirale cytokine productie zowel in vivo als ex vivo. "Bereiding" de uitdrukking van aangeboren immuunsysteem componenten in...

Ontleden Innate Immune Signalering in Viral Evasion van cytokine productie

We beschrijven hier een eenvoudig protocol om muis-peritoneale macrofagen te isoleren. Deze procedure wordt gevolgd door RNA-extractie om genexpressieanalyse uit te voeren na stimulatie van Toll-achtige receptoren.

Isolatie van muizen peritoneale macrofagen uit te voeren analyse van genexpressie Bij Toll-like receptoren Stimulatie

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Beschrijven we een methode van het gebruik van polyethyleneimine (PEI)-gecoat superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes voor transfecting macrofagen met siRNA. Deze nanodeeltjes kan efficiënt siRNA leveren aan macrofagen in vitro en in vivo en stilte doel genexpressie.

Ijzeroxide Polyethyleneimine-gecoate nanodeeltjes als een voertuig voor de levering van kleine Mengend RNA aan macrofagen In Vitro en In Vivo

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Om het effect van een Chemokine op macrofaag werving in vivo te testen, werd de hele mount in situ-hybridisatie gebruikt om de ectopische uitdrukking van de Chemokine te detecteren en werd immunokleuring gebruikt om macrofagen te labelen. Live Imaging werd gebruikt voor real-time observatie van macrofaag migratie.

Een Ectopic Chemokine-expressie model voor het testen van macrophage Recruitment in vivo

Dit protocol biedt onderzoekers een snelle, indirecte methode voor het meten van TLR-afhankelijke NF-кB/AP-1 transcriptiefactor-activiteit in een muriene macrofaag cellijn in reactie op een verscheidenheid aan polymere oppervlakken en geadsorbeende eiwit lagen die de micro omgeving van het biomateriaal implantaat modelleren.

Een macrophage reporter Celassay om Tolachtige receptor-gemedieerde NF-kB/AP-1-signalering op geadsorbeerde proteïne lagen op polymere oppervlakken te onderzoeken

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Leer RNA-interferentie in muizenmacrofagen voor het bestuderen van aangeboren immuniteit met behulp van siRNA-transfectie en LPS-stimulatie. Deze methode maakt efficiënt genonderzoek in immunologie mogelijk.

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Meer video's verkennen