Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om intracellulaire of extracellulaire ascorbaatniveaus in gekweekte of geïsoleerde cellen te bepalen. Dit wordt bereikt door celextracten of hele cellen te incuberen met een score oxidase om selectief een score BA in volgende stappen te depelen. Bij de eerste methode worden celextracten geïncubeerd met cyanide om ferrocyanide te genereren op een ascorbaatafhankelijke manier, wat een directe weergave geeft van de hoeveelheid ascorbaat in de extracten.

Vervolgens wordt de hoeveelheid ferrocyanide gevormd in de celextracten bepaald door het ferrocyanide kwantitatief te oxideren met toegevoegd ijzer om Ferris-ijzer te vormen om een chromogeen ijzer twee ferne S complex te genereren dat spectrofotometrisch kan worden gekwantificeerd. In de tweede methode worden alle cellen direct geïncubeerd met de ijzer twee chelator ferne S en ferric-citraat. De resultaten tonen verschillen in intracellulaire of extracellulaire ascorbaatniveaus op basis van de kwantitatieve en specifieke reductie van extracellulaire ijzercomplexen die kunnen worden gedetecteerd.

Spectrometrisch. Het belangrijkste voordeel van de huidige techniek ten opzichte van methoden die al beschikbaar zijn, zoals HBLC-gebaseerde detectie, is dat deze zeer specifieke microplaatbepaling zeer snel kan worden uitgevoerd en alle monsters en standaarden parallel kunnen worden verwerkt in plaats van op seriële wijze Voorafgaand aan het starten van deze procedure. Cultuur K 5 62 suspensiecellen en creëer in een score BA bevattend cellulair extract.

Maak vervolgens een voorraadoplossing van 10 millimolar ascorbinezuur in ijskou PBS. Bereid vervolgens zorgvuldig een reeks ascorbaatstandaarden voor tussen nul en 20 micromolar. Verwijder voorzichtig vier 100 microliter aliquots uit elke standaard en voeg deze toe aan een horizontale reeks putjes.

In een 96-well platte bodemplaat met 25 microliters per putje van PBS of een 45,5 eenheden per milliliter. Stockoplossing van L ascorbaatoxidase of AO in PBS bedek de 96-well plaat met folie en orbitaal. Meng het bij 550 RPM op kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Wanneer u klaar bent, voegt u 50 microliters van 3,5 millimolar kalium Ferris cyanide in PBS toe aan alle putjes om een ​​eindferris cyanideconcentratie van één millimolar te verkrijgen na orbitaal menging van de 96-well plaat, met behulp van dezelfde omstandigheden als voorheen. Voeg onmiddellijk 25 microliters van een vers bereide oplossing toe die 50% azijnzuur en 30% trichloroazijnzuur bevat. Voeg vervolgens 100 microliters van een vers bereide farao cyanidebepalingoplossing toe aan elke orbitale put.

Meng de plaat in het donker bij 550 RPM gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Lees vervolgens de absorptiewaarden van de putjes bij 593 nanometer. Om het assay te beginnen.

Oxideren eerst extracellulair ascorbaat in geselecteerde putjes door 50 microliters van 120 eenheden per milliliter AO of HBSD toe te voegen aan gepaarde putjes in drievoudig om een ​​eind AO-concentratie van 10 eenheden per milliliter te verkrijgen. Volgend label, de gepaarde putjes als minus AO en plus ao. Na het mengen van de platen met zacht orbitaal mengen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius, voegt u 50 microliters van 2,4 millimolar Ferne S toe aan alle putjes om een ​​eind ferne s-concentratie van 200 micromolar te verkrijgen, meng de platen zoals hierboven gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius.

Voeg vervolgens 50 microliters van vers bereid 120 micromolar ferric-citraat toe aan alle putjes om een ​​eind ijzer en citraatconcentratie van respectievelijk 10 micromolar ijzer en 50 micromolar citraat te verkrijgen. Meng goed aan het einde van de ascorbaat FLX-assay. Aaspibeer snel het bovenliggende medium uit elk putje en voeg toe aan geschikt gelabelde putjes in een 24-well plaat.

Voeg vervolgens drie microliter aliquots van het supernatant toe aan een 96-well plaat om extracellulair ascorbaat te bepalen. Lees de absorptiewaarden van de putjes bij 593 nanometer in een microplaatspectrofotometer. Bereken ten slotte de hoeveelheid extracellulair ascorbaat als m ascorbaat per milligram eiwit.

Hier is een typische standaardcurve voor een reeks ascorbaatstandaarden, nul tot 20 micromolar of nul tot twee NMO ascorbaat per putje. Van de 96-well plaat, hoewel hier niet getoond, wordt de lineariteit gehandhaafd tot acht NMO ascorbaat per putje, wat overeenkomt met een monster ascorbaatconcentratie van ongeveer 80 micromolar. Het assay kan worden gebruikt om ascorbaatniveaus onder 0,25 ole ascorbaat per putje met succes te detecteren.

K 5 62 cellen accumuleren snel intracellulair ascorbaat van extracellulair dehydro L ascorbinezuur, maar niet ascorbaat. In dit representatieve experiment werden met PBS gewassen K 5 62 cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius geïncubeerd in PBS met 500 micromolar van ofwel ascorbaat, dehydro L ascorbinezuur, dehydro L ascorbinezuur plus 50 micromolar cyto B, ascorbaat plus vijf millimolar cyanide of ascorbaat plus 50 eenheden per milliliter AO. Intracellulair ascorbaat werd bepaald zoals eerder beschreven.

Dehydro L ascorbinezuuropname door K 5 62 cellen vindt plaats door facilitatieve glucosetransporter glute-gemedieerde transport om de betrokkenheid van glutes bij dehydro L ascorbinezuuropname te beoordelen. In dit representatieve experiment werden K 5 62 cellen geïncubeerd met toenemende concentraties van cyto B of dihydro cyto B voorafgaand aan incubatie met dehydro L ascorbinezuur. Het is belangrijk op te merken dat, terwijl zowel cyto callin B als dihydro cyto B motiele processen remmen bij micromolar concentraties, alleen cyto callin B, dat verschilt van dihydro cyto B door de aanwezigheid van een enkele dubbele binding, glute-afhankelijke transport bij lage micromolar concentraties remt.

Daarom, aangezien dehydro L ascorbinezuuropname werd geïnhibeerd door cyto B met een IC 50 van minder dan 2,5 micromolar, maar niet werd