Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de

Het algemene doel van deze procedure is het bepalen van genen of pathways die betrokken zijn bij angiogenese door middel van een snelle en kwantitatieve in vitro methode. Dit wordt bereikt door primair of geïmortaliseerde endotheliale cellen de dag vóór de assay serumvrij te laten groeien. De tweede stap bestaat uit het incuberen van de endotheliale cellen met calcine gedurende 30 minuten, gevolgd door het wassen van de cellen met PBS.

Vervolgens worden de endotheelcellen getrypsiniseerd, gefilterd om klonters te verwijderen en geteld. De laatste stap is het combineren van de endotheelcellen met geconditioneerd medium dat mogelijke angiogene factoren bevat en het uitpipetteren hiervan over een gestold basaalmembraanextract. Ten slotte wordt licht- of fluorescentiemicroscopie gebruikt om de buisnetwerken te visualiseren, die vervolgens kunnen worden gekwantificeerd met gespecialiseerde computerprogramma's.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden voor het analyseren van angiogenese is dat deze eenvoudig op te zetten is, relatief goedkoop is, binnen enkele uren tubuli produceert en kwantificeerbaar is bij het demonstreren van deze techniek. Is Erica Bullwinkle een promovendus bij de afdeling biologie van de American University? Transfer drie B 11-cellen met behulp van het juiste medium naar een nieuwe kolf twee dagen voordat u de analyse start; voor de beste resultaten moeten de cellen tussen de tweede en zesde passage zitten bij gebruik.

Kweek de cellen vervolgens gedurende 24 uur in aangevuld dmm. Wanneer de cellen klaar zijn, worden ze serumuitgehongerd. Door het medium te vervangen door serumarm medium, worden de serumuitgehongerde cellen nogmaals 24 uur lang gekweekt.

Voor de beste resultaten is het belangrijk om bij de fabrikant te bevestigen dat de concentratie van de BME-stamoplossing 10 milligram per milliliter is. Ontdooi de gereduceerde groeifactor BME in de koelkast. Aangezien BME stolt bij opwarming, wordt het voor gebruik koud gehouden.

Ontdooi vervolgens de media die nodig zijn voor de assay voor visualisatie met fluorescentie- of confocale microscopie; voeg Calcein AM toe aan de media tot een eindconcentratie van 2 µg/mL. Plaats de met Calcein AM gelabelde cellen gedurende ongeveer 30 tot 45 minuten in het donker. Verwijder na deze tijd de media en was de 3B11-cellen in DPBS. Trypsinise vervolgens de cellen door 1 mL trypsine-EDTA toe te voegen. Nadat de trypsinisatie voltooid is.

Resuspendeer de cellen tot een eindvolume van 10 milliliters. Verwijder in aangevulde dmm eventuele klontjes uit de cellen door ze te filteren via een 100 micrometer cell strainer. Nadat de cellen zijn geteld, resuspendeer ze tot de juiste uiteindelijke concentratie om de tube formation assay te starten.

Zet een 24-wells plaat en tips van één milliliter 20 tot 30 minuten voor het laden voor. Dit voorkomt dat het BME voortijdig stolt wanneer men klaar is om te beginnen. Pipetteer 250 microliters gereduceerde groeifactor BME in elke well van een 24-wells plaat. Vermijd het ontstaan van bellen door de pipet niet tot de laatste aanslag in te drukken.

Controleer bij het pipetteren, zodra de wells zijn gevuld, of er voldoende BME in het centrum van de well is gebleven. Wanneer de meniscus zich vormt en de matrix te dun is, zullen de cellen slechts een monolaag vormen. Incubeer de plaat vervolgens 30 minuten om de BME te laten stollen.

Zodra de BME is uitgehard, mengt u ongeveer 300 µL geconditioneerd medium met 10 µL resuspenderde three B 11-cellen en verdeelt u de celsuspensie in aliquots over de putjes van de plaat. Nadat de plaat in de incubator is geplaatst, zullen er binnen twee tot vier uur buisjes beginnen te vormen. Afhankelijk van de concentratie angiogene factoren in het geconditioneerde medium kan de maximale buisvorming optreden tussen drie en 12 uur. De timing van de assay moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke condities van de studie.

Buizen zullen vaak binnen 18 uur beginnen te degenereren, en de endotheelcellen zullen apoptose ondergaan op het moment van maximale buisvorming. Aspireer voorzichtig het medium uit de put om beschadiging van het buizennetwerk te voorkomen. Was vervolgens elke put met één milliliter DPBS voor onmiddellijke visualisatie.

Voeg één milliliter verse DPBS toe aan elke put en beeldHet buisnetwerk af op een confocale microscoop om een buisnetwerk vast te leggen voor latere visualisatie. Voeg 4%paraldehyde toe aan elke geaspireerde put en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het paraformaldehyde wordt tweemaal gewassen met DPBS, waarna één milliliter verse DPBS aan elke put wordt toegevoegd. Deze beelden tonen aan dat angiogene factoren, uitgescheiden door respectievelijk muiskeratinocyten of fibroblasten, in staat zijn om buisvorming te induceren.

Na verloop van tijd migreren endotheliale cellen en beginnen ze binnen één tot twee uur na het uitplaten kleine vertakkingen te vormen. De maximale buisvorming werd bereikt na vier tot zes uur. Na 24 uur bleven sommige vertakkingen behouden, maar veel cellen werden apoptotisch en de buisjes begonnen los te raken.

Het aantal cellen heeft een grote invloed op de buikvorming. Wanneer er een onvoldoende aantal cellen wordt gezaaid, vormen zich weinig buisjes en is het netwerk minimaal; naarmate er meer cellen worden gezaaid, wordt het buisnetwerk uitgebreider. Echter, bij een te hoge concentratie beginnen de cellen te klonteren of monolagen te vormen, waardoor verschillen tussen behandelingsgroepen gemaskeerd raken. Cellen moeten een minimum van twee passages hebben om een adequate buikvorming te waarborgen.

De groeisnelheid van three B 11 is zo hoog dat 25% van de cellen bij een passage van één dag de volgende dag een confluente kolf opleveren. Hier wordt Image J met de angiogenesis-plugin gebruikt op een calcine AM-gekleurd buisnetwerk om het totale aantal knooppunten, buizen in het netwerk in combinatie en samengesmolten delen op het netwerk te detecteren. Daarnaast kan dit programma worden gebruikt om knooppunten, buizen of het netwerk afzonderlijk te detecteren, welke vervolgens gekwantificeerd kunnen worden.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u in vitro angiogenese op een snelle en betrouwbare manier kunt uitvoeren, terwijl u veelvoorkomende valkuilen vermijdt.