Name: Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T22:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Leer een snelle microplaat-assay om intra- en extracellulair ascorbaat in gekweekte cellen te meten. Deze kosteneffectieve methode biedt inzicht in de rol van ascorbaat in cellulaire stofwisseling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor Dr Stephen Robinson en mevrouw Hania Czerwinska (Monash University) voor de genereuze aanbod van astrocyten.

1. Bepaal Intracellular Ascorbate in gekweekte cellen <ol><li> Celcultuur en oogsten <ol><li> Grow schorsing (bv. menselijke erythroleukemie, K562) of aanhangende cellen (bijv. primaire astrocyten) met behulp van standaard cultuur procedures 19-21,32,38. Opmerking: om ervoor te zorgen cellen bevatten ascorbaat, laden gekweekte cellen met ascorbaat hetzij als ascorbaat of DHA 33,39. </li></ol></li><li> Maak een-ascorbaat met cellulaire extract <ol><li> Incubeer een passend aantal fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-gewassen schorsing of hechtende cellen met 450 pi van ijskoude Cell Permeabilisatie Buffer [CPB; 0,1% (gew / vol) saponine in PBS; 4 ° C]. Opmerking: Bepaal het aantal cellen nodig is om een ​​absorptiewaarde binnen het lineaire bereik van de assay te verkrijgen (zie hieronder) empirisch door de eindgebruiker. Opmerking: weefsel extracten kunnen ook worden gebruikt (zie Overleg voor meer details). </li><li> Agitate cellen op ijs gedurende 10 minuten grondig celafbraak waarborgen. </li><li> Een geklaarde-ascorbaat bevattende intracellulaire extract verwijderen celresten door centrifugeren van het ruwe lysaat bij 16.000 x g gedurende 5 min in een gekoelde microcentrifuge (4 ° C). </li><li> Verwijder voorzichtig 4 x 100 pi aliquots van elk monster en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die ofwel 25 ul / putje PBS (&quot;AO&quot;) alleen of 25 ul / putje van 45,5 U bevat / ml voorraad oplossing van L-ascorbaat-oxidase (AO) in PBS (&quot;+ AO&quot;). Opmerking: dit moet parallel met de opstelling van de normen (zie hieronder). </li></ol></li><li> Ascorbaat standaard-curve constructie (moet opnieuw worden gebouwd voor elke test) <ol><li> Bereid een voorraadoplossing van 10 mM ascorbinezuur in ijskoude PBS. Let op: Controleer de concentratie van ascorbaat spectrofotometrisch met behulp van een kwarts cuvet met een 1cm weglengte bij 265 nm (extinctiecoëfficiënt = 14,5 mM -1 cm -1) 40. </li><li> Stelt een reeks standaarden ascorbaat tussen 0 en 20 uM voorzichtig. </li><li> Parallel met stap 1.2.4, verwijder 4 x 100 ul aliquots van elke standaard en aan een horizontale reeks van putjes in een 96-well plaat met vlakke bodem die 25 ul / putje bevat PBS (&quot;AO&quot;) of 45.5 U / ml stockoplossing van AO in PBS (&quot;+ AO&quot;). Opmerking: 100 pl van de bovengenoemde ascorbaat normen 0-2 nmol ascorbaat bevatten. Let op, het doel van de AO is om te controleren voor de bijdrage van niet-ascorbaat reductanten tot vermindering ferricyanide. </li></ol></li><li> Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 1: selectief verwijderen ascorbaat en kwantitatief oxideren ascorbaat met ferricyanide <ol><li> Orbitaal meng de 96-well plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker door het bedekken van de plaat in folie. Opmerking: Tzijn stap moeten alle ascorbaat oxideren in de &quot;+ AO&quot; putten DHA. De &quot;AO&quot; bronnen moeten worden beïnvloed. </li><li> Voeg 50 ul van 3,5 mM kaliumferricyanide in PBS (hierna &quot;ferricyanide&quot;) aan alle putjes. De uiteindelijke [ferricyanide] = 1 mM. Opmerking: Gebruik een multipipettor. </li><li> Orbitaal meng de plaat bij 550 tpm bij kamertemperatuur gedurende nogmaals 5 minuten in het donker. Opmerking: Deze stap moet leiden tot een vermindering van ferricyanide tot ferrocyanide door ascorbaat in een stoichiometrische verhouding van 2 moleculen ferricyanide verlaagd per 1 molecuul ascorbaat geoxideerd. </li><li> Voeg onmiddellijk 25 ul van een vers geconstrueerde oplossing met 50% (v / v) azijnzuur en 30% (w / v) trichloorazijnzuur (TCA). Opmerking: Gebruik een multipipettor. </li></ol></li><li> Bepaal intracellulaire ascorbaat - Stap 2: het kwantificeren hoeveelheid ferrocyanide gevormd 37 <ol><li> Voeg 100 ul van ferrocyanide vastberadenheid oplossing 37 tot each goed. Opmerking: Een werkende oplossing moet onmiddellijk voor het gebruik te worden gemaakt: 2 ml 3 M Na-acetaat (pH 6,0); 0,5 ml ijsazijn (~ 17,4 M azijnzuur); 2 ml 0,2 M citroenzuur; 2 ml 3,3 mM FeCl3 in 0,1 M azijnzuur; 1 ml 30 mM ferene-S. Het eindvolume van de werkoplossing moet 7,5 ml. </li><li> Orbitaal meng de plaat in het donker bij 550 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Lees de absorptiewaarden van de putjes bij 593 nm (het absorptiemaximum van de Fe (II) (ferene-S) 3 complex). </li><li> Bereken de hoeveelheid intracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per miljoen cellen door eerst het aftrekken van de A 593 nm waarden voor de &#39;+ AO&#39; putten uit de overeenkomstige &#39;- AO&#39; wells voor elk monster en het interpoleren van de ascorbaat standaardkromme (zie stap 1.3 ). Bij de bouw van de standaard curve, plotten dit &quot;verschil waarde&quot; voor elk standaard tegen de hoogte van ascorbaten per putje. </li></ol></li></ol> 2. Bepaling van ascorbaat-efflux van gekweekte cellen <ol><li> Celcultuur en oogsten <ol><li> Grow schorsing of aanhangende cellen zoals hierboven (zie stap 1.1). Opmerking: het uitvoeren van de onderstaande test in een 24-well plat formaat met schorsing en hechtende cellen voor de beste resultaten. </li><li> Resuspendeer cellen suspensie of overlay hechtende cellen met 400 ul voorverwarmde HEPES-gebufferde zoutoplossing, met of zonder calcium en magnesium bevattende 5 mM D-glucose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) in putjes van een 24-wells plaat. Voeg dezelfde hoeveelheid HBS / D gespecificeerde celvrije putjes op elke plaat met 24 putjes worden onderzocht. Opmerking: deze zal dienen als celvrij controles voor de basislijn reactie (zie hieronder). </li></ol></li></ol> 3. Bepaal de hoeveelheid Ascorbate Uitgebracht <ol><li> De volgende voorraad oplossingen moeten van tevoren worden bereid: 120U / ml AO in HBS / D (vers bereid); 2,4 mm Ferene-S in HBS / D; 120 uM FeCl3 en 600 uM Na-citraat in HBS / D (onmiddellijk bereiden van meer geconcentreerde voorraad oplossingen). </li><li> Om de ferrireduction reactie (eindvolume per putje moet 600 pi zijn) te starten, voeg de volgende hoeveelheden leveren aan elk putten reeds met 400 ul van HBS / D: <ol><li> Voeg 50 ul van AO (120 E / ml) of HBS / D om putten in drievoud gekoppeld. De uiteindelijke AO concentratie dient 10 E / ml zijn. Opmerking: Label gepaarde putten als &quot;- AO&quot; en &quot;+ AO&quot;. </li><li> Meng de platen met zachte orbitale mengen gedurende 5 minuten bij 37 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van 2,4 mM ferene-S aan alle putjes. De uiteindelijke ferene-S concentratie moet 200 uM. Meng de platen zoals hierboven voor 5 min bij 37 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van vers bereide 120 uM ijzercitraat. De uiteindelijke ijzer en citraatconcentraties moet 10 uM ijzer en 50 uM citraat zijn. Meng goed. </li></ol&gt; </li><li> In drie drievoud controle putten, zuig het bovenliggende medium en voeg 600 ul HBS / D met 0,1% saponine. Opmerking: Deze zullen als &quot;100% cel-lysis&quot; regelaars voor een lactaat dehydrogenase (LDH) afgifte assay worden parallel uitgevoerd (zie hieronder). </li><li> Incubeer gedurende 60 min in het donker bij 37 ° C. </li><li> Aan het einde van de ascorbaat-efflux assay snel zuigen 500 pl van elk putje toevoegen adequaat geëtiketteerd putten in een 24-wells plaat. Opmerking: voor suspensiecellen aanvankelijk de cellen verwijderd door centrifugeren bij 4 ° C. </li><li> Voeg 300 ul aliquots van het supernatant van een 96-well plaat en lees bij 593 nm. </li></ol> 4. Bepaling van extracellulaire ascorbaat <ol><li> Lees de absorptiewaarden van de putjes op 593 nm. </li><li> Bereken de hoeveelheid extracellulaire ascorbaat als nmol ascorbaat per mg eiwit (of per miljoen cellen) zoals beschreven voor de bepaling van intracellulaire ascorbaatin stap 1.5.4. Let op: de eindgebruiker dient te optimaliseren zodat ascorbaat vrijlating niet wordt beperkt door intracellulaire ascorbaat. </li></ol> 5. Bepaling van LDH release <ol><li> Met de resterende 200 ul van extracellulaire oplossing van elk monster voeren een LDH afgifte test 32,41 om de mate van cellulaire lysis. Opmerking: berekenen als% van totale afgeefbare LDH. Bepaal losmaakbare LDH uit de monsters die werden behandeld met 0,1% saponine. </li></ol>

<ol><li>Buettner, G. R., Schafer, F. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albert+Szent-Gy%C3%B6rgyi%3A+vitamin+C+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Albert Szent-Györgyi: vitamin C identification.</a> Biochem. J. , (2006).</li>
<li>Padayatty, S. J., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+physiology+and+pharmacology+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">New insights into the physiology and pharmacology of vitamin.</a> C. Can. Med. Assoc. J. 164, 353-355 (2001).</li>
<li>Flashman, E., Davies, S. L., Yeoh, K. K., Schofield, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dependence+of+the+hypoxia-inducible+factor+hydroxylases+%28factor+inhibiting+HIF+and+prolyl+hydroxylase+domain+2%29+on+ascorbate+and+other+reducing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Investigating the dependence of the hypoxia-inducible factor hydroxylases (factor inhibiting HIF and prolyl hydroxylase domain 2) on ascorbate and other reducing agents.</a> Biochem. J. 427, 135-142 (2010).</li>
<li>Manning, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Promotes+Maturation+of+T-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Promotes Maturation of T-Cells.</a> Antioxid. Redox Signal. 19, 2054-2067 (2013).</li>
<li>Asard, H., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAsard%2C+H+%22Redox+Biochemistry%22">Redox Biochemistry</a>. Banerjee, R., et al. , John Wiley & Sons. 22-37 (2007).</li>
<li>Aguirre, R., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+the+vascular+bed%3A+Importance+of+vitamin%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Inflammation in the vascular bed: Importance of vitamin.</a> C. Pharmacol. Ther. 119, 96-103 (2008).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Mendiratta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+and+recycling+of+a-tocopherol+in+human+erythrocytes+by+intracellular+ascorbic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Protection and recycling of a-tocopherol in human erythrocytes by intracellular ascorbic acid.</a> Arch. Biochem. Biophys. 349, 281-289 (1998).</li>
<li>Chatterjee, I. B., Majumder, A. K., Nandi, B. K., Subramanian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+some+major+functions+of+vitamin+C+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and some major functions of vitamin C in animals.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 258, 24-47 (1975).</li>
<li>Rumsey, S. C., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption+transport+and+disposition+of+ascorbic+acid+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Absorption transport and disposition of ascorbic acid in humans.</a> J. Nutr. Biochem. 9, 116-130 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Fukuyama, R., Minoshima, S., Shimizu, N., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+chromosomal+mapping+of+the+human+nonfunctional+gene+for+L-gulono-g-lactone+oxidase%2C+the+enzyme+for+L-ascorbic+acid+biosynthesis+missing+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and chromosomal mapping of the human nonfunctional gene for L-gulono-g-lactone oxidase, the enzyme for L-ascorbic acid biosynthesis missing in man.</a> J. Biol. Chem. 269, 13685-13688 (1994).</li>
<li>Challem, J. J., Taylor, E. W. Retroviruses, ascorbate, mutations, in the evolution of Homo sapiens. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChallem%2C+JJ+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22">Free Radic. Biol. Med</a>. 25, 130-132 (1998).</li>
<li>Nishikimi, M., Yagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+deficiency+in+humans+of+gulonolactone+oxidase%2C+a+key+enzyme+for+ascorbic+acid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the deficiency in humans of gulonolactone oxidase, a key enzyme for ascorbic acid biosynthesis.</a> Am. J. Clin. Nutr. 54, 12038-12088 (1991).</li>
<li>Linster, C. L., Biosynthesis Van Schaftingen, E. V. itaminC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((recycling+and+degradation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">recycling and degradation in mammals.</a> FEBS J. 274, 1-22 (2007).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. -c, Qiao, H., Koury, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturational+loss+of+the+vitamin+C+transporter+in+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Maturational loss of the vitamin C transporter in erythrocytes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 360, 295-298 (2007).</li>
<li>Wilson, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vitamin+C+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Regulation of vitamin C transport.</a> Annu. Rev. Nutr. 25, 105-125 (2005).</li>
<li>Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pecking+order+of+free+radicals+and+antioxidants%3A+lipid+peroxidation%2C+a-tocopherol%2C+and+ascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, a-tocopherol, and ascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 300, 535-543 (1993).</li>
<li>May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+ascorbic+acid+an+antioxidant+for+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Is ascorbic acid an antioxidant for the plasma membrane.</a> FASEB J. 13, 995-1006 (1999).</li>
<li>Atanassova, B. D., Tzatchev, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+-+important+for+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Med.+%28Plovdiv%29%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid - important for iron metabolism.</a> Folia Med. (Plovdiv). 50, 11-16 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transferrin+iron+reduction+and+uptake+are+regulated+by+transmembrane+ascorbate+cycling+in+K562+cells%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-transferrin iron reduction and uptake are regulated by transmembrane ascorbate cycling in K562 cells).</a> J. Biol. Chem. 283, 12701-12708 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Bishop, G. M., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+routes+of+iron+accumulation+in+astrocytes%3A+ascorbate-dependent+ferrous+iron+uptake+via+the+divalent+metal+transporter+%28DMT1%29+plus+an+independent+route+for+ferric+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Two routes of iron accumulation in astrocytes: ascorbate-dependent ferrous iron uptake via the divalent metal transporter (DMT1) plus an independent route for ferric iron.</a> Biochem. J. 432, 123-132 (2010).</li>
<li>Lane, D. J. R., Chikhani, S., Richardson, V., Richardson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+iron+uptake+is+stimulated+by+ascorbate+via+an+intracellular+reductive+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Transferrin iron uptake is stimulated by ascorbate via an intracellular reductive mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1833, 1527-1541 (2013).</li>
<li>Lawen, A., Lane, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+iron+homeostasis+in+health+and+disease%3A+uptake%2C+storage%2C+transport%2C+and+molecular+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mammalian iron homeostasis in health and disease: uptake, storage, transport, and molecular mechanisms of action.</a> Antioxid. Redox Signal. 18, 2473-2507 (2013).</li>
<li>Grünewald, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid in the brain.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 123-133 (1993).</li>
<li>Harrison, F. E., May, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+function+in+the+brain%3A+vital+role+of+the+ascorbate+transporter+SVCT2%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2.</a> Free Radic. Biol. Med. 46, 719-730 (2009).</li>
<li>Rebec, G. V., Pierce, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vitamin+as+neuromodulator%3A+ascorbate+release+into+the+extracellular+fluid+of+the+brain+regulates+dopaminergic+and+glutamatergic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">A vitamin as neuromodulator: ascorbate release into the extracellular fluid of the brain regulates dopaminergic and glutamatergic transmission.</a> Prog. Neurobiol. 43, 537-565 (1994).</li>
<li>Hediger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+view+at+C%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">New view at C.</a> Nat. Med. 8, 445-446 (2002).</li>
<li>Du, J., Cullen, J. J., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid%3A+Chemistry%2C+biology+and+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid: Chemistry, biology and the treatment of cancer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1826, 443-457 (2012).</li>
<li>Wilson, J. X., Peters, C. E., Sitar, S. M., Daoust, P., Gelb, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+stimulates+ascorbate+transport+by+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Glutamate stimulates ascorbate transport by astrocytes.</a> Brain Res. 858, 61-66 (2000).</li>
<li>Danbolt, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Glutamate uptake.</a> Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).</li>
<li>May, J. M., Li, L., Hayslett, K., Qu, Z. -c <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+transport+and+recycling+by+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%3A+response+to+glutamate+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbate transport and recycling by SH-SY5Y neuroblastoma cells: response to glutamate toxicity.</a> Neurochem. Res. 31, 785-794 (2006).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+regulation+and+its+neuroprotective+role+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ascorbate regulation and its neuroprotective role in the brain.</a> Trends Neurosci. 23, 209-216 (2000).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glutamate+aspartate+transporter+%28GLAST%29+mediates+L-glutamate-stimulated+ascorbate-release+via+swelling-activated+anion+channels+in+cultured+neonatal+rodent+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">The glutamate aspartate transporter (GLAST) mediates L-glutamate-stimulated ascorbate-release via swelling-activated anion channels in cultured neonatal rodent astrocytes.</a> Cell. Biochem. Biophys. 65, 107-119 (2012).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+and+plasma+membrane+electron+transport+-+enzymes+vs+efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ascorbate and plasma membrane electron transport - enzymes vs efflux.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 485-495 (2009).</li>
<li>Davies, A. R. L., Belsey, M. J., Kozlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume-sensitive+organic+osmolyte%2Fanion+channels+in+cancer%3A+novel+approaches+to+studying+channel+modulation+employing+proteomics+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Volume-sensitive organic osmolyte/anion channels in cancer: novel approaches to studying channel modulation employing proteomics technologies.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1028, 38-55 (2004).</li>
<li>Novakova, L., Solich, P., Solichova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+methods+for+simultaneous+determination+of+ascorbic+and+dehydroascorbic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">HPLC methods for simultaneous determination of ascorbic and dehydroascorbic acids.</a> Trends Anal. Chem. 27, 942-958 (2008).</li>
<li>Vislisel, J. M., Schafer, F. Q., Buettner, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+sensitive+assay+for+ascorbate+using+a+plate+reader%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simple and sensitive assay for ascorbate using a plate reader.</a> Anal. Biochem. 365, 31-39 (2007).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+sensitive+colorimetric+microplate+ferrocyanide+assay+applied+to+ascorbate-stimulated+transplasma+membrane+ferricyanide+reduction+and+mitochondrial+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A highly sensitive colorimetric microplate ferrocyanide assay applied to ascorbate-stimulated transplasma membrane ferricyanide reduction and mitochondrial succinate oxidation.</a> Anal. Biochem. 373, 287-295 (2008).</li>
<li>Lane, D. J. R., Robinson, S. R., Czerwinska, H., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Na%2B%2FH%2B+exchangers+and+intracellular+pH+in+regulating+vitamin+C-driven+electron+transport+across+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">A role for Na+/H+ exchangers and intracellular pH in regulating vitamin C-driven electron transport across the plasma membrane.</a> Biochem. J. 428, 191-200 (2010).</li>
<li>Corti, A., Casini, A. F., Pompella, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+for+transport+and+efflux+of+ascorbate+and+dehydroascorbate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways for transport and efflux of ascorbate and dehydroascorbate.</a> Arch. Biochem. Biophys. 500, 107-115 (2010).</li>
<li>Laroff, G. P., Fessenden, R. W., Schuler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li>
<li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li>
<li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li>
<li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li>
<li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Res%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li>
<li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In dit artikel presenteren we twee snelle, specifieke en relatief gevoelige colorimetrische microplate assays voor het bepalen van ascorbaat afgeleid van de intra-en extracellulaire compartimenten in gekweekte cellen. De testen kunnen worden aangevuld met toegang tot standaard laboratorium apparatuur en reagentia. Het slechts matig duur reagens die voor de test is AO, die essentieel omdat het zorgt voor een hoge mate van specificiteit analyt naar L-ascorbaat. De testen zijn goed geschikt o...

De ontdekking van de chemische aard van ascorbinezuur (vitamine C) en de identificatie als het lang gezochte &quot;anti-scheurbuik factor&quot;, door Albert Szent-Györgyi en anderen in papers 1928-1934 1 werden mijlpalen in de geschiedenis biochemie. Inderdaad, deze ontdekkingen hebben bijgedragen aan Szent-Györgyi de toekenning van de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde in 1937. De steeds groeiende reeks van rollen voor ascorbaat in dierlijke en plantaardige fysiologie, evenals de menselijke gezondheid, blijven de onderwerpen van actieve wetenschappelijke zijn onderzoek en controverse. L-ascorbaat is een overvloedige fysiologisch reductiemiddel en enzym cofactor in zoogdierlijke systemen en draagt ​​talrijke welbepaalde enzymatische reacties die collageen hydroxylering, carnitine en norepinefrine biosynthese, tyrosine metabolisme en peptide hormoon amidering 2. Intrigerend, montage evidence stelt ascorbaat speelt een rol bij het ​​stimuleren van andere ijzer-afhankelijke dioxygenases, zoals prolyl-en asparaginyl hydroxylases betrokken bij de hydroxylering en de gerichtheid van de hypoxia-induceerbare factor (HIFs) 1α en 2α 3. Een recent rapport blijkt dat ascorbaat speelt een rol in de T-cel rijping, door invloed chromatine demethylation via haar activiteiten in het stimuleren van de nucleaire hydroxylases, Jumonji C (JmjC) domein eiwitten; waarvan de laatste lijken te ascorbaat voor de volledige activiteit 4 nodig. Inderdaad lijkt de stimulatie van dergelijke enzymen door ascorbaat plaatsvinden via een vergelijkbaar mechanisme om de stimulatie door ascorbaat van de HIF en collageen hydroxylases. Onder andere klassieke effecten, ascorbaat aanzienlijk bij tot cellulaire antioxidatie als een in water oplosbare keten vrijkomen radicalen 5 en de recycling van plasmamembraan α-tocoferol (vitamine E) via de vermindering van de α-tocopheroxyl groep 6, which is belangrijk bij de bescherming tegen membraan lipide peroxidatie 7. Belangrijk, hoewel de meeste zoogdieren kunnen de novo hepatische synthese van ascorbaat uit D-glucose, hogere primaten, cavia&#39;s en sommige knuppels afhankelijk voedingsbronnen van vitamine 8. Dit is vanwege inactivering van de Gulo gen, de orthologen van die onaangetast zoogdieren coderen voor het enzym, γ-gulono-lacton oxidase 9-13. Dit enzym is vereist voor de laatste reactie in ascorbaat biosynthese uit glucose 13. Na-transporter gemedieerde absorptie vanuit het darmlumen in mensen wordt ascorbaat hele lichaam verspreid door de bloedsomloop. De vitamine is doorgaans te vinden in zijn gereduceerde vorm bij millimolaire concentraties intracellulair (met de opmerkelijke uitzondering van erytrocyten waarin de concentraties zijn meestal vergelijkbaar met de gangbare plasma concentratie), en bij micromolaire concentrations (bijv. 50-200 uM) in de meeste extracellulaire vloeistoffen 14,15. Onder fysiologische omstandigheden, ascorbaat ondergaat typisch een omkeerbare een elektron oxidatie tot het ascorbinezuur vrije radicalen (AFR, ook bekend als monodehydroascorbate of semidehydroascorbate). Terwijl de AFR is een relatief stabiel radicaal 16, bij het ​​ontbreken van een snelle een-elektron enzymatische reductie terug naar ascorbaat, kunnen twee AFRS dismutate verder een ascorbaat en een dehydroascorbaat (DHA) 9,13,17. In het inwendige van de cel, de twee-elektron oxidatieproduct ascorbaat, DHA, kunnen snel naar ascorbaat verminderd glutathion en NAD (P) H-afhankelijke enzymatische en niet-enzymatische reacties 13. Hoewel het klassiek wordt aanvaard dat ascorbaat enige belangrijke rol in het metabolisme van ijzer is om de voeding absorptie van non-heem ijzer 18 stimuleren, hebben wij en anderen leverde bewijs strongly suggereert dat ascorbaat speelt een aanzienlijk grotere rol in het metabolisme van dit metaal. Ten eerste lijkt ascorbaat die vrijkomt door ascorbaat-vol-cellen een belangrijke rol spelen bij het ​​moduleren van de opname van niet-transferrine gebonden ijzer door cellen 19,20, en zeer recente gegevens blijkt dat ascorbaat moduleert ook de opname van transferrine gebonden ijzer door cellen 21, deze overeenkomt met een grote fysiologische ijzeropname-route 22. Ascorbaat is essentieel voor normale centraal zenuwstelsel functie zoogdieren 23,24. Samen met de bijnierschors, hypofyse, thymus, netvlies en gele lichaam, de hersenen bevat hoge concentraties ascorbaat ten opzichte van andere lichaamsweefsels 23,25-27. Bovendien wordt de blootstelling van zowel astrocyten 28,29 en neuron-achtige cellen 30 tot glutamaat waarover de afgifte van ascorbaat leiden in de extracellulaire ruimte, waarbij de ascorbate wordt gedacht om te helpen neuronen beschermt tegen glutamaat-geïnduceerde neuronale dysfunctie 31. Hoewel het exacte mechanisme van glutamaat-geïnduceerde ascorbaat vrijlating uit de astrocyten onbekend is, hebben we onlangs bewijs geleverd waaruit blijkt de betrokkenheid van de cel zwelling veroorzaakt door glutamaat opname door de astrocyten glutamaat en aspartaat transporter (GLAST; ook bekend prikkelende aminozuurtransporter isovorm 1 [EAAT1 ] bij de mens) en daaropvolgende activatie van volume-gevoelige osmolyt en anionkanalen (VSOACs) dat doorlaatbaar is voor kleine organische anionen zoals ascorbaat 32 zijn. De moleculaire identiteit van de plasmamembraan leidingen die deze VSOAC formatie nog worden geïdentificeerd 33,34. Hoewel veel assays ontwikkeld voor het bepalen van ascorbaat in biologische monsters, die spectrofotometrische, fluorometrische en chromatografische bepalingen 35,36 zijn er grote variatie in specificiteit, gevoeligheid, interference door chemische contaminanten, effectieve lineaire bereik en de stabiliteit van het eindpunt analyt. Bovendien, andere belangrijke factoren beïnvloeden de assay snelheid, gebruiksgemak en toegang tot betrekkelijk gespecialiseerde apparatuur zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC) apparaat. Hier presenteren we een eenvoudige en zeer specifieke colorimetrische microplate assay voor de bepaling van intracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen, evenals een afzonderlijke assay voor de bepaling van ascorbaat-uitstroming uit gekweekte cellen. De laatste test is bedoeld om het probleem van de onderschatting van ascorbaat vrijlating uit de cellen te omzeilen door snelle heropname van vrijgegeven ascorbaat door natrium-afhankelijke ascorbaat transporters (SVCTs). Hoewel beide van deze methoden zijn verschenen in een aantal van onze eerdere publicaties 19,20,32,37,38, dit manuscript biedt een expliciete set van instructies en richtsnoeren voor de daadwerkelijke uitvoering.

<table><tbody><tr><td>Nunc 96-well flat-bottom plates</td><td>Thermo</td><td>269620</td><td>Elke platte 96-well met platte bodem kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td>Een niet-gekoelde microcentrifuge die in temperatuur is uitgebalanceerd in een koude kamer kan ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Refrigerated bench-top centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Zwaaiende emmer</td></tr><tr><td>Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Elke microplate-spectrofotometer die in staat is om op 593 nm te lezen, kan worden gebruikt en wordt aanbevolen. Als een filter-gebaseerde plate reader wordt gebruikt, kies dan de dichtstbijzijnde mogelijke golflengte en gebruik de standaardcurve-methode.</td></tr><tr><td>Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Dit is een zeer veelzijdige en betrouwbare microplatemixer en werkt erg goed voor deze assays</td></tr><tr><td>General-purpose buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&bull;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&bull;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>General chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-ascorbic acid of sodium L-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Bereiding met de hoogste zuiverheid moeten worden verkregen</td></tr><tr><td>Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30790</td><td>Waterige oplossingen leveren theoretisch 2 mol DHA-monomeer per mol DHA-dimer</td></tr><tr><td>Cytochalasin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>Stockoplossingen bereid in DMSO of ethanol</td></tr><tr><td>Ascorbate oxidase (AO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0157</td><td>Stockoplossingen (120 U/ml) kunnen worden bereid in PBS of MBS en vervolgens in aliquoten worden ingevroren</td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide (FIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455989</td><td>Trihydraat</td></tr><tr><td>Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&prime;,5&prime;&prime;-disulfonic acid disodium salt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92940</td><td></td></tr><tr><td>Sodium L-glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Bereid een 0,1% stockoplossing</td></tr><tr><td>Stockoplossingen voor intracellulaire ascorbaatbepaling assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 M sodium acetate (pH 6,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M citroenzuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3 mM FeCl3 in 0,1 M azijnzuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% (v/v) azijnzuur + 30% (w/v) trichloroazijnzuur (TCA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stockoplossingen voor ascorbaat-efflux assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AO (120 U/ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4 mM ferene-S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,12 mM FeCl3 in 0,6 mM sodium-citrat</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle en specifieke microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamine C (ascorbaat) speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Bijvoorbeeld, in de hersenen, ascorbaat handelt in een neuroprotectieve en neuromodulatory manier die ascorbaat fietsen tussen neuronen en astrocyten vicinaal betreft - een relatie die lijkt cruciaal voor de hersenen ascorbaat homeostase te zijn. Daarnaast opkomende er sterke aanwijzingen dat ascorbaat heeft een sterk uitgebreide rol in het reguleren van de cellulaire en systemische ijzer metabolisme dan is klassiek erkend. De toenemende erkenning van de integrale rol van ascorbaat in normale en gedereguleerde cellulaire en organismale fysiologie vereist een reeks middelgrote doorvoer en zeer gevoelige analytische technieken die kunnen worden uitgevoerd zonder de noodzaak van zeer dure specialistische apparatuur. Hier geven we expliciete instructies een middelgrote doorvoer, specifieke en relatief goedkoop microplate assay voor de bepaling van boe intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Bepaling van intracellulaire Ascorbate in gekweekte suspensiecellen In het eerste assay (figuur 1), wordt bepaald intracellulaire ascorbaat, na ascorbaat-specifieke (bijvoorbeeld AO-gevoelige) reductie van ferricyanide tot ferrocyanide, met de zeer gevoelige bepaling van ferrocyanide een eerder gepubliceerde werkwijze 37. De detectie van ascorbaat is gebaseerd op de colorimetrische chelatie van ferro-ijzer dat wordt gegenereerd door de ascorbaat-afhankelijke...

Ascorbaat speelt talloze belangrijke rol in cellulair metabolisme, waarvan vele alleen aan het licht in de afgelopen jaren. Hier beschrijven we een middelgrote doorvoer, specifiek en goedkoop microplate assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in celcultuur.

Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het bepalen van de intracellulaire of extracellulaire ascorbaatspiegels in gecultiveerde of geïsoleerde cellen. Dit wordt bereikt door celextracten of hele cellen te incuberen met een score-oxidase om selectief een score-BA in opeenvolgende stappen uit te putten. In de eerste methode worden celextracten geïncubeerd met cyanide om op een ascorbaatafhankelijke wijze ferrocyanide te genereren, wat een directe weergave geeft van de hoeveelheid ascorbaat in de extracten.Vervolgens wordt de hoeveelheid gevormd ferrocyanide in de celextracten bepaald door het ferrocyanide kwantitatief te oxideren met toegevoegd ferric-ijzer tot ferric-ijzer, om zo een chromogeen ijzer(II)-ferrozine-complex te genereren dat spectrofotometrisch gekwantificeerd kan worden. In de tweede methode worden alle cellen direct geïncubeerd met de ijzer(II)-chelator ferrozine en ferriccitraat. De resultaten tonen verschillen in intracellulaire of extracellulaire ascorbaatniveaus op basis van de kwantitatieve en specifieke reductie van detecteerbare extracellulaire ijzercomplexen.Spectrometrisch. Het belangrijkste voordeel van de huidige techniek ten opzichte van bestaan

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

This video demonstrates a quantification technique for CO2 released during substrate oxidation using 14C-radiolabeled substrates. The released 14CO2 is trapped in an alkaline solution and quantified by a scintillation counter. The oxidation of different substrates varies between tissues and reflects the pathophysiological condition of the tissue.

Substrate Oxidation Assay in Cultured Cells: An In Vitro Assay to Quantify Substrate Oxidation in Cells by Measuring Radioactive Signals from Trapped CO2

This video demonstrates an assay to study the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells. The cells are exposed to a bacterial pore-forming toxin, which forms pores in the cell membrane. In the presence of extracellular calcium ions, the pore causes calcium influx, inducing membrane-resealing events. The resealing efficiency is assessed using DNA-binding propidium iodide dye, which only enters cells without a resealed membrane.

An In Vitro Fluorescence-Based Assay to Measure Plasma Membrane Resealing Efficiency

Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

We aangepast een reeks protocollen voor de meting van reactive oxygen species (ROS) die in verschillende amoebe en zoogdieren cellulaire modellen kan worden toegepast voor de kwalitatieve en kwantitatieve studies.

Opsporen, visualiseren en kwantificeren van de Generatie van reactive oxygen species in een Amoeba Model Systeem

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H+ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

Leer een snelle microplaat-assay om intra- en extracellulair ascorbaat in gekweekte cellen te meten. Deze kosteneffectieve methode biedt inzicht in de rol van ascorbaat in cellulaire stofwisseling.

Een snelle en specifieke Microplate Assay voor de bepaling van de intra-en extracellulaire ascorbaat in gekweekte cellen

Meer video's verkennen