Name: Nanopodia - Dun, Fragile Membraan Projecties met rollen in Celmigratie en Intercellulaire Interacties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T15:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Leer nanopodia visualiseren in gekweekte endotheel- en kankercellen met behulp van TM4SF1-immunofluorescentiekleuring. Deze methode behoudt fragiele membraanprojecties voor onderzoek naar celmigratie en intercellulaire interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen Dr Harold Dvorak voor nuttige discussies waaronder de suggestie om fixatie proberen in 37 ° C PFA. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie ​​P01 CA92644 en door een contract van de National Foundation for Cancer Research.

1. Cel Cultuur op Collageen Gecoat glas Disk <ol><li> Plaats het glas schijven (12 mm in diameter) in een glazen pot (4 oz) en autoclaaf om de schijven te steriliseren. </li><li> Breng 25 ml 70% ethanol in een 50 ml Falcon buis en plaats deze in een celkweek kap. Deze oplossing kan worden hergebruikt meerdere keren totdat het niveau van de oplossing daalt tot 20 ml. </li><li> Plaats een scherpe tang met een extra fijne punt in de 70% ethanol gedurende 5 minuten alvorens het te gebruiken om de glazen plaat af te handelen. </li><li> Verwijder voorzichtig de tang uit de tube en sluit het deksel, dan plaats voorzichtig het ethanol behandeld tang op de top van de buis aan de lucht drogen gedurende 2 minuten. Sta niet toe dat de punt van de tang om iets aan te raken in de kap. </li><li> Gebruik de steriele tang om een ​​steriele glazen schijf halen uit de glazen pot en plaats het op een goed van de 24-well celkweek plaat. Herhaal dit tot het gewenste aantal putten is gevuld met schijven. </li><li> Zet 500 ul van Bovine collageen oplossing (50 ng / ml) in elk putje dat een glazen plaat bevat en plaats deze in een 37 ° C, 5% CO 2 celkweek incubator gedurende ten minste 30 minuten. Er is geen kwaad in een langere incubatietijd. </li><li> Harvest HUVEC (humane navelstreng endotheelcellen) of PC3 (prostaat tumorcellen) die reeds in 150 mm celkweekplaat gekweekt werden door behandeling met trypsine en blokkeren de trypsine-activiteit met behulp van de volledige kweekmedium. Verzamel cellen in een 15 ml Falcon buis. </li><li> Tel het aantal cellen en zorg ervoor dat de leefbaarheid groter is dan 90%. </li><li> Pellet de cellen door centrifugeren bij 200 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant. </li><li> Gebruik het kweekmedium om de cellen te verdunnen tot 10 5 cellen / ml. Plaats cellen op ijs. </li><li> Zuig het collageen in de celkweek kap en plaats voorzichtig 500 ui celsuspensie aan elk putje waarin glazen schijven werden vooraf bekleed met collageen. 5 x 10 4 cellen / putje in de 24-well plaat zal conf geven 60%luency voor HUVEC en 30% confluentie voor PC3 cellen. Opmerking: voeg meer celsuspensie voor hogere celdichtheid. </li><li> Kweek van de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, of 24 uur tot nanopodia activiteiten en celpassage volgen. Meestal zal cellen hechten aan de glazen plaat in de eerste 30 minuten, start polariseren en migreren in het eerste uur en uitvoeren intercellulaire interacties en celdeling in het volgende voorbeeld. </li></ol> 2. Cel Fixatie <ol><li> Elk goed moet 500 pi 4% PFA (paraformaldehyde) om de cellen te repareren. Hetzij commercieel vervaardigd of vers 4% PFA worden gebruikt. Bereken de hoeveelheid PFA nodig op basis van het aantal putten bereid en plaats PFA in een 15 ml Falcon buis. LET OP: paraformaldehyde is een verdacht carcinogeen. </li><li> Zet de falcon buis in een piepschuim stand die reeds was op zijn plaats in een 37 ° C incubator. Laat de buis in de incubator gedurende 30 minuten naar de oorlogm up de PFA tot 37 ° C. </li><li> Plaats een verwarmingselement in de cultuur kap en zet hem aan. </li><li> Neem de 24-well celkweek plaat en de voorverwarmde PFA uit de incubator en plaats deze boven op de verwarming pad. </li><li> Gebruik een hand om het medium te zuigen uit een put, en direct na gebruik de andere hand om schuif 500 pi PFA in de put door de goed kant. Voor gemakkelijker aspiratie, kantel de cultuur plaat op ongeveer 45 °, leunend tegen het piepschuim stand zodat het stabiel op die hoek. Dit aspiratie en het toevoegen PFA oplossing van de put zonder de cellen in kweek te bevorderen. Dit is de meest cruciale stap om de oorspronkelijke celstructuur van celactiviteiten behouden. </li><li> Herhaal de procedure tot alle putjes met een glazen schijf PFA hebben ontvangen. Opmerking: alle stappen die moeten reeds bestaande oplossing uit de put te veranderen zal dezelfde aspiratie procedures toe te passen. </li><li> Plaats de plaat op 37 ° C gedurende 5 minuten. </li&gt; <li> Neem de plaat terug naar de cultuur kap en kantelen tegen piepschuim zoals beschreven in stap 2.5. Gebruik een hand om voorzichtig overdracht van de PFA van het goed in een verzameling buis; Gebruik anderzijds onmiddellijk daarna plaatsen ten minste 500 pi PBS kamertemperatuur in de put. Nadat alle putjes zijn gewassen, terug en nog een keer herhalen de PBS wassen in elke goed. Leeg de verzamelde PFA in een gevaarlijk afval container. </li><li> Bereid ICC blokkeerbuffer door toevoeging van 2% foetaal runderserum PBS. 0,04% natriumazide (verdunning van 20% voorraadoplossing) wordt toegevoegd als conserveermiddel. LET OP: sodium azide is een giftige stof. De buffer kan op 4 ° C worden opgeslagen gedurende langere tijd zonder bacteriële contaminatie. </li><li> Met de cultuur plaat nog gekanteld tegen een stand, nogmaals doorlopen elk putje opzuigen naar PBS te verwijderen en onmiddellijk daarna het toevoegen van 500 pi van ICC blokkerende buffer. Cellen zijn nu klaar voor immunofluorescentiekleuring. Indien nodig, degefixeerde cellen kunnen in een 4 ° C koelkast een week worden opgeslagen zonder significant verlies van TM4SF1 eiwit. </li></ol> 3. TM4SF1 immunofluorescentiekleuring van Nanopodia <ol><li> In elk putje Vervang de ICC 500 ul blokkeerbuffer een nieuwe blokkerende buffer die 0,01% Triton X-100 en laat het op kamertemperatuur gedurende 1 uur. Gebruik meer dan 0,03% Triton X-100 zoals TM4SF1 zal verwijderen uit celmembranen. PBS gewassen cellen van stap 2.10 kan direct worden verplaatst naar de blokkerende buffer bevattende Triton als de kleuring is klaar om meteen worden gestart. </li><li> Verdun primaire anti-TM4SF1 (of anti-CD9) antilichaam tot 0,5 ug / ml in blokkeerbuffer ICC. </li><li> In elk putje, verwijder de ICC/0.01% Triton buffer en te vervangen door 300 ul van de anti-TM4SF1-antilichaam oplossing. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur of een nacht laten staan ​​bij 4 ° C. </li><li> Was elk putje met niet minder dan 500 pi PBS. Herhaal 3x; elke keer geven op least 5 min incubatie tijd. </li><li> Bereid een secundair antilichaam en phalloidin oplossing ICC blokkerende buffer, met een 1000 maal verdunning van Alexa 488 gelabelde ezel anti-muis secundair antilichaam (2 ug / ml uiteindelijke concentratie) en 1000 x verdunning van phalloidin (50 ng / ml uiteindelijke concentratie). </li><li> Verwijder de PBS en voeg 300 ul van het secundaire antilichaam en phalloidin oplossing in elk putje en incubeer gedurende 2 uur en laat een nacht bij 4 ° C. </li><li> Herhaal de stappen PBS wassen met minstens een 5 min incubatie per wasbeurt. In de laatste wasbeurt, laat elk putje in PBS gedurende 1 uur. </li><li> Laat een druppel (~ 10 pi) van anti-fade afdekmiddel op een glasplaatje. </li><li> Buig de punt van een 19 G 1 ½ in naald 90 ° door zachtjes te drukken op een harde ondergrond. Gebruik een hand om gebogen naald vast te houden en voorzichtig omhoog een glazen schijf uit de put, en met de andere hand om de schijf te begrijpen met behulp van de scherpe tang. </li><li> Draai het glas schijf &amp;# 160; naar beneden laten van de cel kant contact op met de montage media op het glaasje. Plaats voorzichtig de glazen plaat en laat het een nacht drogen op een donkere plaats bij kamertemperatuur. </li><li> Ga verder met het imago van de immunofluorescentie gekleurd nanopodia, of de dia&#39;s in een dia doos bewaren bij -20 ° C. De slides zichtbaar voor een paar maanden in de -20 ° C blijven </li></ol>

<ol><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+actin%3A+matching+assembly+factors+with+cellular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).</li>
<li>Shih, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L6+protein+TM4SF1+is+critical+for+endothelial+cell+function+and+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis.</a> Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).</li>
<li>Zukauskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TM4SF1%3A+a+tetraspanin-like+protein+necessary+for+nanopodia+formation+and+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration.</a> Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).</li>
<li>Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+effects+of+L6%2C+an+IgG2a+antibody+that+reacts+with+most+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).</li>
<li>Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+and+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imag%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging and stem cell research.</a> Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).</li>
<li>Hemler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+functions+and+associated+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin functions and associated microdomains.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).</li>
<li>Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+thymosin+beta-10+by+early+passage+and+senescent+vascular+endothelium+is+modulated+by+VPF%2FVEGF%3A+evidence+for+senescent+endothelial+cells+in+vivo+at+sites+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis.</a> FASEB. 15, 458-466 (2001).</li>
<li>Itoh, T. J., Hotani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+the+regulation+by+microtubule-associated+proteins+%28MAPs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Uchu+Seibutsu+Kagaku%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs).</a> Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).</li>
<li>Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-jump+studies+of+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability.</a> J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).</li>
<li>Pollice, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+paraformaldehyde+and+methanol+fixation+for+simultaneous+flow+cytometric+analysis+of+DNA%2C+cell+surface+proteins%2C+and+intracellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins.</a> Cytometry. 13, 432-444 (1992).</li>
<li>Macarulla, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+solubilization+by+the+non-ionic+detergent+triton+X-100.+A+comparative+study+including+model+and+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espanola+de+Fisiologia%22%5BJournal%5D)">Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes.</a> Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).</li>
<li>Koley, D., Bard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triton+X-100+concentration+effects+on+membrane+permeability+of+a+single+HeLa+cell+by+scanning+electrochemical+microscopy+%28SECM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).</li>
<li>Chang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD13+%28aminopeptidase+N%29+can+associate+with+tumor-associated+antigen+L6+and+enhance+the+motility+of+human+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Nanopodia dun celmembraan kanalen die stevig aan matrix door TMED en kan meer dan 100 urn uitstrekken vanaf een mobiel gepolariseerde cel milieu voelen en intercellulaire interacties mediëren 2,3. Nanopodia houden zo stevig dat residuen achterblijven als de cel verwijdert zich matrix (figuren 1 en 2). Nanopodia dus kunnen we bestuderen hoe cellen voelen hun omgeving en bepalen het pad van de cel bewegen, en hoe genexpressie of behandeling met geneesmiddelen veranderingen bewe...

Tijdens polarisatie voor beweging, dierlijke cellen uit te breiden een verscheidenheid aan dynamische, membraan uitsteeksels uit hun oppervlakken, waaronder filopodia, lamellipodia, retractie vezels, en ruches 1. Recent toegevoegd aan deze lijst waren nanopodia, een nieuw erkende type dunne (100-300 micrometer in doorsnede), langwerpig (tot 50-100 micrometer lang) membraan projectie die membraan kanalen voor de uitbreiding van de F-actine structuren zoals filopodia bieden en terugtrekken vezels, en die vlek positief met TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) in gekweekte endotheliale cellen en tumorcellen 2,3. TM4SF1 is een eiwit met tetraspanine-achtige topologie die oorspronkelijk bekend was als een tumorcel antigen 4 vóór de ontdekking dat het molecuul een endotheelcel biomarker die een essentiële rol in endotheliale celproliferatie en migratie 2,3 speelt. Immunofluorescentiekleuring bleek dat TM4SF1 is gelokaliseerd aan perinucLear blaasjes en het plasmamembraan en wordt verrijkt met TM 4SF1 e nriched micro d omains (TMED). TMED anker nanopodia naar matrix en aanwezig in een regelmatige afstand van elkaar gestreepte patroon van 1-3 TMED / um lengte van nanopodia. Nanopodia typisch verlengen van toonaangevende voorzijde een cel en naloopas tijdens cel polarisatie voor beweging. Vanwege de stevige hechtende aard van TMED, nanopodia zijn niet in staat om terug te trekken in de cel als het beweegt weg; verlaten nanopodia residuen dus sporen uit het pad van de cellulaire beweging. Nanopodia bieden membraan kanalen voor F-actine en uitschuiven, en zijn sites van intercellulaire interacties en communicatie 2,3. Deze kenmerken betekenen dat nanopodia een unieke gelegenheid om de onderliggende mechanismen van F-actine assemblage tijdens cellulaire polarisatie, cellulaire sensing van het milieu, de bepaling van het pad en de richting van de cel beweging, en intercellulaire interacties te bestuderen bieden eennd communicatie. Wegens het zeer hydrofobe karakter van TMED en de dunne en fragiele membraneuze aard van nanopodia, speciale zorg moet worden genomen om TMED en nanopodia behouden. De vernietiging van nanopodia en verwijdering van TMED door gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken is een mogelijke reden waarom slechts drieënzestig publicaties zijn verschenen op TM4SF1 sinds de eerste ontdekking in 1986 1 en voor het volledige gebrek aan kennis van TM4SF1 verrijking in 100-300 urn microdomeinen op het celoppervlak tot het verslag van TM4SF1 in endotheelcellen in 2009 2. Conventionele methoden immunokleuring algemeen organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton om cellen te repareren en te gebruiken 0,1% of hoger Triton X-100 concentratie cellen permeabilize 5. Studies beschreven uitgevoerd drie grote veranderingen in de conventionele werkwijze te openbaren TMED en nanopodia: (i) 37 ° C 4% PFA en zet cellen in een 3776, C incubator, (ii) zachtjes kamertemperatuur PBS wassen, en (iii) minder dan 0,03% Triton X-100 slechts kort cellen permeabilize vóór toevoeging van primair antilichaam, zoals Triton X-100 hoger dan 0,03% zullen halen TM4SF1. Alle tetraspanins vormen microdomeinen op de celmembraan 6 en sommige colocalize met TMED in endotheliale cellen en tumorcellen 2,3. Zoals tetraspanins zoals CD9, CD81 en CD151 alomtegenwoordig worden uitgedrukt, kan de kleuringsprotocol hier beschreven worden uitgebreid tot veel verschillende soorten cellen die TM4SF1 missen voor de studies van nanopodia functie.

<table><tbody><tr><td>Glass disks</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>Glass jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-310</td><td>Certified Clean Clear Glass Straight-Sided Jars, 4 oz</td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td>Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides</td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>50 ml high-clarity polypropylene conical centrifuge tube, 16,000 rcf rating. Sterile.</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube with Styrofoam rack</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Corning 15 ml PP Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>Sharp forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Dissecting Extra Fine Pointed Splinter Forceps</td></tr><tr><td>24-well Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353047</td><td>24-well Cell Culture Plate</td></tr><tr><td>150 mm Cell culture plate</td><td>BD Bioscience</td><td>353025</td><td>150 mm cell culture plate</td></tr><tr><td>19 G 1 &frac12; Syringe needle</td><td>BD Bioscience</td><td>309635</td><td>19 G 1 &frac12;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2701</td><td>Decon's Pure Ethanol 200 Proof</td></tr><tr><td>Collagen solution</td><td>BD Bioscience</td><td>354249</td><td>Collagen I, High Concentration, rat tail, 100 mg</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td>0.25% Trypsin-EDTA 1x</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine, without sodium pyruvate</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Affymetrix</td><td>75889 5 LT</td><td>PBS, 10x Solution, pH 7.4</td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyde)</td><td>Affymetrix</td><td>19943 1 LT</td><td>4% in PBS</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>EGM2-MV</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit, EBM-2 Basal Medium 500 ml and EGM-2 SingleQuot Kit Supplement &amp; Growth Factors</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>Solubilized in water. 4% stock solution and working concentration is 0.4%.</td></tr><tr><td>Mouse anti-human TM4SF1 antibody&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>MAB3127</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD9 antibody&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>555370</td><td>Epitope is located in extracellular domain</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse 2nd antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A-21202</td><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Chemicon</td><td>90324</td><td>Rhodamine-conjugated Phalloidin</td></tr><tr><td>Anti-fade mounting media&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P-36931</td><td>ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI</td></tr><tr><td>70% Ethanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>17.5 ml van ethanol (200 proof) 7.5 ml van dubbel-gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>10x PBS (maak 200 ml)</td><td></td><td></td><td>20 ml van 10x PBS 180 ml van dubbel-gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>20% Triton X-100 (maak 20 ml)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>4 ml Triton X-100 16 ml dubbel-gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>4% NaN3 (maak 25 ml)</td><td></td><td></td><td>1 g van NaN3 25 ml van dubbel-gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>50 ng/ml Bovine collagen solution in PBS (maak 5 ml)</td><td></td><td></td><td>Stockoplossing van 50 &mu;g/ml (50 ml) 830 &mu;l van Collagen I (3 mg) 50 ml PBS</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer (50 ml)</td><td></td><td></td><td>49 ml PBS 2% FBS (voeg 1 ml toe) 0.04% NaN3 (voeg 100 &mu;l van 4% NaN3 toe)</td></tr><tr><td>ICC Blocking Buffer/0.01% Triton X-100 (maak 50 ml)</td><td></td><td></td><td>50 ml van ICC Blocking Buffer 25 &mu;l van 20% Triton X-100</td></tr><tr><td>HUVEC&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/primary-and-stem-cells/human-cells-and-media/endothelial-cells-and-media/huvec-human-umbilical-vein-endothelial-cells.aspx">www.lonza.com</a></td></tr><tr><td>PC3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1435</td><td><a href="http://www.atcc.org/products/all/CRL-1435.aspx#85786B46AA23451B94BC5D45200673F7">www.atcc.org</a></td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &deg;C, 5% CO2 Cell culture incubator&nbsp;</td><td>CellStar</td><td>QWJ300DABA</td><td>Cellstar CO2 Water Jacketed Incubator</td></tr><tr><td>Heating pad&nbsp;</td><td>K&amp;H Manufacturing</td><td>1020</td><td>K&amp;H Lectro Kennel Heated Pad with Free Fleece Cover (<a href="http://www.amazon.com/Lectro-Kennel-Heat-Pad-22-5x28-5-In/dp/B000PSRN20/ref=pd_bxgy_petsupplies_img_y">www.amazon.com</a>)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>T6000B</td><td>Sorvall T6000 (B) Benchtop Centrifuge</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr></tbody></table>

nanopodia - dun, fragile membraan projecties met rollen in celmigratie en intercellulaire interacties

Nanopodia - Thin, Fragile Membrane Projections with Roles in Cell Movement and Intercellular Interactions

Hechtende cellen in kweek te houden een gepolariseerde staat om beweging en intercellulaire interacties ondersteunen. Nanopodia zijn dun, langwerpig, grotendeels F-actine-negatieve membraan projecties in endotheliale en kanker cellen die kunnen worden gevisualiseerd door middel van TM4SF1 (Transmembrane-4-L-zes-familie-1) immunofluorescentiekleuring. TM4SF1 clusters 100-300 micrometer diameter TMED (TM 4SF1 e nriched micro d omains) die 3 tot maar liefst 14 individuele TM4SF1 moleculen. TMED intermitterend gerangschikt langs nanopodia op een regelmatige afstand van 1 tot 3 TMED per μ m en stevig verankeren nanopodia matrix. Hierdoor nanopodia meer dan 100 μ m loopt van de toonaangevende voor-of naloopas van gepolariseerd endotheliale of tumorcellen en veroorzaakt membraan resten achterblijven op matr worden achtergelatenix wanneer de cel zich verwijdert. TMED en nanopodia over het hoofd gezien vanwege hun extreme kwetsbaarheid en gevoeligheid voor temperatuur. Routine wassen en fixatie verstoren de structuur. Nanopodia bewaard door directe fixatie in paraformaldehyde (PFA) bij 37 ° C, gevolgd door korte blootstelling aan 0,01% Triton X-100 voor kleuring. Nanopodia nieuwe perspectieven te openen in de celbiologie: ze beloven om ons begrip van hoe cellen voelen hun omgeving vorm te geven, op te sporen en te identificeren andere cellen op een afstand, initiëren intercellulaire interacties op nauw contact, en van de signalering mechanismen die betrokken zijn bij beweging, proliferatie en cel -cel communicatie. De werkwijzen die zijn ontwikkeld voor het bestuderen TM4SF1 afgeleide nanopodia nuttig voor studies van nanopodia dat andere celtypes door tussenkomst van klassieke tetraspanins, met name het alom tot expressie CD9, CD81, en CD151 vormen.

Voor Stap 1: Indien cellen (zoals HUVEC en PC3 in deze studie) kunnen normaal groeien, zullen de cellen hechten aan de met collageen beklede plaat binnen 30 minuten nadat ze zijn gezaaid, polariseren en word mobiele spoedig daarna en nanopodia vóór hun pad verlengen verkeer. Figuren 1A en 1B respectievelijk toont een gepolariseerde en prolifererende HUVEC. Figuur 2A toont gepolariseerde PC3 cellen in een mobiele toestand. <p class="jove_ste...

Nanopodia zijn dun maar kwetsbare membraan kanalen die reiken tot 100 urn van toonaangevende voor-of naloopas van een cel en voelen de cellulaire omgeving. Direct fixatie bij 37 ° C, zacht wassen, en het vermijden van organische oplosmiddelen zoals ethanol, methanol of aceton en hogere Triton X-100 concentraties nodig zijn om de cellulaire structuren te nemen.

Nanopodia - Dun, Fragile Membraan Projecties met rollen in Celmigratie en Intercellulaire Interacties

Adherent cells in culture maintain a polarized state to support movement and intercellular interactions. Nanopodia are thin, elongated, largely ...

Het algemene doel van deze procedure is om nano podia te visualiseren door middel van immunofluorescente kleuring in gekweekte cellen. In vitro. Dit wordt bereikt door eerst de cellen van belang op collageen gecoate glazen schijven te kweken.In de tweede stap worden de cellen op de schijf gefixeerd met warm PFA, vervolgens worden de cellen gewassen en vervolgens gedurende een uur bij kamertemperatuur in blokkeringsbuffer geïncubeerd. In de laatste stap worden de cellen gekleurd met antilichaam tegen TM vier, SF één en gemonteerd op een glazen plaat. Uiteindelijk kan de aanwezigheid van uitsteeksels van nano podia in mobiele, proliferende of interacterende cellen worden gevisualiseerd door immunofluorescentiemicroscopie.De implicaties van deze techniek reiken tot de therapie en diagnose van menselijke kankers omdat endotcel- en tumorcelproliferatie, beweging en intercellulaire interacties belangrijke processen zijn die betrokken zijn bij de aanmaak van bloedvaten en de groei van tumorcellen. Om de procedure te demonstreren, zal een postdoc uit een laboratorium beginnen met het autoclaven van 12 millimeter glazen schijven in een glaspot van vier ounce terwijl de schijven worden gesteriliseerd. Plaats een 50 milliliter conische buis met 25 milliliter 70% ethanol in een celkweekkast.Plaats een scherpe pincet met een extra fijne punt vijf minuten in de ethanol en verwijder vervolgens voorzichtig het pincet en sluit de buis af, plaats het pincet op de buis om twee minuten te laten drogen. Wanneer het pincet droog is, plaatst u één steriele glazen schijf per putje in één van elk van de gewenste putjes van een 24-well celkweekplaat. Bedek vervolgens elke schijf met 500 microliter bovijncollageenoplossing en plaats de plaat in een celkweekincubator van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende ten minste 30 minuten.Terwijl de schijven worden geïncubeerd, druppel de cellen van belang en stop de reactie met compleet kweekmedium. Wanneer de cellen loslaten, verzamel de zwevende cellen in een Falconbuis van 15 milliliter en tel ze vervolgens nadat is bevestigd dat hun levensvatbaarheid groter is dan 90%. Pel de cellen gedurende 10 minuten bij 200 G en vier graden Celsius. Verwijder het supernatant en verdun vervolgens de cellen tot één maal 10 tot de vijfde cellen per milliliter in kweekmedium en plaats de cellen op ijs.Aspergeer nu de collageenoplossing uit elk putje in de celkweekkast en doseer vervolgens voorzichtig 500 microliter van de cellen op elke met collageen gecoate schijfcultuur. De cellen gedurende de juiste hoeveelheid tijd om de nano podia-activiteiten en celpassage bij te houden. Typisch zullen cellen zich in de eerste 30 minuten aan de glazen schijf hechten, beginnen te polariseren en migreren in de eerste uur, en intercellulaire interacties en celdeling uitvoeren in de volgende uren om de cellen te fixeren, verwarm eerst PFA voldoende voor alle schijven in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Plaats vervolgens een verwarmingskussen in de kweekkast. Zet het aan en plaats vervolgens het voorverwarmde PFA bovenop het verwarmingskussen. Het toevoegen van PFA aan de schijven is de meest cruciale stap voor het behouden van de oorspronkelijke cellulaire structuur van de celactiviteiten om het verwijderen van het kweekmedium en het toevoegen van PFA te vergemakkelijken zonder de cellen in cultuur te verstoren, kant het bord naar ongeveer 45 graden en leun het tegen een styrofoam standaard zodat het stabiel staat op de hoek met één hand.Aspergeer vervolgens het medium uit elk putje en gebruik vervolgens de andere hand om onmiddellijk 500 microliter PFA in elk putje te doseren door de rand van het putje heen en incubeer de schijven nog vijf minuten. Verwijder vervolgens de PFA zoals zojuist is gedemonstreerd voor het celkweekmedium, doseer de gebruikte PFA in een opvangbuis met één hand en vervang de PFA onmiddellijk met 500 microliter PBS bij kamertemperatuur met de andere nadat de putjes twee keer zijn gewassen met PBS, verwijder de laatste PBS-was zoals zojuist is gedemonstreerd en voeg 500 microliter immunochemische blokkeringsbuffer toe aan elke schijf. Om de nano podia door middel van fluorescentiemicroscopie te visualiseren, vervang eerst de immuno cytochemische blokkeringsbuffer in elk putje met 0,01%tritton X 100 blokkeringsbuffer bij kamertemperatuur gedurende één uur.Vervolgens vervangt u de tritton-blokkeringsbuffer met 300 microliter vers verdunde anti TM vier SF één antilichaamoplossing gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens elke schijf drie keer met PBS zoals zojuist is gedemonstreerd, laat de PBS gedurende vijf minuten op de schijven tijdens elke wasbeurt na de laatste wasbeurt. Incubeer elk putje met 300 microliter vers verdunde secundair antilichaam en Phin-oplossing en incubeer de schijven nog twee uur bij kamertemperatuur.Was de schijven nu weer drie keer en laat de laatste PBS-was gedurende een uur in de putjes. Doe vervolgens een enkele druppel van 10 microliter Antifa montagemedium op één glazen plaat voor elke schijf. Buig vervolgens voorzichtig de punt van een 19 gauge, anderhalve inch naald 90 graden op een hard oppervlak.Houd vervolgens de naald in één hand vast en til voorzichtig de glazen schijf één voor één op met een scherp pincet om de schijf met de andere hand vast te grijpen. Plaats elke glazen schijf met de voorkant naar beneden op het montagemedium op de glazen platen en plaats de platen vervolgens zorgvuldig op een donkere plaats bij kamertemperatuur om een nacht lang te drogen. De gekleurde nano podia kunnen vervolgens worden geïmagerd of worden opgeslagen in een diabox bij min 20 graden Celsius.Normaal gesproken zullen groeiende cellen zich binnen 30 minuten na het zetten aan de met collageen gecoate schijven hechten, polariseren en snel mobiele worden nadat ze nano podia vooruit hebben uitgestoken in de richting van hun bewegingspad. Zoals in deze afbeeldingen wordt gedemonstreerd, zullen geïsoleerde individuele H-U-V-E-C over het algemeen een duidelijk gepolariseerde morfologie vertonen met f-actine projecties aan de celrand ingebed

nanopodia-thin-fragile-membrane-projections-with-roles-cell-movement

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.

Karakterisering van de celmembraan extensies en het bestuderen van hun rollen in kanker cel adhesie Dynamics

Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.

Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Hier beschrijven we de procedures voor het bestuderen van veranderingen in de fagocytose-geïnduceerde genexpressie met een luciferase-based reportergen benadering met behulp van de Dual-GloTM Luciferase Assay System van Promega.

Studeren Membraan Biogenese met een Luciferase-Based Reporter Gene test

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.

Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products

Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

We ontwikkelden een nieuwe techniek in elektronenmicroscopie, "flash-and-vries," dat de visualisatie van membraan dynamiek met ms temporele resolutie mogelijk maakt. Deze techniek combineert de optogenetic stimulatie van neuronen met hogedruk vriezen. Hier tonen we de procedures en een beschrijving van de protocollen in detail.

Flash-en-Freeze: een nieuwe techniek op Capture Membrane Dynamics met Electron Microscopy

Leer nanopodia visualiseren in gekweekte endotheel- en kankercellen met behulp van TM4SF1-immunofluorescentiekleuring. Deze methode behoudt fragiele membraanprojecties voor onderzoek naar celmigratie en intercellulaire interacties.

Nanopodia - Dun, Fragile Membraan Projecties met rollen in Celmigratie en Intercellulaire Interacties

Meer video's verkennen