Name: Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer de isolatie van nucleaire fracties uit CA1-hippocampussnedes na inductie van langdurige potentiatie. Deze methode onderzoekt activiteitsafhankelijke nucleaire import van eiwitten bij leerprocessen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door de DFG (SFB 779 TPB8, Kr1879/3-1 MRK), DIP-subsidie (MRK), EU FP7 MC-ITN NPlast (MRK), Centrum voor Gedragsneurowetenschappen (CBBS, Sahsen-Anhalt), (AK en SB), MM is een ontvanger van European Molecular Biology Organization (EMBO) Long-Term Fellowship (EMBO ALTF 884-2011) en Marie-Curie IEF.

1 Voorbereiding van de Acute hippocampus Slices van volwassen hersenen van de rat <ol><li> Verdoven van ratten met isofluraan. LET OP: Voer de procedure met behulp van een gesloten exicator, niet inhaleren isofluraan. Zorg ervoor dat het dier volledig verdoofd. </li><li> Onthoofden de rat, isoleert de hersenen, en dompel in gecarboniseerd (95% O 2/5% CO2 gasmengsel) ijskoude Gey-oplossing (samenstelling in mM: 130 NaCl, 4,9 KCI, 1,5 CaCl2 · 2H 2 O 0,3 MgSO4 · 2H 2 O, 11 MgCl2 · 6H 2 O, 0.23 KH 2PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 · 7H 2 O, 5 Glucose · H2O, 25 HEPES, 22 NaHCO3, pH 7,32) gedurende 30 min 1,2,10,16. </li><li> Verwijder het cerebellum en een deel van de entorhinale cortex. Scheid de corticale hemisferen met een mid-sagittale snede, plaats dan elk halfrond neer op zijn mediale oppervlak. Daarna makenEen 50-70 ° snede (50-70 ° dwars) langs de dorsale rand van elk halfrond 13,14. </li><li> Lijm elk halfrond met de vers gesneden oppervlak op het snijden platform van het snijden systeem. Het platform moet worden gedekt door precarbogenated ijskoude Gey&#39;s oplossing. </li><li> Snijd 350 micrometer 50-70 ° dwarse plakjes van anterior naar posterior kant met behulp van een vibratome aangepast aan z-as trilling te minimaliseren. De hippocampale formatie, subicular en entorhinale cortex, en de cortex die zich dorsolaterale de hippocampus een deel van de segmenten gebruikt voor experimenten 13,14 zijn. </li><li> Transfer hippocampale plakjes een U-vorm en ondergedompelde soort incubator en incubeer gedurende ten minste 2 uur bij 32 ° C met carbogenated kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF die in mM: 110 NaCl, 2,5 KCI, 2,5 CaCl2 · 2H 2 O, 1.5 MgSO 4 · 2H 2 O, 1.24 KH 2 PO 4, 10 Glucose · H 2O, 27.4 NaHCO3, pH 7,3) 1,2,10,16. </li></ol> 2 Plaatsing van de elektroden, Baseline opnemen, en inductie van LTP <ol><li> Breng de hippocampus slice om een ​​ondergedompelde soort opname kamer onder een microscoop gemonteerd. Perfuseren (6-7 ml / min) met carbogenated ACSF ten minste 30 minuten bij 32 ° C. </li><li> Bereid glazen capillaire micro-elektroden gevuld met ACSF (top resistentie 3-5 MQ). </li><li> Plaats een glazen micro-elektroden gevuld met ACSF in het CA1 Schaffer-zekerheden vezels voor stimulatie en in de stratum radiatum van CA1 fEPSP opnemen 1,2,10 (figuur 2). De afstand tussen de elektroden moet ongeveer 300 urn. </li><li> Evoke veld prikkelende Postsynaptische Potentials (fEPSPs) door stimulatie van Schaffer-onderpand vezels met tweefasige rechthoekige stroompulsen (200 msec / polariteit) in een range van 3-4 V. </li><li> Voer de maximale stimulatie-test door het meten van de input uitgang relatie en hier de stimulatie sterkte 40% van de maximale fEPSP-hellingswaarden verkregen en houdt deze constant gedurende het experiment. </li><li> Begin de basislijn opname gedurende minstens 15 minuten na de maximale stimulatie test. Meet de respons te testen stimuli elke minuut gedurende het experiment. Voer basislijnregistratie met lage frequentie stimulatie. </li><li> Noteer de basislijn ten minste 30 minuten. </li><li> Voor Late-LTP inductie toepassen hoge frequentie 100 Hz tetanization bestaande uit drie 1 sec stimulustreinen bij 100 Hz met een 5 min intertrain interval. Op het gebied van stimulering binnen CA1 regio 5uM bicuculline verhogen kan in 2 minuten worden gewassen voordat tetanization en dient onmiddellijk na de laatste tetanization worden uitgewassen. </li></ol> 3 Het verzamelen van Schijfjes na inductie van LTP en Snap Bevriezing <ol><li> Stop LTP opnemen 2 min of 30 min na drie treinen van tetanische stimulatie induceren van Late-LTP. </li><li&gt; Verwijder de elektroden en snel overbrengen van de slice op een precold metalen platform geplaatst op droog ijs. Herhaal de procedure voor een controle-slice in U-vormige incubator gehouden. LET OP: Gebruik handschoenen tijdens het werken met droogijs. </li><li> Verzamel elk segment in een 1,5 ml buisje en bewaar bij -80 ° C. </li></ol> 4 Isolatie van Nuclear verrijkte fracties van de CA1 regio van de hippocampus <ol><li> Neem 1,5 ml Eppendorf buizen met de bevroren plakjes van -80 ° C en bewaar ze op ijs. </li><li> Voeg 0,5 ml verse koude TBS buffer die protease (PI) en fosfatase (PS) remmers, in de buis. Incubeer gedurende 2-3 minuten en over te dragen aan een stereomicroscoop. LET OP: Gebruik beschermende handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het werken met PI en PS. </li><li> Ontleden de CA1 stratum pyramidale regio van de hippocampus met behulp van twee naalden. Gebruik een naald voor het vasthouden van de snee onder de stereomicroscoop en de tweede naald voor het snijden van het CA1 gebied. </li><li> Verzamel de ontleed CA1 regio uit 5 segmenten (per groep) in een nieuwe buis van 1,5 ml die 50 ul lysis buffer (1x hypotone lysisbuffer die in mM: 10 HEPES, 1,5 MgCl2, 10 KCl, pH 7,9, met PI en PS). Merk op dat deze hoeveelheid materiaal voldoende om 2-3 immunoblots draaien zal zijn. </li><li> Homogeniseren verzamelde weefsel door voorzichtig en neer te pipetteren. Gebruik een pipet 200 ul. Incubeer het lysaat op ijs gedurende 5-7 minuten om de cellen opzwellen. </li><li> Neem 2 pi van het lysaat, vallen op een microscopisch preparaat, en visualiseren van de zwelling van de cellen onder een helderveld microscoop. Met de juiste zwelling van de cellen de kernen weergegeven als ronde structuren intact. </li><li> Verzamel 20 ui monster in een nieuwe 1,5 ml buis &quot;homogenaat fractie. Voeg 8 ul van 4x denaturerende SDS-monsterbuffer. </li><li> Centrifugeer de resterende lysaten bij 11.000 rpm gedurende 1 minuut. </li><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof voorzichtig van de top (cytosolfractie), transfer in een nieuwe buis en voeg 20 ui 4x monsterbuffer. </li><li> Resuspendeer de pellet in 60 ul van hypotone buffer en voeg 20 ui 4x monsterbuffer. Deze fractie wordt aangeduid als een &#39;nucleaire verrijkte fractie. </li><li> Homogenaat, cytosolische en nucleaire verrijkte fracties kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C of -80 ° C voor later immunoblotting. </li></ol> 5. Semikwantitatieve Immunoblotting voor Synapto-nucleaire Eiwitten <ol><li> Ontdooien monsters en kook ze gedurende 5 minuten bij 95 ° C. </li><li> Neem 5 pl van elke fractie bepaald en de eiwitconcentratie door amido zwart-test of BCA test. </li><li> Laad gelijke hoeveelheid eiwit monsters van homogenaat, cytoplasmatische en nucleaire verrijkte fracties op SDS-PAGE. Monsters van de controle en LTP segmenten moeten op dezelfde gel als directe vergelijking worden geplaatst. </li><li> Voer een standaard western-blotting procedure (natte overdracht wordt aanbevolen). </li><li> Probe de membranen met thij antilichaam van keuze. Vervolgens dezelfde vlekken (of dezelfde monsters lopen parallel) kan worden onderzocht met een cytoplasmatisch marker - neuron specifieke enolase2 (NSE2) en nucleaire marker - NeuN en een actine antilichaam als een laad controle. </li></ol> 6 Data Analysis <ol><li> Efficiëntie van LTP inductie kan worden geanalyseerd door Clampfit software. De gemiddelde helling van basislijnregistratie vergeleken met de hellingen na tetanization behulp van twee-weg ANOVA, p &lt;0,05 werd als significant verschillend. De fEPSP helling waarden afgebeeld in schema als het gemiddelde ± SEM </li><li> Voor de kwantificering van immunoblots, scannen ofwel de autoradiografische film en analyseren de geïntegreerde dichtheid van eiwit bands door ImageJ of fluorescentie bands met een Licor systeem. Waarden van immuunreactieve banden moet worden genormaliseerd voor het laden en blotting controle. Ter vergelijking van de controle en LTP groepen een nonparametrical Mann-Whitney U-test kan worden gebruikt. </li></ol><table border="0"cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Naam van de buffer </td><td> Reagens </td><td> Concentratie (mm) </td><td> Bedrag </td><td> Commentaar / Beschrijving </td></tr><tr><td> Gey-oplossing (pH: 7.3 ~ 7.4) </td><td> NaCl </td><td> 130 </td><td> 7,6 g </td><td> steriele filtratie </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 4.9 </td><td> 0,37 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl2 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,22 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO4 · 2H 2 O </td><td> 0,3 </td><td> 0,0739 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 11 </td><td> 2,24 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 0.23 </td><td> 0,0313 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Na 2 HPO 4 · 7H 2 O </td><td> 0,8 </td><td> 0,2145 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucose · H2O </td><td> 5 </td><td> 0,9909 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> HEPES </td><td> 25 </td><td> 5,96 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 22 </td><td> 1,85 g </td><td></td></tr><tr><td> ACSF (pH: 7.3 ~ 7.4) </td><td> NaCl </td><td> 110 </td><td> 6.428 g </td><td> steriele filtratie </td></tr><tr><td> 1000 ml </td><td> KCl </td><td> 2,5 </td><td> 0,1865 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> CaCl2 · 2H 2 O </td><td> 2,5 </td><td> 0.368 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> MgSO4 · 2H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0.370 g </td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.24 </td><td> 0,169 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Glucose · H2O </td><td> 10 </td><td> 1,9817 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> NaHCO3 </td><td> 27.4 </td><td> 2,3 g </td><td></td></tr><tr><td> 1x Hypotone buffer (pH: 7,9) </td><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 0,23 g </td><td></td></tr><tr><td> 100 ml </td><td> MgCl2 · 6H 2 O </td><td> 1.5 </td><td> 0,0304 g </td><td></td></tr><tr><td></td><td> KCl </td><td> 10 </td><td> 0,07455 g </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1 Buffers.

<ol><li>Behnisch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+Jacob+in+hippocampal+neurons+after+stimuli+inducing+long-term+potentiation+but+not+long-term+depression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of Jacob in hippocampal neurons after stimuli inducing long-term potentiation but not long-term depression.</a> PLoS One. 6 (2), e17276(2011).</li>
<li>Cai, F., Frey, J. U., Sanna, P. P., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+by+the+proteasome+is+required+for+synaptic+tagging+and+the+heterosynaptic+stabilization+of+hippocampal+late-phase+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein degradation by the proteasome is required for synaptic tagging and the heterosynaptic stabilization of hippocampal late-phase long-term potentiation.</a> Neuroscience. 169 (4), 1520-1526 (2010).</li>
<li>Chapman, C. A., Perez, Y., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+GABA%28A%29+inhibition+on+the+expression+of+long-term+potentiation+in+CA1+pyramidal+cells+are+dependent+on+tetanization+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Effects of GABA(A) inhibition on the expression of long-term potentiation in CA1 pyramidal cells are dependent on tetanization parameters.</a> Hippocampus. 8 (3), 289-298 (1998).</li>
<li>Ch'ng, T. H., Uzgil, B., Lin, P., Avliyakulov, N. K., O'Dell, T. J., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+transport+of+the+transcriptional+coactivator+CRTC1+from+synapse+to+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent transport of the transcriptional coactivator CRTC1 from synapse to nucleus.</a> Cell. 150 (1), 207-221 (2012).</li>
<li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldendrin-Jacob%3A+a+protein+liaison+that+couples+NMDA+receptor+signalling+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Caldendrin-Jacob: a protein liaison that couples NMDA receptor signalling to the nucleus.</a> PLoS Biol. 6 (2), e34(2008).</li>
<li>Fainzilber, M., Budnik, V., Segal, R. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+synapse+to+nucleus+and+back+again--communication+over+distance+within+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From synapse to nucleus and back again--communication over distance within neurons.</a> J. Neurosci. 31 (45), 16045-16048 (2011).</li>
<li>Hardingham, G. E., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+versus+extrasynaptic+NMDA+receptor+signalling%3A+implications+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic versus extrasynaptic NMDA receptor signalling: implications for neurodegenerative disorders.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (10), 682-696 (2010).</li>
<li>Ivanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+role+of+synaptic+and+extrasynaptic+NMDA+receptors+in+regulation+of+the+extracellular+signal-regulated+kinases+%28ERK%29+activity+in+cultured+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Opposing role of synaptic and extrasynaptic NMDA receptors in regulation of the extracellular signal-regulated kinases (ERK) activity in cultured rat hippocampal neurons.</a> J. Physiol. 57, 789-798 (2006).</li>
<li>Jordan, B. A., Kreutz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocytoplasmic+protein+shuttling%3A+the+direct+route+in+synapse-to-nucleus+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nucleocytoplasmic protein shuttling: the direct route in synapse-to-nucleus signaling.</a> Trends Neurosci. 32 (7), 392-401 (2009).</li>
<li>Karpova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+and+transducing+the+synaptic+or+extrasynaptic+origin+of+NMDA+receptor+signals+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus.</a> Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).</li>
<li>Kim, M. J., Dunah, A. W., Wang, Y. T., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+NR2A-+and+NR2B-containing+NMDA+receptors+in+Ras-ERK+signaling+and+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential roles of NR2A- and NR2B-containing NMDA receptors in Ras-ERK signaling and AMPA receptor trafficking.</a> Neuron. 46, 745-760 (2005).</li>
<li>Lai, K. O., Zhao, Y., Ch'ng, T. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importin-mediated+retrograde+transport+of+CREB2+from+distal+processes+to+the+nucleus+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Importin-mediated retrograde transport of CREB2 from distal processes to the nucleus in neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (44), 17175-17180 (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LTP+in+cultured+hippocampal-entorhinal+cortex+slices+from+young+adult+%28P25-30%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats.</a> J. Neurosci. Methods. 130 (1), 19-32 (2003).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+activity-dependent+cyclic+AMP-responsive+element-binding+protein+phosphorylation+during+long-lasting+long-term+potentiation+in+area+CA1+of+mature+rat+hippocampal-organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of activity-dependent cyclic AMP-responsive element-binding protein phosphorylation during long-lasting long-term potentiation in area CA1 of mature rat hippocampal-organotypic cultures.</a> Neuroscience. 131 (3), 601-610 (2005).</li>
<li>Perlson, E., Hanz, S., Ben-Yaakov, K., Segal-Ruder, Y., Seger, R., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin-dependent+spatial+translocation+of+an+activated+MAP+kinase+in+injured+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vimentin-dependent spatial translocation of an activated MAP kinase in injured nerve.</a> Neuron. 45 (5), 715-726 (2005).</li>
<li>Xiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+mature+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of mature hippocampal slices in vitro.</a> J. Neurosci. Methods. 98 (2), 145-154 (2000).</li>
<li>Zhao, M., Adams, J. P., Dudek, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-dependent+role+of+NMDA+receptors+in+actin+potential+generation%3A+consequences+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern-dependent role of NMDA receptors in actin potential generation: consequences on extracellular signal-regulated kinase activation.</a> J. Neurosci. 25 (30), 7032-7039 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De stappen in het hierboven beschreven protocol een leidraad hoe voor te bereiden hippocampus acute gesneden uit jonge of volwassen ratten, opwekken en opnemen LTP, snel ontleden gestimuleerde gebied van slice, en voor te bereiden nucleaire verrijkte fractie voor activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te bestuderen. Deze benadering is afgeleid van een combinatie van verschillende methoden onafhankelijk van elkaar gebruikt. We geoptimaliseerde workflow en bieden voldoende gedetailleerd voor de beginner om het opzetten van...

Synaptic N-methyl-D-aspartaat-receptoren (NMDARs) spelen een cruciale rol in synaptische plasticiteit en celoverleving signaleren dat activatie van extrasynaptic NMDARs kan leiden neurodegeneratie en celsterfte. Deze veranderingen hangen af van streng gecontroleerde / gereglementeerde activiteit afhankelijke genexpressie en dus vereisen constante communicatie tussen geactiveerde synapsen of dendrieten en de kern 7. De MAP kinases ERK1 / 2 zijn effectoren van synaptische NMDARs signalering en zijn betrokken bij NMDAR-activatie-geïnduceerde genexpressie, dat signalering via extrasynaptic NMDAR geen of een remmend effect op de ERK1 / 2 activiteit 8,11. Er zijn een aantal eiwitten die zijn aangetoond shuttle tussen distale dendrieten en de nucleus. Veel van deze eiwitten een nucleair lokalisatiesignaal en actief aan de kern 6,9 getransporteerd langs microtubuli in een dynein en importin afhankelijke wijze. Interestingly, sommige boodschappers alleen worden doorgevoerd naar de kern in reactie op specifieke synaptische stimuli. Bijvoorbeeld wordt retrograde transport van cyclisch AMP respons element bindend eiwit 2 (CREB2) geïnduceerd door chemische LTD maar niet LTP 12. Gelokaliseerde NMDAR synaptische stimulatie drijft-CREB gereguleerde transcriptie coactivator (CRTC1) in de kern, een translocatie proces, dat betrokken is bij de lange termijn hippocampale plasticiteit 4. Recent werd aangetoond dat het eiwit boodschapper Jacob naar de kern nadat beide, synaptische en extrasynaptic NMDAR activatie en regelt CREB afhankelijke gentranscriptie 5. De synaptische of extrasynaptic oorsprong van het signaal gecodeerd in een posttranslationele modificatie van Jacob. Synaptische activiteit induceert ERK1 / 2 afhankelijke fosforylatie van Jacob in een cruciale serine op positie 180 (pJacobS 180) dat een voorwaarde voor de daaropvolgende translocatie naar de kern van primaire hippocampale kweek. Bovendien in CA1 neuronen van acute hippocampus plakjes pJacobS 180 naar de kern na Schaffer onderpand LTP maar niet LTD 1,10. pS180 Jacob leidt tot een verhoogde expressie van plasticiteit gerelateerde genen en deze genexpressie terugvoert synaptische functie. In scherp contrast, Jakob die naar de kern na extrasynaptic NMDARs activering niet is gefosforyleerd op Ser180 en kan worden geassocieerd met verschillende eiwit complex in de kern veroorzaken &quot;CREB uitgeschakeld en een retractie van synaptische contacten 10. De meeste gepubliceerde studies over de nucleaire import van synapto-nucleaire eiwit boodschapper zijn gedaan in gedissocieerde neuronale primaire culturen. Daarom zou het interessant zijn om te zien of dergelijke bevindingen kunnen worden gereproduceerd in fysiologisch relevante omstandigheden met behulp van de hippocampus plakjes waar neuronale connectiviteit en functie zijn veel beter bewaard gebleven. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van LTP-deaanhangende nucleaire translocatie van eiwitten boodschappers door immunoblotting. Deze methode is ook geschikt voor het analyseren van activiteit afhankelijke fosforylering van proteïnen in een ruw nucleaire fractie. Specifiek, het huidige protocol omvat de voorbereiding van acute CA1 hippocampus plakjes, inductie, en de opname van LTP. Vervolgens wordt CA1 regio microscopisch ontleed om de gestimuleerde gebied isoleren. Wij gecombineerd en bewerkt het protocol voor nucleaire isolatie door CellLytic nucleaire Extraction Kit met veranderingen die door Zhao en collega&#39;s 17. De geoptimaliseerde procedure omvat de lysis van ontleed CA1 regio hypotone buffer waardoor cel zwelling en afgifte van kernen. Cell lysis en kernen morfologie kan worden bepaald door microscopisch onderzoek. Nuclear verrijking bereikt door een korte centrifugatie stap. Immunoblotting analyse met antilichamen tegen NeuN en NSE2 specifieke merkers van nucleaire of cytosolische fracties, geeft aan dat deze benadering kan worden gebruikt als een snelleen reproduceerbare protocol deze subcellulaire fracties te isoleren en zeer labiele posttranslationele modificaties zoals eiwitfosforylatie bestuderen. Bovendien is deze werkwijze voordelig voor kleine weefselmonsters afkomstig van ontleed CA1 regio van hippocampale plakjes en kan worden gebruikt in combinatie met immunohistochemie van hippocampale plakjes.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>CED 1401 AD/DA converter</td><td>Cambridge Electronics Design, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.iciba.com/stereomicroscope">Stereomicroscoop</a></td><td>Leica S4E, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome</td><td>Leica VT1000S, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geïsoleerde pulsstimulator</td><td>A-M Systems, USA</td><td></td><td>Model 2100</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE systeem</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koeler</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heldere veldmicroscoop</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellencultuur incubator</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Luigs &amp; Neumann, SM-5, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blottingkamer en elektrische voeding</td><td>Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gedompelde opnamekamer</td><td>op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-vormige en gedompelde incubator&nbsp;</td><td>op maat gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische schaar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunne spatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof Pasteur pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kunststof kweekschaaltje</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bunsen beker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spuit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagentia</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.3957.1</td><td>&ge;99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6781.1</td><td>&ge;99.5%, p.a., ACS, ISO</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgSO4&middot;2H2O</td><td>Merck</td><td>5886.05</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>AppliChem</td><td>CAS-NO: 7791-18-6; EC-NO:2320946</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>12034.025</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;2H2O</td><td>Merck</td><td>1.06574.1000</td><td>extra pure</td></tr><tr><td>Glucose&middot;H2O</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.6887.1</td><td>for molecular biology</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>Art.-Nr.9105.4</td><td>PUFFERAN, &ge;99.5%, p.a.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.1000</td><td>pro analysis</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphostop</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicuculline</td><td>Tocris Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Antilichamen</td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Soort</td></tr><tr><td>pJac-s180</td><td>Biogenes</td><td></td><td>konijn (verdund 1:100)</td></tr><tr><td>NeuN</td><td>Milipore</td><td>MAB377</td><td>muis (verdund 1:1.000)</td></tr><tr><td>NSE</td><td>Cell Signaling</td><td>D20H2</td><td>konijn (verdund 1:1.000)</td></tr><tr><td>Beta-actine</td><td>Sigma</td><td>A-5441</td><td>muis (verdund 1:5.000)</td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Soort</td></tr><tr><td>IgG HRP geconjugeerd</td><td>DAKO</td><td></td><td>geit anti-muis (1:5.000)</td></tr><tr><td>IgG HRP geconjugeerd</td><td>NEB</td><td></td><td>geit anti-konijn (1:5.000)</td></tr></tbody></table>

isolatie van ca1 nuclear verrijkte fracties van hippocampus slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van synapto-nucleaire messenger eiwitten

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Bestuderen activiteit afhankelijke eiwitexpressie subcellulaire translocatie of fosforylering essentieel om de onderliggende cellulaire mechanismen van synaptische plasticiteit begrijpen. Lange termijn potentiëring (LTP) en lange termijn depressie (LTD) geïnduceerde acute hippocampale plakken worden algemeen aanvaard als cellulaire modellen van leren en geheugen. Er zijn tal van studies die live cell imaging of immunohistochemie benaderingen gebruiken om de activiteit afhankelijk eiwit dynamiek te visualiseren. Echter deze werkwijzen afhankelijk van de geschiktheid van antilichamen voor immunocytochemie of overexpressie van fluorescentie-gemerkte eiwitten in enkele neuronen. Immunoblotting van eiwitten is een alternatieve methode voor het verstrekken van onafhankelijke bevestiging van de bevindingen. De eerste bepalende factor voor de bereiding van subcellulaire fracties individueel tetanized hippocampale plakken is de lage hoeveelheid materiaal. Ten tweede, de behandeling procedure is cruciaal omdat zelfs zeer korte en kleine manipulaties living plakjes zou activering van bepaalde signaleringscascades induceren. Hier beschrijven we een optimale workflow om voldoende hoeveelheid nucleaire verrijkte fractie van voldoende zuiverheid te verkrijgen van de CA1 regio acute hippocampale plakjes van rattenhersenen. Als een representatief voorbeeld wordt aangetoond dat de ERK1 / 2 gefosforyleerde vorm van het synapto-kerneiwit messenger Jacob actief naar de kern na inductie van LTP en kan worden gedetecteerd in nucleaire verrijkte fractie uit CA1 neuronen.

We hebben eerder aangetoond dat de synapto-kerneiwit messenger Jacob accumuleert in de kern na de inductie van LTP maar niet LTD 1. Bovendien translocatie van Jacob na synaptische stimulatie vereist activatie van MAPK ERK1 / 2 en fosforylering van Jacob op Ser180 (figuur 1). Gefosforyleerd Jacob naar de kern in een importin-afhankelijke wijze en de gefosforyleerde toestand kan worden bewaard gedurende langere tijd door associatie met de intermediaire filament αinternexin 15 <strong...

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

Het algemene doel van dit experiment is om het activiteitsafhankelijke nucleocytoplasmatische transport van eiwitten te bestuderen met behulp van acute hippocampale coupes waarin de neuronale connectiviteit en functie goed behouden blijven. Om dit doel te bereiken wordt in eerste instantie de hippocampus van een volwassen mannelijke rat geïsoleerd, waarna in een tweede stap acute transversale coupes worden geprepareerd. De hippocampale coupes worden overgebracht naar de registratiekamer en de late vorm van LTP wordt geïnduceerd in het CA1 stratum radiatum. Vervolgens worden de gepotentieerde en controlecoupes snap-frozen, waarna de gestimuleerde CA1-regio's worden gedissecteerd om de kernverrijkte fractie te isoleren voor verdere immunoblot-analyse.Resultaten op basis van western blot-analyse tonen verschillen in de nucleaire fosfoproteïneniveaus tussen de gepotentieerde en de controle-slices 30 minuten na de inductie van LTP. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben om twee redenen. Ten eerste de geringe hoeveelheid weefselmonster, en ten tweede het kritieke tijdsbestek dat vereist is voor de lyse van de monsters in hypotone lysebuffer om de

isolation-ca1-nuclear-enriched-fractions-from-hippocampal-slices-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De bereiding van acute hersenplakjes van hippocampi geïsoleerd, evenals de gelijktijdige elektrofysiologische opnames van astrocyten en neuronen...

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

This video demonstrates microRNA-mediated inhibition of excitatory synaptic currents in mouse hippocampal brain slices. The CA3 neurons were infected with a recombinant viral vector harboring a construct for expressing a fluorescent reporter, a light-activated membrane channel, and a microRNA that downregulates the expression of voltage-gated calcium channels. Upon placing a slice in a recording chamber and patching a CA1 neuron with a recording pipette, light pulses were used to stimulate the...

MicroRNA-Mediated Inhibition of Excitatory Postsynaptic Currents in Mouse Hippocampal Slices

De lokalisatie en distributie van eiwitten leveren belangrijke informatie voor het begrijpen van hun cellulaire functies. De superieure ruimtelijke resolutie van elektronenmicroscopie (EM) kan worden gebruikt om de subcellulaire lokalisatie van een bepaald antigeen na immunohistochemie bepalen. Voor weefsels van het centrale zenuwstelsel (CNS), behouden de structurele integriteit behoud antigeniciteit is vooral moeilijk EM studies. Hier nemen we een procedure die is gebruikt om structuren en...

Post-inbedding immunogold Etikettering van Synaptic eiwitten in de hippocampus slice culturen

Corticale netwerken worden gecontroleerd door een kleine, maar gevarieerde set van remmende interneuronen. Functioneel onderzoek van interneuronen vereist daarom gerichte opname en strenge identificatie. Hier beschreven is een gecombineerde aanpak met whole-cell opnames van enkele of synaptically gekoppelde paren van neuronen met intracellulaire etikettering, post-hoc-morfologische en immunocytochemische analyse.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

Deze video-artikel beschrijft experimentele procedures om langetermijnplasticiteit en de daarmee geassocieerde processen zoals synaptische tagging, capture en cross-tagging in de CA1-piramideneuronen te bestuderen met behulp van acute hippocampus-sneden van knaagdieren.

Onderzoek van Synaptic Tagging / Capture en Cross-capture met Acute hippocampus Plakjes van Knaagdieren

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.

Synaptische plasticiteit opnemen in Acute Hippocampal plakjes onderhouden in een kleine volumes Recycling-, perfusie-, en onderdompeling-type kamer systeem

Elektroconvulsietherapie overname (ECS) is een experimentele diermodel van elektroconvulsieve therapie voor ernstige depressie. ECS stimuleert wereldwijd activiteit in de hippocampus, wat leidt tot synaptogenese en synaptische plasticiteit. Hier beschrijven we methoden voor ECS inductie bij ratten en voor subcellular versplintering van hun hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in synaptic eiwitten.

Elektroconvulsietherapie vangsten bij ratten en versplintering van hun Hippocampi te onderzoeken van inbeslagneming-geïnduceerde veranderingen in postsynaptisch dichtheid eiwitten

Het protocol hier geschetste beschrijft de immunofluorescentie analyse, biocytin herstel en kwalitatief hoogwaardige reconstructies van hippocampal CA2 interneuronen na de intracellulaire elektrofysiologische opnames in vitro waardoor neuronale karakterisering en uiteindelijk prima neuronale anatomie worden bestudeerd.

Biocytin herstel en 3D-reconstructies van gevulde Hippocampal CA2 interneuronen

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Leer de isolatie van nucleaire fracties uit CA1-hippocampussnedes na inductie van langdurige potentiatie. Deze methode onderzoekt activiteitsafhankelijke nucleaire import van eiwitten bij leerprocessen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten (Video) | JoVE Journal

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

Meer video's verkennen