Endothelial Cell Tube Formation Assay voor de

Het algemene doel van deze procedure is om genen of paden te bepalen die betrokken zijn bij angiogenese door middel van een snelle en kwantitatieve in vitro-methode. Dit wordt bereikt door eerst primaire of geïmortaliseerde endotheelcellen de dag voor de test serum te laten uithongeren. De tweede stap is om endotheelcellen gedurende 30 minuten met calcine te incuberen, gevolgd door het wassen van de cellen met PBS.

Vervolgens worden de endotheelcellen getryps in een filter om klonters te verwijderen en geteld. De laatste stap is om endotheelcellen te combineren met geconditioneerd medium dat mogelijke angiogenese-factoren bevat en ze over een verstevigde basement membraanextract te verspreiden. Uiteindelijk wordt licht- of fluorescerende microscopie gebruikt om buisnetwerken te visualiseren, die vervolgens kunnen worden gekwantificeerd met behulp van gespecialiseerde computerprogramma's.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere methoden voor het testen van angiogenese is dat deze gemakkelijk op te zetten is, relatief goedkoop, buisjes binnen enkele uren produceert en kwantificeerbaar is. Dit toont deze techniek. Is Erica Bullwinkle, een afgestudeerde student in de afdeling biologie aan de American University? Met behulp van de juiste media overbrengen drie B 11-cellen in een nieuwe flacon twee dagen voor het starten van de test voor de beste resultaten, moeten de cellen zich tussen de tweede en zesde passage bevinden wanneer ze worden gebruikt.

Laat vervolgens de cellen 24 uur groeien in gesupplementeerd dmm. Wanneer de cellen klaar zijn, worden ze uitgehongerd. Door het medium te vervangen door medium met verminderd serum, laten de uitgehongerde cellen gedurende nog eens 24 uur groeien.

Voor de beste resultaten is het belangrijk om met de fabrikant te bevestigen dat de concentratie van de BME-stockoplossing 10 milligram per milliliter is. Ontdooi het gereduceerde groeifactor-BME in de koelkast. Omdat BME vast wordt bij warmte, wordt het koud gehouden voor gebruik.

Ontdooi vervolgens het medium dat nodig is voor de test voor visualisatie met fluorescentie of confocale microscopie. Voeg calcine AM toe aan het medium met een uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter. Plaats een calcine AM-gelabelde cellen in het donker gedurende ongeveer 30 tot 45 minuten. Verwijder na deze tijd het medium en was de drie B 11-cellen in DPBS. Vervolgens trypsiniseren is de cellen door een milliliter trypsin toe te voegen, EDTA Na voltooiing van trypsine.

Resus suspend de cellen tot een uiteindelijk volume van 10 milliliter. In gesupplementeerd dmm, verwijder eventuele klonters van de cellen door ze door een celstrainer van 100 micrometer te filteren. Na het tellen van de resus cellen, suspendeer ze in de juiste uiteindelijke concentratie om de buisvormingstest te beginnen.

Een 24-wells plaat en een milliliter tips gedurende 20 tot 30 minuten voor het laden. Dit voorkomt dat de BME voortijdig vast wordt wanneer klaar om te beginnen. Pipetteer 250 microliter verdunde groeifactor-BME in elk putje van een 24-wells plaat. Vermijd het maken van bellen door de pijp niet tot het einde te drukken.

Bij het pipetteren, controleer eenmaal de putjes zijn geladen of er voldoende BME overblijft in het midden van de put. Wanneer de meniscus zich vormt, als de matrix te dun is, zullen de cellen alleen een monolaag vormen. Vervolgens incubeer de plaat gedurende 30 minuten om de BME te laten vasten.

Zodra de BME is vastgezet, meng ongeveer 300 microliter geconditioneerd medium met 10 microliter gesuspendeerde drie B 11-cellen en verdeel de celsuspensie in de putjes van de plaat. Nadat de plaat in de incubator is geplaatst, beginnen de buisjes zich binnen twee tot vier uur te vormen. Afhankelijk van de concentratie van angiogenese-factor in het conditiemedium, kan de piek van de buisvorming tussen de drie en 12 uur plaatsvinden. Het timing van de test zal moeten worden geoptimaliseerd voor de individuele studiecondities.

Buisjes beginnen vaak binnen 18 uur te verslechteren en de endotheelcellen zullen apoptose ondergaan. Op het moment van piekbuisvorming. Aspirant media voorzichtig uit de put halen om verstoring van het buisnetwerk te voorkomen. Was vervolgens elke put met een milliliter DPBS voor onmiddellijke visualisatie.

Voeg een milliliter vers DPBS toe aan elke put en beeld het buisnetwerk af op een confocale microscoop om een buisnetwerk te fixeren voor latere visualisatie. Voeg 4% paraldehyde toe aan elke geaspireerde put en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van de paraformaldehyde, was twee keer met DPBS en voeg vervolgens een milliliter vers DPBS toe aan elke put. Deze afbeeldingen tonen aan dat angiogenese-factoren afgescheiden door muis, keratinocyten of fibroblasten in staat zijn om buisvorming te induceren.

Na verloop van tijd migreren endotheelcellen en beginnen zich binnen een tot twee uur na het plateren kleine takken te vormen. Maximale buisvorming werd bereikt na vier tot zes uur. Na 24 uur bleven sommige takken over, maar veel van de cellen werden apoptotisch en begonnen de buizen los te koppelen.

Het aantal cellen heeft een diepgaande invloed op de buisvorming. Wanneer een onvoldoende aantal cellen wordt gezaaid, vormen zich weinig buizen en is het netwerk minimaal. Naarmate meer cellen worden gezaaid, wordt het buisnetwerk uitgebreider. Bij een te hoge concentratie beginnen de cellen echter te klonteren of monolagen te vormen en worden verschillen tussen behandelingsgroepen gemaskeerd. Cellen moeten minimaal twee passages hebben om adequate buisvorming te garanderen.

De groeisnelheid van drie B 11 is zo snel dat 25%van de cellen één dag later een confluente flacon zal opleveren. Hier wordt Image J met de angiogenesis-plugin gebruikt op een calcine AM-gekleurd buisnetwerk om de totale knooppunten, buizen in het mesh in combinatie en gecombineerd op het netwerk te detecteren. Bovendien kan dit programma worden gebruikt om afzonderlijk knooppunten, buizen of mesh te detecteren, die kunnen worden gekwantificeerd.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u in vitro angiogenese op een