Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-interferentie te gebruiken om het effect van kandidaatgenen op de aangeboren immuunrespons te onderzoeken. Om dit in muismacrofagen te doen, worden muismacrofagen-cellijnen getrypsiniseerd en gecombineerd met transfectedoplossing en de relevante siRNA's; het mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een nucleoFECT 96-wellplaat en er wordt gebruikgemaakt van een Maxa 96-welltransfectiesysteem om siRNA in de macrofagen te transfecteren. Na incubatie met celkweekmedium worden LPS of andere activatoren van de aangeboren immuniteit toegevoegd aan de getransfecteerde macrofagen om deze te stimuleren. Ten slotte worden ELISA's uitgevoerd om de cytokinproductie te monitoren en het effect van de siRNA-behandeling op de aangeboren immuunrespons te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van lipide-gemedieerde transfectie is dat onze assay robuust is en in high-throughput processen op veel genen kan worden toegepast. De sleutel tot deze methode is om met gezonde cellen te werken, deze voorzichtig te behandelen en efficiënt te werken tijdens het transfectieproces. Zoals we zullen aantonen, maakt dit protocol gebruik van de RAW 264.7 muismacrofagen-cellijn, die wordt gekweekt zoals beschreven in het bijbehorende document.

Ter voorbereiding van de INA-transfectieplaat worden de cellen bij een confluentie van 20% uitgezaaid en gedurende één of twee dagen gekweekt totdat de cellen maximaal 80% confluent zijn. Het is belangrijk om cellen te gebruiken die zich tussen passage drie en 10 bevinden. Start na het ontdooien deze procedure door het 96-wells shuttle-systeem te programmeren dat voor de transfectie zal worden gebruikt.

Om dit te doen, start u de software voor de 96-well shuttle via het bestandmenu linksboven op de computer die aan de shuttle is gekoppeld. Selecteer een nieuw parameterbestand. Markeer de wells die getransfecteerd zullen worden op het weergegeven schema van de 96-wells plaat.

Een groen kader geeft de geselecteerde wells aan. Kies het programma dat overeenkomt met de gebruikte macrofaag-cellijn voor raw 2 64 0.7-cellen. Selecteer DS 1 36 en kies apply.

Let op dat na het selecteren van een programma de wells op de schematische plaat gekleurd worden. Donkerblauwe lege cirkels geven wells aan die geen programma hebben toegewezen gekregen en niet zullen worden geschokt. Bereid vervolgens de werkende nucleo-effectoroplossing door de SF-cellijn 96-well nucleo-effectoroplossing te mengen met de volledige inhoud van de bijgevoegde supplementbuis.

Laat de gemengde reagentia equilibreren bij kamertemperatuur. Warm het D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0,25%trypsine EDTA en de PBS op tot 37 °C. Bereid het experimentele S-I-R-N-A-P max GFP-controleplasmid of de fluorescentiegelabelde siRNAs voor door ze op ijs te ontdooien om adherente macrofagen van de celkweekschalen los te maken.

S吸ireer het medium af en was de cellen twee keer met 10 milliliters PBS. Verwijder vervolgens de PBS en incubeer de cellen met één milliliter voorverwarmde 0,25% tripsin EDTA per plaat totdat de cellen beginnen los te laten. Dit duurt één tot twee minuten.

Tik voorzichtig op de plaat en beweeg de oplossing tijdens de incubatie om de trypsinisatie te maximaliseren. Nadat de cellen zijn losgekomen, voegt u voorzichtig negen milliliter DMEM plus FBS-mix toe door herhaaldelijk te pipetteren, en verzamel vervolgens de cellen door ze in een steriele buis te pipetteren. Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een Hema-cytometer.

Reken op ongeveer 10 miljoen macrofagen per plaat van 10 centimeter. Bereken het totale aantal benodigde macrofagen; elke well op de 96-well shuttle vereist 200 000 cellen. Pipetteer het berekende aantal cellen in een centrifugebuis.

Centrifugeer de cellen 10 minuten bij 150 G bij kamertemperatuur in een steriele 96-wells plaat met ronde bodem, wat het mengen vergemakkelijkt en reagentiaverlies minimaliseert. Voeg twee µL van elke siRNA toe aan elke well die getransfecteerd moet worden. Houd er rekening mee dat dit, afhankelijk van het aantal siRNAs, tijdens de centrifugatiestap van de macrofagen kan worden uitgevoerd.

Het meest uitdagende aspect van deze procedure is de electroporatie; de sleutels zijn om de cellen zeer voorzichtig te behandelen en zeer snel te werken. Zodra de cellen zich in een toxische transfectie-oplossing bevinden, wordt het medium van de gecentrifugeerde cellen geaspireerd, waarna ze voorzichtig worden geresuspendeerd in de nucleo effector-oplossing. SF met toevoeging van de supplementoplossing.

Breng de cellen onmiddellijk over naar een steriel reservoir met behulp van een multikanalspipet. Breng 20 µL van het resuspenderde cellengemengsel over naar elke put van de 96-well plaat die de siRNAs bevat, waarbij voorzichtig wordt gemengd door op en neer te pipetteren. Breng vervolgens 20 µL van het cellen-INA-mengsel over naar de 96-well nucleofectieplaat. Het is cruciaal om het ontstaan van bellen tijdens deze stap te vermijden, aangezien dit fouten tijdens de nucleofectie kan veroorzaken.

Nadat alle experimentele monsters in de transfectieplaat zijn geplaatst, wordt deze afgedekt met het meegeleverde deksel en zeer voorzichtig op een hard oppervlak getikt. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, wordt de 96-wellsplaat in de 96-wells nucleo effector shuttle geplaatst, waarna rechtsonder op het programmascherm 'upload' en 'start' wordt geselecteerd. Volg vervolgens de aanwijzingen van het programma om de resultaten op te slaan tijdens het proces van nucleo affection in de wells.

Getransfecteerde cellen worden op het schema van de 96-wellplaat op het scherm weergegeven door een groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met een minteken geeft een fout aan, waarschijnlijk veroorzaakt door luchtbellen of het pipetteren van een onjuist volume reagentia direct na nucleofectie. Gebruik een meerkanaalpipet om 80 µL voorverwarmd RPMI 1640 toe te voegen.

Voeg het medium aan de zijkant van elk putje toe. Laat het medium langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, aangezien deze in dit stadium zeer kwetsbaar zijn. Het te snel toevoegen van het medium zal de levensvatbaarheid aanzienlijk verminderen.

Plaats de 96-wellplaat met getransfecteerde monsters en RPMI 1640 in een incubator van 37 °C met 5% CO2 voor twee minuten of langer. Het is essentieel om de cellen te laten herstellen voordat verdere manipulaties worden uitgevoerd. Haal de plaat uit de incubator en gebruik een multikanalenpipet om het mengsel voorzichtig vanuit elke well over te brengen naar een 96-well plaat voor weefselkweek.

Voeg vervolgens met de meerkanaalspipet 100 microliters DMEM met FBS toe aan elk putje. Incubeer gedurende 24 tot 36 uur; voer direct na transfectie en herstel flowcytometrie uit. Om de transfectie-efficiëntie van fluorescentielabelled SI irna te beoordelen, moeten meer dan 99% van de cellen de dag na de transfectie-assay getransfecteerd zijn. Voor de transfectie-efficiëntie van het GFP-plasmide moeten 30 tot 50% van de cellen GFP tot expressie brengen. Bereid na de incubatie van 24 tot 36 uur LPS of andere activatoren van de aangeboren immuniteit voor in vers medium; verdun het LPS tot een eindconcentratie van 20 nanograms per milliliter in DMEM met FBS.

Aspire vervolgens voorzichtig het medium uit de 96-wells plaat en voeg het verse medium met LPS toe aan de cellen. Plaats de plaat in een incubator om de respons op LPS of andere stimulatoren van de aangeboren immuniteit op verschillende tijdstippen na stimulatie te monitoren. Pipetteer het supernatant van de cellen in een 96-wells bewaarplaat voor analyse via ELISA.

Nadat het supernatant is verwijderd om de celviabiliteit te bewaken, voegt u 100 µL van een 1:100 verdunning van fluoresceïne-diacetaat in PBS toe aan elke well en incubeert u dit gedurende één tot vijf minuten bij kamertemperatuur. Monitor de fluorescentie in de cellen met een platenlezer wanneer de stof door cellulaire esterases in levende cellen wordt gesplitst. Deze verbinding wordt fluorescent om het nut van deze aanpak voor het bewaken van de aangeboren immuunrespons te illustreren.

siRNA's gericht op bekende regulatoire genen van de aangeboren immuniteit werden getransfecteerd in de RAW 264.7 macrofagen-cellijn. De cellen werden vervolgens gestimuleerd met LPS en de productie van de pro-inflammatoire cytokinen IL-6 en TNF-α werd gemonitord via ELISA, zoals hier wordt getoond.

Remming van toll-like receptor vier, de receptor voor LPS, maar niet van andere TLR's. Met behulp van SIR werd een sterk verminderde productie van LPS-geïnduceerde IL zes en TNF alfa waargenomen. Merk op dat remming van IL zes met irna de productie van IL zes verminderde, maar geen effect had op de productie van TNF alfa.

Deze gegevens suggereren een goede effectiviteit en specificiteit van siRNA-gemedieerde knockdown van kandidaat-regulatoren van de aangeboren immuniteit. Het is belangrijk om te onthouden dat de sleutel tot een goede transfectie en een goed celherstel ligt in het werken met zeer gezonde cellen, deze voorzichtig te behandelen tijdens het transfectie- en herstelproces, en snel te werken zodra de cellen zich in een nucleo-effectoroplossing bevinden. Na deze procedure kunnen vele andere assays worden uitgevoerd, waaronder QPCR om de gen-knockdown te monitoren en diverse andere assays om de aangeboren immuunrespons te onderzoeken.