Name: AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer mechanische eigenschappen van plantenweefsels in kaart brengen met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode meet celwandstijfheid op weefsel-, cellulair en subcellulair niveau om groei en morfogenese te correleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij geven speciale dank aan Yves Couder voor vele nuttige discussies. Wij danken Atef Asnacios voor de kalibratie van de uitkragingen en discussie. Wij danken Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, en Oliver Hamant voor kritisch lezen. Dit werk werd deels gefinancierd door Human Frontier Science Program subsidie ​​RGP0062/2005-C; de Agence Nationale de la Recherche projecten&#39;&#39; Growpec,&#39;&#39; en&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Bereid glazen dia&#39;s voor montage Sample <ol><li> Bereid inbedding agarose media: 0,7% laag smeltpunt agarose in 10% mannitol (in water). </li><li> Met behulp van een sterke metalen instrument (bijv. boorpunt, kalk), etsen uit een 0,5 x 0,5 cm in het centrum van een microscopie glasplaatje. Of in plaats daarvan, lijm een ​​klein stukje glas lamellen (ongeveer 20 x 200 micrometer) om het glaasje met behulp Araldite lijm. Opmerking: Deze ruwer het oppervlak, om de hechting van de agarose vergemakkelijken zodat de agarose mediasticks of verbeteringen aan de dia. Deze schuif kan worden hergebruikt. </li><li> Plaats een druppel van ongeveer 20 pl inbedding agarose media op het geëtste gebied van het glaasje. Dit geeft een dunne film van agarose. </li><li> Bewaar de glasplaatje in een vochtige doos en wacht tot de agarose media te stollen. </li></ol> 2. Ontledend en montage Meristem Samples <ol><li> Microdissect meristemen voor confocale verbeeldingng: een voor een verwijderen van de bloemen knoppen van de steel door ze naar beneden te trekken met ultra fijne pincet. Het is belangrijk om alle bloemknoppen verwijderen tot de knoppen die niet kelkbladen vertonen (de P1 primordia 14). </li><li> Met behulp van een scheermesje of de punt van de pincet, snijd het meristeem weg van de steel. De snede parallel met het gebied van het meristeem oppervlak wordt gemeten met de AFM. De verkregen apex moet tussen 300 micrometer en 600 micrometer hoog te passen onder de AFM tip. </li><li> Duw de apex in de film van agarose media voorbereid op stap 1.1.4. Kies een positie op het glaasje / agarose en duw zodat de meristeem is zowel rechtstreeks in contact met het glaasje en steekt uit de agarose. Het is cruciaal om het meristeem in de agarose te positioneren binnen de paar seconden die zijn gesneden uit de stam te volgen. Opmerking: Dit is om te voorkomen dat het meristeem uitdroogt. In dit stadium zal de meristeem staan ​​in een crack omdat de agarose gebroken bij de toepassing van druk. </li><li> Bereid verschillende meristemen deze manier batch imaging, mits ze dezelfde hoogte en zijn gepositioneerd op minder dan 500 urn van elkaar op de dia. Houd de bereide meristemen in de vochtige doos terwijl het ontleden extra monsters. OPMERKING: Het beperkt de variatie uit de kalibratie. Idealiter 2 monsters van elke aandoening kan worden voorbereid en willekeurig gemeten. Tot dusver is er geen effect waargenomen van batch imaging op de meting (stress-geïnduceerde respons). Dit kan door de verdunning van stress signaalmoleculen in de agar en / of de bevestigingsoplossing. Ook de stress respons is hetzelfde ongeacht de hoeveelheid monster bereid. </li><li> Voordat we naar de volgende stap, zorg ervoor dat de grens tussen het meristeem en de bloemknoppen droog is. Zo niet, verwijder voorzichtig het overtollige water met behulp van filtreerpapier. Dit zou voorkomen in het volgende stadium dat de gesmoltenagarose overstromingen de steekproef als gevolg van capillaire krachten. </li><li> Met een 20 ul pipet, voeg genoeg gesmolten montage agarose in de scheur gemaakt in stap 1.2.3 in te vullen. en elke meristeem omringen. De agarose moet het niveau van het litteken van de verwijderde bloemknop (primordium) te bereiken. Hiertoe kan het nodig zijn om agarose voegen aan elk uiteinde van de scheur. </li><li> Wanneer de agarose wordt toegevoegd, zal het snel overstromen in de scheur; met de pipet, zuigen een deel van de gesmolten agarose bevestiging dat de meristeem is het hoogste punt van de dia. Dit lost het meristeem, zodat het niet kan bewegen tijdens de beeldvorming. </li></ol> 3. Montage Root of Hypocotyl Samples <ol><li> Voor wortels en hypocotylen geen dissectie nodig. In de dunne film van agarose op de voorbereide glasplaatje, maak een groef ofwel direct op een ets in het glas of over een glazen lamel. Plaats de root of hypocotyl in deze gleuf zorgen dat het in contact met deglas langs zijn gehele lengte. </li><li> Voordat we naar de volgende stap, zorg ervoor dat het monster droog is aan het oppervlak. Zo niet, verwijder voorzichtig het overtollige water met behulp van filtreerpapier. </li><li> Gesmolten Voeg montage agarose rond het monster, zoals in stap 1.2.6. </li></ol> 4. AFM Voorbereiding en Gevoeligheid Kalibratie (voor een JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Monteer een cantilever op de AFM. De cantilever moet met ronde indeuker worden gemonteerd. De straal zal de x, y, z resolutie en de insprong diepte waarop nauwkeurige metingen kunnen worden gearchiveerd bepalen. <ol><li> Om meso-nanoschaal metingen bij het oppervlak van de epidermis is, gebruik dan een 50 nm straal ronde indenter; naar mesoschaal metingen, gebruik dan een 0,5 pm straal ronde indenter; tot microschaal metingen (over 2-3 cellen), gebruik dan een 2,5 micrometer straal rond indenter. </li></ol></li><li> Plaats de laser op het uiteinde van de cantilever. Lijn de laser naar het middenvan de captor met behulp van de spiegel. </li><li> Plaats een schoon glas onder de AFM. OPMERKING: de volgende is ingesteld op het signaal van de laser positie op de AFM receptor vormen tot een vervorming van de cantilever en door het evalueren van de veerconstante van de cantilever te vertalen in een kracht. </li><li> Aanpak met een doel kracht &quot;setpoint&quot; van 1 V. </li><li> Selecteer &quot;force spectroscopy&quot;. Doe een inkeping door het instellen van de maximale &quot;relatieve setpoint&quot; tot 2 V, het &quot;uit te breiden snelheid&quot; tot 40 micrometer / sec, en de &quot;z lengte&quot; tot 5 micrometer. </li><li> In het menu &quot;kalibratie manager&quot;, selecteer het lineaire gedeelte van de forward curve om de gevoeligheid met behulp van de &quot;select fit range&quot; knop past. De &quot;relatieve setpoint&quot; moet worden getransformeerd van &quot;volt&quot; naar &quot;meter&quot;. </li><li> In het menu &quot;kalibratie manager&quot;, selecteer &quot;veerconstante&quot; het evalueren van de elasticity van de cantilever met thermische fluctuaties. Druk op &quot;run&quot; op de spectrale dichtheid plot van de cantilever te verkrijgen. Vind de resonantie piek met de laagste frequentie. Monteer met behulp van de &quot;select fit range&quot;-knop. Opmerking 1: Voor meer informatie over de thermische fluctuaties tuning, lees Cook et al. 15. OPMERKING 2: Het verdient de voorkeur een directe methode om de elasticiteit van de cantilever evalueren middels een verwijzing cantilever (of materiaal met bekende stijfheid). Degene die hier gebruikt werd gedoneerd door Atef Asnacios 16. </li><li> Voeg 200 ul van 10% mannitol oplossing onder de cantilever tip. Lijn de laser naar het midden van de ontvoerder met behulp van de spiegel. </li><li> Opnieuw te kalibreren de gevoeligheid: in het menu &quot;kalibratie manager&quot;, klik op de &quot;onbekende&quot; knop; Herhaal de stappen 2.3 tot en met 2.5. </li></ol> . 5 Data Acquisition: Schijnbare Young&#39;s modulus Cartografie <ol&gt; <li> Plaats de gemonteerde monsters onder de AFM en voeg een 500 pl druppelgrootte van 10% mannitol oplossing op het monster. De mannitol oplossing plasmolyzes de cellen binnen enkele minuten. </li><li> Aanpak met een doel kracht (&quot;set point&quot;) van 20 nN (&quot;set point&quot; mag niet meer dan 3 V niet) </li><li> Streepje met een &quot;relatieve set point&quot; van 200 nn, een &quot;uit te breiden snelheid&quot; van 40 micrometer / sec, en &quot;z lengte&quot; van 5 micrometer. </li><li> Pas de &quot;relatieve setpoint&quot; om een ​​inkeping van 100 nm te verkrijgen voor de 200 nm cantilever of 0,5 micrometer voor de 1 um / 5 micrometer gemonteerd cantilever gemonteerd. </li><li> In &quot;force mapping&quot;-modus, selecteer een regio om te scannen: voor meristemen, 70 micrometer x 70 micrometer met een resolutie (&quot;pixels&quot;) van 64 x 64; voor hypocotylen en wortels, 100 urn x 100 urn met een resolutie van 64 x 64. </li><li> Druk op SCAN om de experimenten te starten. Sla de uitgang. </li&gt; </ol> . 6 Data Analysis: Schijnbare Young&#39;s modulus Berekeningen <ol><li> Open het bestand in de data analyse software. </li><li> Selecteer &quot;batchverwerking&quot; naar dezelfde analyse voor alle bochten van een kaart. </li><li> Selecteer &quot;corrigeren de hoogte voor de buiging van de cantilever&quot; dus om de diepte inspringen halen. </li><li> Selecteer &quot;modulus aanpassingsfunctie Young&#39;s&quot; die aannemen dat de kracht evenredig met de oppervlakte van inkeping. Stel de &quot;tip shape&quot; te parabolische aan te nemen dat de insprong vorm is een parabolische. </li><li> Geef aan de straal van de tip. </li><li> Selecteer bij voorkeur de &quot;terugslag&quot; curve voor de analyse omdat het minder gevoelig is dan de topografie &quot;verlengen&quot; curve. Indien er aanzienlijke kleven van de sonde tijdens de &quot;opgerold&quot; de &quot;verlenging&quot; curve, dat ongevoelig voor plakken. </li><li> Reeksde Poisson-ratio tot 0,5. Druk op analyseren en sla de uitgang. </li></ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li>
<li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+plant+cell+wall+extension+%28creep%29+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263(2009).</li>
<li>Durachko, D. anielM., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+%28Creep%29+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp.%22%5BJournal%5D)">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25(2009).</li>
<li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li>
<li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li>
<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li>
<li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li>
<li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li>
<li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix%3A+Insights+for+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+signaling+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling & behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li>
<li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li>
<li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TipChip%3A+a+modular%2C+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li>
<li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xyloglucan+endotransglucosylase%2Fhydrolase+%28XTH%29+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li>
<li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li>
<li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li>
<li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creep+function+of+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li>
<li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants%3A+the+role+of+pectins+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121(2012).</li>
<li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+signaling%3A+the+new+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li>
<li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana%3A+the+relationship+between+auxin+and+pectin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813(2013).</li>
<li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanics+behind+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li>
<li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FluidFM%3A+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li>
<li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ball+tonometry%3A+a+rapid%2C+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plant+growth+regulation%22%5BJournal%5D)">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li>
<li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+or+driving+force%3F+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549(2011).</li>
<li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In planten, het veranderen van de mechanische eigenschappen een belangrijke rol spelen in het sturen van de groei en morfogenese. Tot op heden is er grote vooruitgang geboekt in het ontrafelen van de genetische en chemische netwerken die de groei van planten onder controle is geweest, maar onze kennis van hoe deze netwerken dragen bij aan en worden beïnvloed door veranderingen in de mechanische eigenschappen is rudimentair. Deze methode moet ons in staat stellen om deze leemte op te vullen, en dus is het van groot belan...

De groei van planten wordt bereikt door gecoördineerde expansie van de starre celwanden dat elke cel van het organisme omringen. Accumuleren bewijsmateriaal wijst erop dat het door de wijziging van de celwand chemie die planten lokaal te bedienen deze uitbreiding. De uitbreiding wordt verondersteld primair gedreven door druk op de celwanden, veroorzaakt door hoge turgor van de cel; deze stam reactie op turgor wordt beheerst door de mechanische eigenschappen van de celwanden 1. Er is weinig bekend van deze mechanische eigenschappen en hoe ze veranderen tijdens de ontwikkeling. Verder weinig bekend over hoe deze mechanische eigenschappen worden gecontroleerd en of feedbacks bijdragen tot celwand chemie veranderen op een wijze die blijkbaar gecoördineerd tussen een tissue. Als we het verband tussen chemische en mechanische veranderingen in de celwanden van planten tijdens de ontwikkeling, en uiteindelijk hoe deze microscopische interacties regeren een plant te begrijpen&#39;S macroscopische groei, een werkwijze die de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen in de cellen of weefsels schaal kan controleren vereist. Werkwijze atomaire kracht microscopie (AFM) beschreven, die gebaseerd is op micrometer of nanometer weefsel compressie of inkepingen, werd berekend dat de mechanische eigenschappen van de celwand in ontwikkelende organen gelijktijdig op subcellulaire resoluties en over de gehele regio weefsel meten. Andere methoden hebben een resolutie die is te laag of te hoog: de extensometer is alleen in staat om de gemiddelde mechanische eigenschappen van een hele weefsel meten op de millimeter schaal 2-4, een schaal die is bijvoorbeeld te groot om vroege gebeurtenissen in meten organogenese; de microindenter kunnen verrichten van metingen bij subcellulaire resolutie op de nanometer schaal, maar het is beperkt tot het meten van geïsoleerde cellen en geen groepen van cellen of organen 5-7. Bij de AFM, de eisend weefsel, cellulair en subcellulaire resoluties kan worden bereikt 8-10. Onlangs hebben verschillende protocollen zijn speciaal ontwikkeld voor de monteurs planten weefsel dat ook kan worden gebruikt 11, 12 gemeten. We zullen hier voor te stellen hoe de elasticiteit van het weefsel te evalueren door meting van de schijnbare Young&#39;s modulus 13. De Young modulus wordt vaak gebruikt om de stijfheid van een materiaal beschrijft. Tijdens kleine vervorming de vereiste kracht vervormen materiaal is evenredig met de oppervlakte van inkeping. De Young modulus is deze coëfficiënt. Bij een continu homogeen materiaal dezelfde coëfficiënt ongeacht de verdieping soort (grootte en vorm) worden gemeten, maar verandert met de snelheid van de meting. Voor de complexe structuur van planten weefsel, hebben we tot nu toe dat de kracht evenredig is met de vervorming waardoor de bepaling van de waargenomeneen coëfficiënt van evenredigheid dat we de naam &quot;schijnbare jonge modulus&quot;. In contrast met continue media in de planten, deze schijnbare modulus jonge gevoelig is voor de grootte van de indrukking. Het komt niet overeen met de jonge moduli van een zuivere celwand. Het beschrijft het beste de elasticiteit van de steigers van de cel-wand van het weefsel.

<table><tbody><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>NanoWizard</td><td>Alle 3-generaties zijn in staat om hetzelfde werk te doen met dezelfde preferment.</td></tr><tr><td>AFM stage</td><td>JPK</td><td>CellHesion</td><td>Vereist voor monsters met een lage topografie (minder dan 11 &micro;m tussen het laagste en het hoogste punt in het gebied van krachtscanning).</td></tr><tr><td>AFM-optics</td><td>JPK</td><td>Top View Optics</td><td>Zeer belangrijk om de positie van het monster te bepalen. Kan worden vervangen door langeafstandsverrekijkers of een microscoop.</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>M125</td><td>Elk type stereomicroscoop zou het kunnen doen.</td></tr><tr><td>150 nm gemonteerde cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Zwitserland</td><td>R150-NCL-10</td><td>Te gebruiken om alleen de celwand op het oppervlak van de opperhuid te meten.</td></tr><tr><td>1 &micro;m gemonteerde cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Zwitserland</td><td>SD-Sphere-NCH-S-10</td><td>Te gebruiken voor het meten van de mechanica van de celwand loodrecht op het oppervlak van de opperhuid.</td></tr><tr><td>Tiploze cantilever</td><td>Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Zwitserland</td><td>TL-NCH-20</td><td>Gebruik een 5 &micro;m gemonteerde cantilever om de lokale mechanica van het weefsel te meten (2-3 cellen breed). We hebben een 5 &micro;m borosilicaatkraal aan een tiploze cantilever bevestigd.</td></tr><tr><td>5 &micro;m silicium microsferen</td><td>Corpuscular</td><td>C-SIO-5</td><td></td></tr><tr><td>Araldite</td><td>Bartik S.A. 77170 Coubet, Frankrijk</td><td></td><td>Araldite voor het bevestigen van de kraal aan de tiploze cantilever.</td></tr><tr><td>Agar-agar met lage smelttemperatuur</td><td>Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410</td><td>BP160-100</td><td>34-45 &#176;C geleerde temperatuur</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>2 Roestvrijstalen No. 5 Pincetten</td><td>Ideal-Tek 6828 Balerna, Zwitserland&nbsp;</td><td>951199</td><td></td></tr></tbody></table>

afm-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en subcellulaire resoluties

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We beschrijven een recent ontwikkelde methode om de mechanische eigenschappen van de oppervlakken van plantenweefsels meten met behulp van atomic force microscopie (AFM) micro / nano-indrukkingen, een JPK AFM. Specifiek, in dit protocol meten we de schijnbare elasticiteitsmodulus van celwanden op subcellulaire resoluties in regio tot 100 urn x 100 urn in floral meristemen, hypocotylen en wortels. Dit vereist een zorgvuldige voorbereiding van het monster, de juiste keuze van micro-indringlichamen en inspringen diepten. Ter compensatie celwand eigenschappen alleen worden metingen uitgevoerd in sterk geconcentreerde oplossingen van mannitol teneinde de cellen plasmolyze en aldus verwijder de bijdrage van cel turgor. In tegenstelling tot andere bestaande technieken door verschillende indringlichamen en inspringing diepte, deze werkwijze maakt gelijktijdige meerschalige metingen <em&gt; Dat wil zeggen op subcellulaire resoluties en over honderden cellen die een weefsel. Dit betekent dat het nu mogelijk om ruimtelijk-tijdelijk kenmerken de veranderingen die plaatsvinden in de mechanische eigenschappen van celwanden tijdens de ontwikkeling, waardoor deze veranderingen gecorreleerd met de groei en differentiatie. Dit is een belangrijke stap om te begrijpen hoe gecoördineerde microscopische cellulaire veranderingen teweegbrengen macroscopische morfogenetische gebeurtenissen. Echter, een aantal beperkingen blijven: de methode kan alleen gebruikt worden op relatief kleine monsters (ongeveer 100 urn in diameter) en slechts externe weefsels; de methode is gevoelig weefsel topografie; het meet slechts bepaalde aspecten van complexe mechanische eigenschappen van het weefsel. De techniek wordt snel ontwikkeld en het is waarschijnlijk dat de meeste van deze beperkingen in de nabije toekomst zal worden opgelost.

In Figuur 1 presenteren we typische Young moduli kaarten van bloemen meristemen (figuren 1A en 1B), jong en oud hypocotylen (figuren 1C-F), en wortelmeristeem (figuur 1G en 1H). In alle experimenten de indenter is halfrond, maar zijn straal verschilt zodat verschillende ruimtelijke resoluties kan worden bereikt Figuren 1C en 1D tonen typische resultaten voor meso-nanoschaal indringlicha...

We beschrijven een methode om mechanische eigenschappen van plantenweefsels in kaart te brengen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop (AFM). We richten ons op hoe mechanische veranderingen die plaatsvinden in celwanden tijdens plantontwikkeling op brede-veld mesoschaal kunnen worden geregistreerd, waardoor deze veranderingen kunnen worden gecorreleerd met groei en morfogenese.

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Het algemene doel van deze procedure is het in kaart brengen van de mechanische eigenschappen van plantenweefsels met behulp van een atoomkrachtmicroscoop. Bereid eerst glazen objectglazen voor door een druppel aros met een laag smeltpunt op een geëtst gebied van het objectglas te pipetteren om een dunne aros-film te vormen. De tweede stap is het dissekeren en monteren van het monster.Verwijder de bloemknoppen van de stengel, snijd de marris-stengel af van de hoofdsteun en bed शुरुआती het afgesneden me-stengel onmiddellijk in de dunne Agros-film op het glas. Schuif vervolgens voldoende gesmolten montage-agros toe om de spleet op te vullen die is ontstaan toen de Maris-stengel in de Aros-film werd ingebed. De laatste stap is het instellen van de atoomkrachtmicroscoop voor de gegevensverwerving.Uiteindelijk genereren data-analyse en metingen van de schijnbare Young-modulus van celwanden een mechanische kaart van de eigenschappen van celwanden, gelijktijdig op subcellulaire resolutie en over volledige weefselregio's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het de mechanische eigenschappen van de celwand gelijktijdig op subcellulaire resolutie en over een volledige regio van het weefsel kan meten. Het Aros-medium voor het inbedden van monsters wordt bereid uit 0,7% low melting temperature aros in 10% mannitol in water.Ets met een sterk metalen instrument, zoals een boorpunt, een gebied van 0,5 bij 0,5 centimeter uit in het midden van een microscopisch objectglas. Dit ruwt het oppervlak op om de adhesie van de agros te vergemakkelijken en ervoor te zorgen dat het agros-medium aan het objectglas hecht of fixeert. Pipetteer een druppel van ongeveer 20 µL inbed-agros-medium op het geëtste gedeelte van het objectglas.Dit resulteert in een dunne laag Agros. Bewaar het objectglas in een bevochtigingsbox en wacht tot het Agros-medium gestold is. Monsters van Arabidopsis zullen worden gebruikt voor atoomkrachtmicroscopie om meristeemmonsters voor te bereiden.Verwijder de bloemknoppen één voor één van de stengel door ze met ultrafijne pincetten naar beneden te trekken. Het is belangrijk om alle bloemknoppen te verwijderen tot aan de knoppen die geen sequels vertonen, bekend als het P1-stadium primordium. Snijd het meristeem met een scheermesje of de punt van de pincet van de stengel af.De snede moet parallel zijn aan het gebied van het meristeemoppervlak dat met de atoomkrachtmicroscoop of een FM gemeten zal worden. De verkregen apex moet een hoogte hebben tussen 300 microns en 600 microns, zodat deze tijdens het experiment niet verbrokkelt. Duw de apex onmiddellijk in de eerder bereide dunne film aros-medium. Kies een positie op het glazen dekglas of aros en duw voorzichtig, zodat het meristeem zowel direct in contact is met het glazen dekglas als uitstekt boven het aros.De agros breekt bij het aanbrengen van druk, waardoor de mari-steel nu in een barst zal staan. Het is cruciaal om de marit-steel binnen enkele seconden na het afsnijden van de steel in de aros te positioneren. Dit voorkomt dat de MA-steel uitdroogt.Op deze manier kunnen meerdere MA-stengels worden klaargemaakt voor batch-imaging, mits ze dezelfde hoogte hebben en op een afstand van minder dan 500 microns van elkaar zijn geplaatst. Bewaar de klaargemaakte MA-stengels op het objectglas in de bevochtigingsbox terwijl u verdere monsters dissekeert. Gebruik voordat u naar de volgende stap gaat filterpapier om voorzichtig elk overtollig water bij de grens tussen het meristeem en de bloemknoppen te verwijderen.Dit is om te voorkomen dat het gesmolten agros door capillaire krachten het monster overstroomt. Voeg later met een pipette van 20 µL voldoende gesmolten montage-agros toe om de eerder gemaakte spleet op te vullen en elk meristeem te omringen; het agros moet het niveau bereiken van het litteken van de verwijderde bloemknop of primordium. Om dit te bereiken, kan het nodig zijn om aan beide uiteinden van de spleet agros toe te voegen.Wanneer de agros wordt toegevoegd, zal deze snel in de kier vloeien. Gebruik de pipette om een deel van de gesmolten montage-agros weg te zuigen om ervoor te zorgen dat de me-stengel het hoogste punt op het objectglas is. Dit fixeert de me-stengel zodat deze niet kan bewegen tijdens de beeldvorming van wortels en hypocotylen.Voor de dunne film van agar is geen dissectie nodig. Gebruik op de voorbereide objectglasplaat micropincetten om een groef te maken, direct boven een etsing in het glas of langs een glazen lamella. Plaats de wortel of hypocotyl in deze groef en zorg ervoor dat deze over de gehele lengte in contact staat met het glas. Voeg gesmolten montage-agar rond het monster toe, op dezelfde wijze als gedemonstreerd voor het stengelmonster.Een JP PK nano wizard. In deze demonstratie wordt een FM gebruikt. Begin deze procedure door een cantilever met een ronde inkeping op de A FM te monteren. De straal bepaalt de X-, Y- en Z-resolutie en de indentatiediepte waarbij nauwkeurige metingen kunnen worden behaald.Gebruik een ronde inkeping met een straal van 50 nanometer voor metingen van meso- tot nanoschaal aan het oppervlak van de epidermis. Gebruik voor metingen op mesoschaal een ronde inkeping met een straal van 0,5 micron, en voor metingen op microschaal over twee tot drie cellen een ronde inkeping met een straal van 2,5 micron; positioneer de laser bij de punt van de cantilever. Richt de laser met behulp van de spiegel op het midden van de detector.Plaats een schoon glas onder de A FM-benadering met een target voor het instelpunt van één volt en selecteer spectroscopie. Voer een indentatie uit door het maximale relatieve instelpunt in te stellen op twee volt, de uitreksnelheid op 40 microns per seconde en de Z-lengte op vijf microns. Selecteer vanuit het menu van de kalibratiemanager het lineaire deel van de voorwaartse curve om de gevoeligheid te fitten.Gebruik de knop 'select fit range' om het relatieve instelpunt te transformeren van vol naar meter bij 200 µL van een 10% mannitol-oplossing. Richt de laser onder de cantilever-tip met behulp van de spiegel opnieuw uit naar het midden van de captor, en kalibreer de gevoeligheid opnieuw via het menu 'calibration manager' door de respecter te verplaatsen. Klik op de knop 'unknown', selecteer 'four spectroscopy' en voer een indentatie uit zoals eerder getoond.Selecteer het lineaire deel van de voorwaartse curve om de gevoeligheid te fitten met de knop 'select fit range' om deze procedure te starten, positioneer de gemonteerde monsters onder de AFM en voeg een druppel van 500 µL 10% mannitoloplossing toe aan de monsters. De mannitoloplossing plasmateert de cellen binnen enkele minuten; nader het doel met een set-point van 20 nN bij indentatie, een relatief set-point van 200 nN en een extendsnelheid van 40 µm/s en een Z-lengte van 5 µm. Pas het relatieve set-point aan om een indentatie van 100 nm te verkrijgen voor de gemonteerde cantilever van 200 nm, of 0,5 µm voor die van 1 µm.Force mapping-modus met een gemonteerde cantilever van vijf micron. Selecteer een gebied om te scannen voor mar-stems van 70 by 70 microns met een resolutie van 64 by 64, en voor hypo cos en wortels van 100 by 100 microns met een resolutie van 64 by 64. Druk op scan om de experimenten te starten en sla de output op.Begin met het openen van het gegevensbestand in de software voor data-analyse. Selecteer vervolgens batchverwerking om dezelfde analyse toe te passen op alle curven van één enkele kaart.Selecteer de juiste hoogte voor de doorbuiging van de cantilever om de indentatiediepte te bepalen. Selecteer de fitfunctie voor de elasticiteitsmodulus. Hierbij wordt ervan uitgegaan dat de kracht proportioneel is aan het oppervlak van de indentatie.Stel de tipvorm in op parabolisch om ervan uit te gaan dat de indrukking een parabool is. Geef de straal van de tip op. Selecteer vervolgens de terugtrekcurve voor de analyse.De retract-curve heeft de voorkeur boven de xtend-curve omdat deze minder gevoelig is voor de topografie. Stel de poso-ratio in op 0,5. Druk ten slotte op on, analyseer de gegevens en sla de output op.Typische AFM-modulaire kaarten van jonge florale Mars-stengels, jonge en oude hypocotylen en wortel-MA-stengels worden hier in alle experimenten getoond. De indrukking is hemisferisch, maar de straal verschilt zodat verschillende ruimtelijke resoluties kunnen worden bereikt. Deze kaarten tonen typische resultaten voor indrukkingen op meso- tot nanoschaal met een straal van 50 nanometer en indrukkingen met een diepte van 50 nanometer.Het cardiogram onthult microschaal-heterogeniteiten in de oppervlaktewanden van hypocodale epidermale cellen. Ook worden typische resultaten getoond voor mesoschaal-indrukken met een straal van 500 nanometer en een diepte van 500 nanometer voor het bloemmeristeem, de hypocotyl en de wortel. Dit cardiogram voor microschaal-indrukken met een straal van 2,5 micron en een diepte van 500 nanometer onthulde weefselverzachting tijdens de orgaaninitiatie die voorafging aan elke zichtbare groei.Deze scan werd echter afgebroken omdat het bereik van de monsterhoogte de maximale Z-range van de AFM overschreed. Monsterbeweging tijdens het experiment als gevolg van onjuiste fixatie kan leiden tot een wazige scan, zoals hier wordt getoond. Regio's die bedekt zijn met agros kunnen, zoals geïllustreerd in dit voorbeeld, ook niet correct worden gemeten. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in één uur worden voltooid mits correct uitgevoerd.

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De stijfheid van de extracellulaire matrix van grote invloed op meerdere gedragingen van hechtende cellen. Matrix stijfheid varieert ruimtelijk overal een weefsel, en ondergaat wijzigingen in de verschillende aandoeningen. Hier hebben we methoden ontwikkelen om de ruimtelijke variatie in stijfheid in normale en fibrotische muis longweefsel met behulp van atomic force microscopie microindentation karakteriseren.

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Kristalline cellulose is een belangrijk bestanddeel van de plantencelwand. De kwantificering ervan op cellulair niveau is echter technisch uitdagend. Hier beschrijven we het gebruik van gepolariseerd lichttechnologie en worteldoorsneden om informatie te verkrijgen over de samenstelling van de celwand met een spatie-temporelle resolutie.

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Hier presenteren we atomaire kracht microscopie (AFM), die wordt gebruikt als een nano-en micro-indentatie tool op cellen en weefsels. Het instrument maakt gelijktijdige verwerving van 3D-oppervlaktetopografie van het monster en de mechanische eigenschappen mogelijk, met inbegrip van de modulus van de celwand Young en de turgor-druk.

Gebruik van atoom kracht microscopie om mechanische eigenschappen en turgor druk van plantencellen en Plantenweefsels te meten

Dit protocol heeft als doel afm-metingen op honderden microbiële cellen te automatiseren. Eerst worden microben geïmmobiliseerd in PDMS-stempelmicrostructuren en vervolgens worden krachtspectroscopiemetingen automatisch uitgevoerd op honderden geïmmobiliseerde cellen.

Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Het atoomkrachtmicroscopie-inkepingsprotocol biedt de mogelijkheid om de rol van de fysische eigenschappen van de celwand van een bepaalde cel van een weefsel of orgaan te ontleden tijdens normale of beperkte groei (d.w.z. onder watertekort).

Atomic Force Microscopie om de fysieke eigenschappen van epidermale cellen van levende Arabidopsis-wortels te bestuderen

Studies van celwandbiomechanica zijn essentieel voor het begrijpen van plantengroei en morfogenese. Het volgende protocol wordt voorgesteld om dunne primaire celwanden in de interne weefsels van jonge plantenorganen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Karakteriseren van mechanische eigenschappen van primaire celwand in levende plantenorganen met behulp van atoomkrachtmicroscopie

Het kwantificeren van het contactoppervlak en de kracht die door een atoomkrachtmicroscoop (AFM) sondepunt op een monsteroppervlak wordt uitgeoefend, maakt mechanische eigenschapsbepaling op nanoschaal mogelijk. Best practices voor het implementeren van AFM cantilever-gebaseerde nano-indentatie in lucht of vloeistof op zachte en harde monsters om elastische modulus of andere nanomechanische eigenschappen te meten, worden besproken.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanische eigenschapsmetingen op nanoschaal in lucht en vloeistof

Dit protocol visualiseert hoe cryosecties van muizenlongweefsel moeten worden voorbereid, experimenten met atoomkrachtmicroscopiekaarten kunnen worden uitgevoerd en de gegevens moeten worden geanalyseerd om Young's modulus van het inheemse muizenlongbasaalmembraan te bepalen.

Extractie van de Young's Modulus van inheemse muizen pulmonale basaalmembranen uit door atoomkrachtmicroscopie afgeleide krachtkaarten

Leer mechanische eigenschappen van plantenweefsels in kaart brengen met atoomkrachtmicroscopie. Deze methode meet celwandstijfheid op weefsel-, cellulair en subcellulair niveau om groei en morfogenese te correleren.

AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

Meer video's verkennen