AFM-gebaseerde kaart brengen van de elastische eigenschappen van celwanden: op weefsel-, cellulair en Subcellulaire Resoluties

Het algemene doel van deze procedure is om mechanische eigenschappen van plantweefsels in kaart te brengen met behulp van een atoomkrachtmicroscoop. Eerst bereid glasplaten voor door een druppel laagsmeltende temperatuur aros op een geëtst gebied van de plaat te pipetten om een dunne aros-film te vormen. De tweede stap is om het monster te dissecteren en te monteren.

Verwijder bloemknoppen van de stengel, snijd de marris-stengel weg van de stengel en begraaf het gesneden me-steeg onmiddellijk in de dunne Agros-film op het glas. Schuif vervolgens, voeg genoeg gesmolten montage-agros toe om de spleet te vullen die ontstond toen de Maris-stengel in de Aros-film werd ingebed. De laatste stap is om de atoomkrachtmicroscoop in te stellen voor data-acquisitie.

Uiteindelijk genereren data-analyse en metingen van de schijnbare Young's modulus van celwanden een mechanisch profiel van de eigenschappen van celwanden tegelijkertijd op subcellulaire resoluties en over gehele weefselgebieden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het mechanische eigenschappen van de celwand tegelijkertijd op subcellulaire resolutie en over het gehele weefselgebied kan meten. Het Aros-medium voor het inbedden van monsters wordt bereid uit 0,7% laagsmeltende temperatuur, aros in 10% mannitol in water.

Gebruik een sterk metalen instrument zoals een boortip om een gebied van 0,5 bij 0,5 centimeter in het midden van een microscoopglas uit te etsen. Schuif dit om het oppervlak te ruwen om de hechting van de agros te vergemakkelijken en om ervoor te zorgen dat de agros-media aan de plaat blijft plakken of vast komt te zitten. Pipet een druppel van ongeveer 20 microliter inbedding agros-media op het geëtste gebied van de glasplaat.

Dit produceert een dunne film van agros. Bewaar de glasplaat in een vochtige doos en wacht tot de Agros-media verhard is. Samples van Arabidopsis worden gebruikt voor atoomkrachtmicroscopie om meristem-monsters voor te bereiden.

Verwijder de bloemknoppen een voor een van de stengel door ze naar beneden te trekken met ultrafijne pincetten. Het is belangrijk om alle bloemknoppen te verwijderen tot aan de knoppen die geen sequels vertonen, bekend als P een stadium primor. Gebruik een scheermesje of de punt van de pincetten om het meristem van de stengel te snijden.

De snede moet evenwijdig zijn aan het gebied van het meristemoppervlak dat gemeten zal worden met de atoomkrachtmicroscoop of een FM. De verkregen top moet tussen de 300 micrometer en 600 micrometer hoog zijn, zodat deze tijdens het experiment niet afbrokkelt. Duw onmiddellijk de top in de dunne film van aros-media die eerder is bereid. Kies een positie op de glasplaat of aros en duw voorzichtig zodat het meristem zowel direct in contact met de glasplaat staat als uit de aros steekt.

De agros breekt bij het aanbrengen van druk, dus de mari-stengel zal nu in een spleet staan. Het is cruciaal om de mari-stengel in de aros binnen enkele seconden na het snijden van de stengel te positioneren. Dit voorkomt dat de MA-stengel uitdroogt.

Meerdere MA-stelen kunnen op deze manier worden voorbereid voor batch-beeldvorming, op voorwaarde dat ze van dezelfde hoogte zijn en minder dan 500 micrometer van elkaar zijn gepositioneerd. Houd de voorbereide ma-stelen in de vochtige doos op de plaat terwijl u verdere monsters dissecteert. Gebruik filterpapier om voorzichtig eventueel overtollig water te verwijderen op de grens tussen het meristem en de bloemknoppen voordat u doorgaat naar de volgende stap.

Dit is om te voorkomen dat de gesmolten agros het monster overstroomt door capillaire krachten. Later, met een 20 microliter pipet, voeg genoeg gesmolten montage-agros toe om de eerder gemaakte spleet te vullen en om elk meristem te omringen, de aros moet het niveau van de litteken van de verwijderde bloemknop of primor gym bereiken. Om dit te bereiken, kan het nodig zijn om agros toe te voegen aan elk uiteinde van de spleet.

Wanneer de agros wordt toegevoegd, zal deze snel in de spleet overstromen. Gebruik de pipet om wat van de gesmolten montage-agros af te zuigen om ervoor te zorgen dat de me-stengel het hoogste punt op de plaat is. Dit fixeert de me-stengel zodat deze tijdens de beeldvorming niet kan bewegen voor wortels en hypo coddles.

Geen dissectie is noodzakelijk in de dunne film van agros. Gebruik micro-pincetten om een groef te maken op de voorbereide glasplaat, direct boven een ets in het glas of langs een glaslamella, positioneer de wortel of hypo coddle in deze groef, en zorg ervoor dat deze over de hele lengte in contact staat met het glas. Voeg gesmolten montage-agros toe rond het monster op dezelfde manier als gedemonstreerd voor het me-steekmonster.

Een JP PK nano tovenaar. Een FM wordt gebruikt in deze demonstratie. Om deze procedure te beginnen, monteer een cantilever met een rond gevormde indeling op de A FM. De straal zal de X, Y, Z resolutie en de indrukdiepte bepalen waarbij nauwkeurige metingen kunnen worden bereikt.

Gebruik een ronde indruk met een straal van 50 nanometer om metingen van meso tot nanoscale op het oppervlak van de epidermis te nemen. Gebruik een ronde indruk met een straal van 0,5 micrometer om metingen op mesoschaal te nemen, en gebruik een ronde indruk met een straal van 2,5 micrometer om metingen op microschaal te nemen over twee tot drie cellen. Positioneer de laser op het uiteinde van de cantilever. Richt de laser op het midden van de captor met behulp van de spiegel.

Plaats een schone glas onder de A FM-benadering met een doelwit voor een setpunt van één volt, selecteer voor spectroscopie. Voer een indruk uit door de maximale relatieve setpunt in te stellen op twee volt, de uitbreidingssnelheid op 40 micrometer per seconde en de Z-lengte op vijf micrometer. Selecteer vanuit het kalibratiemanager-menu het lineaire deel van de voorwaartse curve om de gevoeligheid aan te passen.

Gebruik de knop voor het selecteren van het bereik