Analyse van RNA processing Reacties Met behulp van Cell Free Systems: 3 'End Splitsing van pre-mRNA Substrates In vitro
May 3rd, 2014
RNA polymerase II synthetiseert een precursor RNA dat buiten de 3 'uiteinde van het rijpe mRNA. Het uiteinde van het rijpe RNA cotranscriptionally gegenereerd op een plaats bepaald door RNA-sequenties, via de endonuclease activiteit van de splitsing complex. Hier hebben we detail de methode om splitsingreacties studeren in vitro.
Het algemene doel van deze procedure is om met succes drie prime mRNA-splitsing in vitro te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst transcriptioneel actieve nucleaire extract te maken uit cellen die in suspensie zijn gekweekt. De tweede stap van de procedure is het maken van radiogelabelde RNA-substraten via in vitro transcriptie.
De derde stap is om de gelabelde RNA-substraten in een gel te zuiveren. De laatste stap is het samenstellen van de splitsingsreactie, inclusief het nucleaire extract en het gelabelde RNA-substraat. Uiteindelijk kunnen de resultaten drie prime mRNA, UNC-gesplitste substraten en gesplitst product tonen door middel van verticale radioactieve gelelektroforese.
Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, hoewel deze al sinds de jaren tachtig wordt uitgevoerd, is het niet eenvoudig om uit te voeren omdat er veel specifieke stappen in de procedure zijn die uitdagend zijn. Wascellen, gepelleteerd en klaar voor lysering. Om dit protocol te beginnen, voegt u buffer met verse DTT toe aan de celpellet.
Voeg vijf volumes van het geschatte CPV toe en gebruik een pipet om de pellet te breken en laat de suspensie afkoelen op ijs. Na 10 minuten, centrifugeer de cellen bij vier graden Celsius in een zwevende emmer. Zorgvuldig centrifugeren en afzuiging van de supernatant.
De pellet zal wat oplossing hebben geabsorbeerd en in grootte zijn gezwollen. Voeg vervolgens één CPV van buffer A toe en breek de pellet voorzichtig met een pipettip. Giet de suspensie in een gekoelde homogenisator en breek de cellen met vijf tot 12 slagen van een strakke stamper.
Verwijder een kleine aliquot, breng trian blauw aan en controleer de cellen om de volledigheid van hun lysis te bepalen. Indien nodig, blijf de cellen homogeniseren tot ze 90% lysed zijn, maar doe het niet te veel. Breng nu het lysaat over naar een ultraheldere ultracentrifugebuis.
Het bevat de kernen. Spin vervolgens de pellet bij hoge snelheid gedurende 15 minuten. Verwijder het kleine volume van resterend supernatant en bundelt het met de cytosolverzameling.
Bepaal vervolgens het PACT-nucleair volume. Voeg een volume equivalent aan buffer C toe aan de pellet. Los vervolgens de pellet op met behulp van de pipet in een schone homogenisator.
Gebruik vijf tot 10 slagen van een strakke stamper om op te schorsen. Suspendeer de pellet. Breng het homogenaat over in een gekoelde buis en meng het gedurende 30 minuten door middel van inversie.
Bij vier graden Celsius kan een roerplaat worden gebruikt. Als het volume groot genoeg is, brengt u het lysaat over naar een UltraClear ultracentrifugebuis en centrifugeert u het bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Bij ongeveer 25.000 gs is de supernatant het nucleaire extract.
Volg het tekstprotocol en voltooi de dialyse vanaf slechts één microgram sjabloon. Bereid de sonde voor door in vitro transcriptie met behulp van een kit met een SP zes of T zeven compatibele promotor. Bij het laden van de pagina, gebruikt u drie microliter marker en alle 25 microliter van de reactie voor elke RNA-substraat.
Voorkom ook kruisbesmetting door de banen van vergelijkbare grootte transcripten uit elkaar te plaatsen. Laat de gel zo lopen dat een 600 nucleotide sonde ongeveer twee uur later zou lopen bij 25 watt. Om de locatie van gelbanden te markeren, verlicht u de blootgestelde film met een lichtkast en plaatst u de verpakte gel erop.
Lignen de auto rad-marker en de blootgestelde marker op de film. Markeer vervolgens de bandlocaties met zwarte marker om de banden te verwijderen. Haal de gel uit elkaar. En met een schone mes snijdt u de bandsecties van de gel, brengt elke sectie over in zijn eigen buis en elueert het RNA volgens standaardprocedures.
Nadat alle reagentia zijn voorbereid, verwarmt u het gelabelde RNA gedurende twee minuten tot 80 graden Celsius. Breng vervolgens het RNA over naar ijs vortex, de 10% PVA, en centrifugeer het vervolgens bij hoge snelheid gedurende enkele minuten om luchtbellen te verwijderen, en ga vervolgens verder met het maken van de mastermixes voor elke reactie. Dispenseer voor elke reactie 5,25 microliter van mastermix een.
Voeg vervolgens 6,25 microliter van de nucleaire extractmix toe. Voeg vervolgens een microliter van gelabeld RNA-substraat toe, verdund tot 50 ano molair in totaal. Elke reactie gebruikt minder dan vijf ano molair gelabeld RNA.
Vortex vervolgens voorzichtig en draai snel de reactiemixes neer. Laat de reactie plaatsvinden gedurende maximaal twee uur bij 30 graden Celsius. Het nemen van een tijdsverloop van de reactie zal de beste resultaten opleveren. Na gebruik van proteinase K om het eiwit in de reactie te verteren en vervolgens de reactie te zuiveren, gebruikt u de fenol chloroform-methode om de producten uit te voeren op een 6% paginalading, drie microliter marker of vijf microliter per reactieproduct per baan.
Laat vervolgens de gel lopen en demonteer later voorzichtig de gelapparatuur. Om de gel te verzamelen, drukt u filterpapier stevig tegen deze en draait u deze om. Druk stevig op het glas om ervoor te zorgen dat de gel volledig wordt vastgegrepen door het papier.
Verwijder vervolgens langzaam het filterpapier met de gel eraan. Wikkel de blootgestelde kant van de gel in plastic en zet het pakpapier vast met tape aan de andere kant van het filterpapier. Maak het af door de gel 15 minuten in een droger te leggen met het filterpapier naar de vacuüm gericht.
Analyseer later de gel door deze bloot te stellen aan een film of fosfo-imager. De gesplitste RNA-substraat is de langzaamst migrerende band aan de bovenkant van de gel.
Het specifiek gesplitste product gemarkeerd door een dikke pijl, loopt sneller in de gel op de verwachte grootte. Dit product is afwezig in de controle met een puntmutatie in de pollier-sequentie. Kwantificering van de splitsingsactiviteit werd bepaald met een DS metrische plot.
Vergelijk de verhouding van gesplitst naar gesplitst RNA, genormaliseerd naar de gesplitste RNA-controle. Volgens deze procedure kunnen andere methoden zoals een polyadenyleringsassay worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de activiteit van polyA-polymer
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de onderzoeking van drie prime mRNA splitsing in vitro, een cruciaal proces in RNA-rijping. De methode omvat het gebruik van transcriptioneel actief nucleair extract en radioactief gelabelde RNA-substraten om splitsingsreacties te analyseren.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- RNA-biologie
- Moleculaire biologie
- Biochemie
Achtergrond
- RNA-polymerase II synthetiseert precursor-RNA dat zich uitstrekt voorbij het 3'-uiteinde van het volwassen mRNA.
- Het splitsingscomplex bepaalt de plaats voor de generatie van volwassen RNA.
- Cotranscriptionele processen zijn essentieel voor RNA-rijping.
- Inzicht in splitsingsreacties kan inzicht geven in RNA-verwerkingsmechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om drie prime mRNA-splitsing in vitro te onderzoeken.
- Om de rol van nucleair extract in RNA-verwerking te begrijpen.
- Om de producten van splitsingsreacties te analyseren met behulp van gelelektroforese.
Gebruikte methoden
- Bereiding van transcriptioneel actief nucleair extract van in suspensie gekweekte cellen.
- Synthese van radioactief gelabelde RNA-substraten via in vitro transcriptie.
- Gel-zuivering van gelabelde RNA-substraten.
- Samenstelling van splitsingsreacties met nucleair extract en gelabelde RNA-substraten.
Belangrijkste resultaten
- Er werd succesvolle splitsing van drie prime mRNA-substraten waargenomen.
- Resultaten werden geanalyseerd door middel van verticale radioactieve gelelektroforese.
- UNC-gesplitste substraten en gesplitste producten werden geïdentificeerd.
- De methodologie biedt een raamwerk voor het bestuderen van RNA-splitsingsreacties.
Conclusies
- Deze studie schetst een betrouwbare methode voor het onderzoeken van mRNA-splitsing in vitro.
- Inzicht in splitsingsmechanismen kan de kennis van RNA-verwerking verbeteren.
- De resultaten dragen bij aan het bredere veld van RNA-biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding RNA 3' end processing is critical for target validation in RNA-based therapeutics, where precise transcript maturation influences protein expression levels and functional outcomes. This in vitro cleavage assay enables mechanistic de-risking by isolating the biochemical requirements for accurate pre-mRNA processing, supporting predictive confidence in target engagement. The method provides a quantitative, reproducible system to evaluate how genetic or pharmacological perturbations affect RNA stability and function, informing early discovery decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of RNA processing mechanisms to validate transcript-specific targets involved in gene expression regulation.
- Operational Value: Provides a controlled system to assess how mutations in polyadenylation signals affect cleavage efficiency and RNA stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of cleavage products to support assay standardization for screening modulators of RNA processing factors.
- Operational Value: Uses gel-based detection to ensure reproducibility and scalability across multiple RNA substrates and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by linking RNA processing defects to aberrant transcript isoforms observed in pathological states.
- Operational Value: Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation by defining biochemical thresholds for functional RNA maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, where RNA target validation precedes lead identification and preclinical evaluation by clarifying the functional impact of transcript processing on protein output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA regulatory elements and mechanistic de-risking of targets involved in mRNA maturation.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized substrate preparation and quantitative product detection via gel electrophoresis.
- Analytics: Enables comparison of cleavage efficiency across conditions using normalized product-to-substrate ratios for data-driven target prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining processing competence as a biomarker for RNA-based therapeutic suitability.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating RNA-targeting modalities across multiple programs and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in RNA target validation by reducing ambiguity in transcript processing mechanisms.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized nuclear extract preparation and labeled substrate quantification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking RNA processing fidelity to expected protein expression and functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying targets with robust, regulatable RNA maturation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA biochemistry, and radioactive labeling techniques.
- Dependent on ultracentrifugation, gel electrophoresis, and autoradiography infrastructure for nuclear extract preparation and product detection.
- Necessitates cross-team standardization of substrate design, reaction conditions, and quantification methods to ensure comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the assay to diverse RNA substrates or disease-relevant systems.
- Limited by the technical complexity of nuclear extract isolation and the need for careful optimization to avoid nonspecific degradation.
