Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Het algemene doel van deze procedure is om RNA-interferentie te gebruiken om het effect van kandidaatgenen op de aangeboren immuunrespons te onderzoeken. In muismacrofagen om dit te doen, worden muismacrofagencellijnen getrypsiniseerd en gecombineerd met transfectieoplossing en de SI RNA's van belang, het mengsel wordt vervolgens overgebracht naar een 96-well nucleo VETE-plaat en een Maxa 96-well transfectiesysteem wordt gebruikt om siRNA in de macrofagen te transfecteren en na een incubatie met cellencultuurmedium, LPS of andere activatoren van aangeboren immuniteit worden toegepast op de getransfecteerde macrofagen om ze te stimuleren. Ten slotte worden Eliza's uitgevoerd om cytokineproductie te monitoren en het effect van de siRNA-behandeling op de aangeboren immuunrespons te beoordelen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven lipidegemedieerde transfectie is dat onze test robuust is en kan worden toegepast op veel genen in hoge doorvoerprofessionaliteit. De sleutel tot deze methode is om met gezonde cellen te werken, ze voorzichtig te behandelen en efficiënt te werken tijdens het transfectieproces. Zoals we zullen demonstreren, gebruikt dit protocol de raw 2 64 0.7 muismacrofagencellijn, die wordt gekweekt zoals beschreven in het bijbehorende document.

In voorbereiding op de INA-transfectieplaat, worden de cellen bij 20%co fluentie en een of twee dagen gekweekt totdat de cellen niet meer dan 80%confluent zijn. Het is belangrijk om te onthouden om cellen te gebruiken die zich tussen passage drie en 10 bevinden. Na het ontdooien, begint u deze procedure door het 96-well shuttle systeem te programmeren dat zal worden gebruikt voor transfectie.

Om dit te doen, start u de 96-well shuttle software op de computer die is verbonden met het shuttle vanuit het linkerbovenste bestandsmenu. Selecteer een nieuw parameterbestand. Markeer de putjes die zullen worden getransfecteerd op de weergegeven schematische 96-well plaat.

Een groen vakje geeft de geselecteerde putjes aan. Kies het programma dat overeenkomt met de macrofagencellijn die wordt gebruikt voor raw 2 64 0.7 cellen. Kies DS 1 36 selecteer toepassen.

Let op dat na het selecteren van een programma, de putjes op de schematische plaat worden gekleurd. Donkerblauwe lege cirkels geven putjes aan die geen programma zijn toegewezen en niet worden geschokt. Bereid vervolgens de werkende nucleo effector oplossing voor door SF cell line 96 well nucleo effector oplossing te mengen met de volledige inhoud van de meegeleverde supplementbuis.

Laat de gemengde reagentia bij kamertemperatuur gelijkwaardig worden. Verwarm de D-M-E-M-R-P-M-I 1640 0.25%tripsin EDTA en PBS op 37 graden Celsius. Bereid de experimentele S-I-R-N-A-P max GFP controleplasmide of fluorescent gelabelde siRNA's voor door ze op ijs te ontdooien om aderente macrofagen van de cellencultuur schotels los te maken.

Zuig het medium af en was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS. Vervolgens, na het verwijderen van de PBS, incubeer de cellen met één milliliter voorgewaarschuwde 0.25%tripsin EDTA per plaat totdat de cellen beginnen los te komen. Dit duurt één tot twee minuten.

Tik voorzichtig op de plaat en beweeg de oplossing tijdens de incubatie om trypsinisering te maximaliseren. Nadat de cellen zijn losgekomen, voeg je voorzichtig negen milliliter DMEM plus FBS-mengsel toe door op en neer te pipetten en verzamel vervolgens de cellen door op en neer te pipetten in een steriele buis. Tel het aantal geïsoleerde macrofagen met behulp van een Hema Cytometer.

Verwacht ongeveer 10 miljoen macrofagen per 10 centimeter plaat. Bereken het totale aantal macrofagen dat nodig is per put op de 96-well shuttle vereist 200.000 cellen. Pipet het berekende aantal cellen in een centrifugeerbuis.

Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 150 G bij kamertemperatuur naar een steriele 96-well ronde bodemplaat, die het mengen vergemakkelijkt terwijl reagensverlies wordt geminimaliseerd. Voeg twee microliters van elke IRNA toe aan elk putje dat getransfecteerd zal worden. Let op dat dit, afhankelijk van het aantal siRNA's, tijdens de macrofagencentrifugeringsstap kan worden bereikt.

Het moeilijkste aspect van deze procedure is de elektroporering, de sleutels om de cellen heel voorzichtig te behandelen en heel snel te werken. Zodra de cellen in een toxische transfectieoplossing zijn, zuig het medium van de centrifugeercellen af, suspendeer ze vervolgens voorzichtig in nucleo effector oplossing. SF bevat de supplementoplossing.

Breng de cellen onmiddellijk over naar een steriele trog met behulp van een multi-kanaals pipetteeroverdracht 20 microliters van het resuspendeerde cellenmengsel in elk putje van de 96-well plaat die de siRNA's bevat, voorzichtig gemengd door op en neer te pipetten. Breng vervolgens 20 microliters van de cellen INA-mengsel over in de 96-well nucleo vete plaat. Het is van cruciaal belang om tijdens deze stap geen bubbels te genereren, omdat dit fouten kan veroorzaken tijdens nucleo affectie.

Nadat alle experimentele monsters in de transfectieplaat zijn geplaatst, dek deze af met de meegeleverde deksel en tik het heel voorzichtig op een hard oppervlak. Om eventuele luchtbellen te verwijderen, plaats de 96-well plaat in de 96-well nucleo effector shuttle en selecteer onderaan rechts van het programscherm upload en start. Volg vervolgens de programmaprompt om de resultaten tijdens het nucleo affectieproces op te slaan, wel succesvol.

Getransfecteerd zal worden weergegeven op de 96-well schematische weergave op het scherm door een groene cirkel met een plusteken. Een rode cirkel met een minteken geeft een fout aan, meestal te wijten aan luchtbellen of het pipetten van de onjuiste hoeveelheid reagentia onmiddellijk na nucleo affectie. Gebruik een multi-kanaals pipetteer om 80 microliters voorverwarmde RPMI 1640 toe te voegen.

Medium naar de zijkant van elk. Well laat het medium langzaam mengen met de getransfecteerde cellen, die in dit stadium erg delicaat zijn. He