Name: Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Leer de bereiding van DNA-verknoopte polyacrylamide hydrogels voor het bestuderen van weefselstijfheid en celfunctie. Deze methode maakt dynamische modulatie van gel-eigenschappen mogelijk zonder UV-stimulatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag bedanken: Dr Frank Jiang, Dr David Lin, Dr Bernard Yurke en Dr Uday Chippada voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van de DNA-gel technologie; Dr Norell Hadzimichalis, Smit Shah, Kimberly Peterman, Robert Arter voor hun opmerkingen en bewerkingen van dit manuscript; financieringsbronnen, waaronder de New Jersey Commissie over Spinal Cord Research (Grant # 07A-019-SCR1, NAL) en New Jersey Instituut voor Neurowetenschappen (MLP); en uitgevers van Tissue Engineering, deel A, voor de toestemming om de figuren 2 en 4 en Biomaterialen herdrukken voor toestemming om Figuur 3 herdrukken.

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly+A+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly A close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nat Cell Biol. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Peppas Brannon-Peppas, L., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+equilibrium+swelling+behaviour+of+ph-sensitive+hydrogels+containing+2-hydroxyethyl+methacrylate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic and equilibrium swelling behaviour of ph-sensitive hydrogels containing 2-hydroxyethyl methacrylate.</a> Biomaterials. 11 (9), 635-644 (1990).</li>
<li>Charati, M. B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A., Linhardt, J. G., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+elastomeric+biomaterials+based+on+resilin-like+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic elastomeric biomaterials based on resilin-like polypeptides.</a> Soft Matter. 5 (18), 3412-3416 (2009).</li>
<li>Davis, K. A., Burke, K. A., Mather, P. T., Henderson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+behavior+on+shape+memory+polymer+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell behavior on shape memory polymer substrates.</a> Biomaterials. 32 (9), 2285-2293 (2011).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophys J. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Gray, D. S., Tien, J., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repositioning+of+cells+by+mechanotaxis+on+surfaces+with+micropatterned+youngs+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned youngs modulus.</a> J Biomed Mater Res A. 66 (3), 605-614 (2003).</li>
<li>Homma, M., Seida, Y., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+the+dynamic+behavior+of+an+electrodriven+ionic+polymer+hydrogel+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on the dynamic behavior of an electrodriven ionic polymer hydrogel membrane.</a> Journal of applied Polymer Science. 82 (1), 76-80 (2001).</li>
<li>Horkay, F., Tasaki, I., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+swelling+of+polyacrylate+hydrogels+in+physiological+salt+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osmotic swelling of polyacrylate hydrogels in physiological salt solutions.</a> Biomacromolecules. 1 (1), 84-90 (2000).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+on+a+DNA+crosslinked+hydrogel+with+tunable+stiffnesses%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth on a DNA crosslinked hydrogel with tunable stiffnesses.</a> Ann Biomed Eng. 36 (9), 1565-1579 (2008).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dynamic+stiffness+of+the+substrates+on+neurite+outgrowth+by+using+a+DNA-crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of dynamic stiffness of the substrates on neurite outgrowth by using a DNA-crosslinked hydrogel.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (6), 1873-1889 (2010).</li>
<li>Jiang, F. X., Yurke, B., Schloss, R. S., Firestein, B. L., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+fibroblast+growth+and+the+dynamic+stiffnesses+of+a+DNA+crosslinked+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between fibroblast growth and the dynamic stiffnesses of a DNA crosslinked hydrogel.</a> Biomaterials. 31 (6), 1199-1212 (2010).</li>
<li>Kloxin, A. M., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+photodegradable+hydrogels+as+dynamically+tunable+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of photodegradable hydrogels as dynamically tunable cell culture platforms.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1867-1887 (2010).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+a+reversible%2C+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of a reversible, DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogel.</a> J Biomech Eng. 126 (1), 104-110 (2004).</li>
<li>Lin, D. C., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rigid+spherical+inclusions+in+young%27s+moduli+determination%3A+Application+to+DNA-crosslinked+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Use of rigid spherical inclusions in young's moduli determination: Application to DNA-crosslinked gels.</a> J Biomech Eng. 127 (4), 571-579 (2005).</li>
<li>Luo, Y., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+immobilization+of+biomolecules+to+agarose+hydrogels+for+controlled+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Light-activated immobilization of biomolecules to agarose hydrogels for controlled cellular response.</a> Biomacromolecules. 5 (6), 2315-2323 (2004).</li>
<li>Marklein, R. A., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+hydrogel+mechanics+to+modulate+stem+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled hydrogel mechanics to modulate stem cell interactions.</a> Soft Matter. 6 (1), 136-143 (2010).</li>
<li>Pelham Jr, R. J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Previtera, M. L., Chippada, U., Schloss, R. S., Yurke, B., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+DNA-crosslinked+polyacrylamide+hydrogels+with+increasing+crosslinker+density%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of DNA-crosslinked polyacrylamide hydrogels with increasing crosslinker density.</a> BioResearch Open Access. 1 (5), 256-259 (2012).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+substrate+stiffness+and+cell+density+on+primary+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effects of substrate stiffness and cell density on primary hippocampal cultures.</a> J Biosci Bioeng. 110 (4), 459-470 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Langhammer, C. G., Langrana, N. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendrite+arborization+by+substrate+stiffness+is+mediated+by+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendrite arborization by substrate stiffness is mediated by glutamate receptors.</a> Ann Biomed Eng. 38 (12), 3733-3743 (2010).</li>
<li>Previtera, M. L., Trout, K. L., Verma, D., Chippada, U., Schloss, R. S., Langrana, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+morphology+on+dynamic+softening+of+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast morphology on dynamic softening of hydrogels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (5), 1061-1072 (2012).</li>
<li>Saxena, T., Gilbert, J., Stelzner, D., Hasenwinkel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+characterization+of+the+injured+spinal+cord+after+lateral+spinal+hemisection+injury+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanical characterization of the injured spinal cord after lateral spinal hemisection injury in the rat.</a> J Neurotrauma. 29 (9), 1747-1757 (2012).</li>
<li>Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+growth+in+3d+collagen+gels+with+gradients+of+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Neurite growth in 3d collagen gels with gradients of mechanical properties.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (2), 632-643 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+development+A+growing+role+for+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in development A growing role for contractility.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 34-43 (2009).</li>
<li>Wuerfel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mr-elastography+reveals+degradation+of+tissue+integrity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Mr-elastography reveals degradation of tissue integrity in multiple sclerosis.</a> Neuroimage. 49 (3), 2520-2525 (2012).</li>
<li>Zaari, N., Rajagopalan, P., Kim, S. K., Engler, A. J., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photopolymerization+in+microfluidic+gradient+generators+Microscale+control+of+substrate+compliance+to+manipulate+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Photopolymerization in microfluidic gradient generators Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response.</a> Adv Mater. 16 (23-24), 2133-2137 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het vermogen van DNA gels zacht of verstijven voor en na celadhesie zijn ze ideaal model voor de rol van dynamische stijfheid weefsels op celfunctie bestuderen. Alle drie ontwerpen zijn gebruikt in mechanische en biologische studies. Echter, alle drie ontwerpen hebben vergelijkbare elasticiteit bij verschillende crosslink percentages vermelding verknoping lengte ofwel geen invloed DNA gel elasticiteit (tabel 2). Daarentegen acrylamide concentratie beïnvloedt elasticiteit. Deze ontwerpen kunnen verschill...

Statische en dynamische substraten twee categorieën biomaterialen die zijn ontwikkeld om de effecten van weefsel elasticiteit of stijfheid op celfunctie bestuderen. Statische substraten kunnen hun fysische eigenschappen veranderen nadat ze zijn vervaardigd en / of wanneer cellen worden uitgeplaat. Polyacrylamide (PA) gels waren de eerste tweedimensionale, statische substraten die werden gesynthetiseerd voor Mechanobiology onderzoeken 5,17. PA gels zijn gemakkelijk te bereiden, goedkoop, veelzijdig en kan worden vervaardigd met een groot aantal elastische moduli. Hoewel deze technische voordelen maken PA gels een algemeen toegepaste substraat, statische substraten zijn niet indicatief voor het dynamische karakter van de extracellulaire matrix (ECM) en de omliggende cellulaire omgeving in vivo. Bijvoorbeeld, de ECM stijfheid veranderingen ondergaat als gevolg van een verwonding, ontwikkeling of ziekte. Dynamische substraten zijn daarom de voorkeur als weefsel nabootsen substraat modellen in Mechanobiology studies <sup&gt; 22,24,25. Talrijke synthetisch zijn natuurlijke, tweedimensionale, driedimensionaal, statische en dynamische biomaterialen ontwikkeld om weefsel stijfheid 1,3,6,16,23,26 nabootsen. Sommige dynamische substraten vereisen hitte, UV-, elektrische stroom, ionen en de pH veranderingen in hun mechanische eigenschappen 2,4,7,8,12,15,16 veranderen, maar deze prikkels kunnen bio-applicatie van de hydrogel te beperken. DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels (DNA gels) dynamisch tweedimensionale elastische substraten. DNA crosslinks zorgen voor temporele, ruimtelijke en reversibele modulatie van DNA gel stijfheid door toevoeging van enkelstrengs DNA (ssDNA) media of buffer 9-11,13,14,18,21. Anders dan de bovengenoemde dynamische gels waar stimuli worden toegepast modulatie van elasticiteit, de DNA gels vertrouwen op de diffusie van toegepaste ssDNA voor de wijziging van elasticiteit. Daarom is de bovenste gel oppervlak, waar de cellen worden gekweekt, is het eerste gebied gemoduleerde omdat het tarief of elasticiteit modulatie afhankelijk van de gel dikte. DNA gels zijn vergelijkbaar met hun tegenhangers PA gel in dat ze een polyacrylamide hoofdketen, maar de bis-acrylamide verknopingen vervangen verknopingen samengesteld DNA (figuur 1). Twee ssDNAs (SA1 en SA2) hybridiseren met een verharder streng (L2) te maken van de DNA-verknopingen van de gel. SA1 en SA2 hebben verschillende sequenties die beide bevatten een acrydite modificatie aan het 5&#39;-end voor een effectieve integratie in de PA-netwerk. Voor de bereiding van de gels, SA1 en SA2 worden afzonderlijk gepolymeriseerd tot een PA hoofdketen en vervolgens het gepolymeriseerde SA1 en SA2 samen gemengd. L2, de crosslinker, wordt toegevoegd aan de SA1 en SA2 mengsel. De L2 basenvolgorde is complementair aan zowel SA1 en SA2 sequenties en L2 hybridiseert met SA1 plus SA2 aan het DNA crosslinks vormen. Eerste, DNA gel elasticiteit wordt bepaald door zowel L2 concentraties en verknoping (tabellen 1 </strong&gt; en 2). DNA gels die gelijk stoichiometrische hoeveelheden L2, SA1 en SA2 zijn de stijfste gels omdat SA1 en SA2 zijn 100% verknoopt door L2 (aangeduid als 100% gels). Lagere concentraties L2 resulteren in een lager percentage DNA verknoping en derhalve zachter DNA gels. Gels zo laag als 50% verknoopt (aangeduid als 50% gels) zijn geconstrueerd 9-11. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/51323/51323fig1highres.jpg" /> Figuur 1 DNA gel verknoping en uncrosslinking schematische 9-11,13,14,18,21 Stap 1:. SA1 (rood) en SA2 (blauw) zijn individueel gepolymeriseerd tot een polyacrylamide backbone (zwart). Na polymerisatie worden SA1 en SA2 gepolymeriseerde oplossingen met elkaar vermengd. Stap 2: L2 (groen) wordt toegevoegd en hybridiseert met SA1 plus SA2 de verknopingen van de gel. Stap 3: R2 hybridiseert met thij steunpunt van L2. Stap 4: steunpunt hybridisatie van R2 stuwt het openritsen van L2 uit SA1 en SA2. In tegenstelling tot de PA gels, kan DNA-gels verstijven en te verzachten na de synthese. Daarom kunnen cellen gekweekt op DNA gels onderworpen aan dynamische stijfheid veranderingen. Om cel-hechtende gels verstevigen, L2 kunnen worden toegevoegd aan het kweekmedium van laag percentage gels het percentage verknopingen verhogen. Om cel-hechtende gels verzachten, L2 kan worden verwijderd om het percentage verknopingen 10,13,21 verminderen. L2 heeft een extra steunpunt sequentie aan het 3&#39;einde om L2 te uncrosslink van SA1 en SA2 (tabel 1). Verwijdering van L2 wordt bereikt door hybridisatie van een omkering streng genoemd R2. R2 is een aanvulling op de volledige lengte van L2 en hybridiseert eerst met de L2 houvast. Toehold hybridisatie stuwt het openritsen van L2 uit SA1 en SA2, die de crosslink elimineert en vermindert de gel stijfheid. In dit rapport envideo, stap-voor-stap instructies worden verstrekt voor het opstellen van verstijving en verzachtende DNA gels. Terwijl 100% en 80% gelpreparaten worden beschreven, kan dit protocol worden aangepast aan DNA gels van andere eerste en laatste verknoopt percentages creëren. In het algemeen zijn 100% en 80% gels bereid, geïmmobiliseerd op glazen dekglaasjes, gefunctionaliseerde en geënt met cellen. L2 wordt toegevoegd aan het medium van 80% gels en R2 wordt toegevoegd aan het medium 100% gels, 48 ​​uur na uitplaten. De toevoeging van L2 tot media verstijft 80% gels tot 100% verknoopt, terwijl de toevoeging van R2 naar media verzacht 100% gels tot 80% verknoopt. Verstijfde gels worden aangeduid als 80 → 100% gels en zacht gels worden aangeduid als 100 → 80% gelen in de tekst. Voor control of statische gels, ssDNA bestaande uit Ts of As is afgeleverd andere set 100% en 80% gels. Na minimaal twee dagen na elasticiteit modulatie, kunnen cellen worden verwerkt en geanalyseerd. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:kEEP-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> DNA crosslink </td><td rowspan="2"> # Van basen </td><td> Sequence (steunpunt) </td><td rowspan="2"> Modificatie </td><td rowspan="2"> Smelttemperatuur (Tm, ° C) </td><td rowspan="2"> Reacties </td></tr><tr><td> 5 &#39;→ 3&#39; </td></tr><tr><td rowspan="4"> Ontwerp 1 </td><td> SA1 </td><td> 10 </td><td> GCA CCT TTG C </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 34,9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 10 </td><td> GTC AGA ATG A </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 23,6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 30 </td><td> TCA TTC TGA C GC AAA GGT GC G CTA CAC TTG </td><td></td><td> 56 </td><td>Een 10 bp toehold sequentie wordt opgenomen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 30 </td><td> CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGA </td><td></td><td></td><td> R2 is complementair aan L2 </td></tr><tr><td rowspan="4"> Ontwerp 2 </td><td> SA1 </td><td> 14 </td><td> CGT GGC ATA GGA CT </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 46.9 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 14 </td><td> GTT TCC CAA TCA GA </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 40.2 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCT GAT TGG GAA AC Een GTC CTA TGC CAC G GT TAC CTT CAT C </td><td></td><td> 65.9 </td><td> Een 12 bp volgorde steunpunt is inbegrepen. </td></tr><tr><td> R2 </td><td> 40 </td><td> GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A </td><td></td><td> 65.9 </td><td> R2 is complementair aan L2 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Design 3 </td><td> SA1 </td><td> 20 </td><td> ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 55 </td><td></td></tr><tr><td> SA2 </td><td> 20 </td><td> CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA </td><td> 5 &quot;acrydite </td><td> 56.6 </td><td></td></tr><tr><td> L2 </td><td> 40 </td><td> TCC AGT CGT CCC TAA GCA TG G ACA TTG CAT ACA CCT CCG T </td><td></td><td> 68.8 </td><td> Steunpunt is niet inbegrepen. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Controle </td><td rowspan="2"> Controle </td><td rowspan="2"> 20-40 </td><td> AAA AAA (etc.) of </td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td> TTT TTT (etc.) </td></tr></tbody></table> Tabel 1 Basis sequenties voor ssDNA 9-11,13,14,18,21. Cellulaire en mechanische studies hebben verscheidene d benutifferent crosslink ontwerpen DNA gels met verschillende statische en dynamische mechanische eigenschappen te genereren. De gemoduleerd verknoping ontwerpparameters zijn basensequentie sequentie en lengte of verknopen lengte. Vet en cursief lettertype illustreren baseparing tussen SA1 en L2 en tussen respectievelijk SA2 en L2. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="8"> Ontwerp </td></tr><tr><td colspan="3"> 1 </td><td colspan="3"> 2 </td><td colspan="2"> 3 </td></tr><tr><td> Acrylamide Concentratie (%) </td><td colspan="3"> 10 </td><td colspan="3"> 10 </td><td> 10 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SA1 plus SA2 gehybridiseerd met L2 (% verknoopt) </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 80 </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> &lt;strong&gt; Elasticiteit (kPa, gemiddelde ± SEM) </td><td> 6,6 ± 0,6 </td><td> 17,1 ± 0,8 </td><td> 29.8 ± 2.5 </td><td> 5.85 ± 0.62 </td><td> 12.67 ± 1.33 </td><td> 22.88 ± 2.77 </td><td> 25.2 ± 0.5 </td><td> 10,4 ± 0,6 </td></tr></tbody></table> Tabel 2 Young&#39;s modulus (E) van DNA gels 9-11,13,14,18,21. Acrylamide concentratie crosslink percentage en verknoping lengte kan worden gemoduleerd DNA gels. Designs 1, 2 en 3 hebben 20, 28 en 40 bp verknopen lengten respectievelijk. 100% gels voor alle ontwerpen hebben vergelijkbare moduli aangeeft crosslink lengte heeft geen invloed gel elasticiteit. Echter, variaties in concentratie acrylamide veranderen DNA gel elasticiteit.

<table><tbody><tr><td>ssDNA</td><td>Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) idtdna.com</td><td></td><td>Doe ssDNA niet in een vortex te mengen. Draai de fles voorzichtig om en/of pipet oplossing om te mengen.</td></tr><tr><td>PBS met calcium en magnesium</td><td></td><td></td><td>Elk merk.</td></tr><tr><td>100x Tris-EDTA buffer (TE buffer)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO) sigmaldrich.com</td><td>T9285</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>93290</td><td>TBE is een reproductieve toxine.</td></tr><tr><td>40% Acrylamide oplossing</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>BP14021</td><td>Acrylamide is een toxine.</td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>A3678</td><td>Bereid een 2% oplossing in TE buffer. APS is een toxine en irriterend.</td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>T9281</td><td>Bereid een 20% oplossing in TE buffer. TEMED is ontvlambaar, corrosief en een toxine.</td></tr><tr><td>12 mm diameter ronde dekglazen</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA) fishersci.com</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Norland optische lijm 72</td><td>Norland Products (Cranbury, NJ) norlandprod.com</td><td>NOA72</td><td></td></tr><tr><td>24-well weefselkweekplaat</td><td></td><td></td><td>Elk merk.</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuizen</td><td></td><td></td><td>Elk merk.</td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ProteoChem of Thermo Fisher, (Rockland, IL) proteochem.com of thermofisher.com</td><td>C111 of 22589</td><td>Bereid een 0,315 mg/ml oplossing in water direct voor gebruik. Los op bij 37 &deg;C en steriliseer met filter. Het is normaal om onopgelost sulfo-SANPAH in het filter waar te nemen. Sulfo-SANPAH is lichtgevoelig en daarom moet de oplossing worden beschermd tegen licht tot UV-blootstelling.</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)</td><td>P6407</td><td>Bereid een 0,2 mg/ml oplossing in water en steriliseer met filter.</td></tr><tr><td>Collageen Type I</td><td>Affymetrix (Santa Clara, CA) affymetrix.com</td><td>13813</td><td>Bereid een 0,2 mg/ml oplossing in 0,2 N azijnzuur. Oplossing moet altijd koud blijven om polymerisatie te voorkomen. Azijnzuur is ontvlambaar, giftig en corrosief.</td></tr><tr><td>22 x 60 dekglazen</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Positief verplaatsingspijp</td><td>Gilson, Inc (Middletown, WI) gilson.com</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Warmteblok</td><td>Fisher Scientific (Pittsburg, PA)</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>UV lichtbron</td><td></td><td></td><td>Plaats gels zo dicht mogelijk bij de UV lichtbron. UV licht kan huid- of oogletsel veroorzaken.</td></tr><tr><td>Thermometer</td><td></td><td></td><td>Elk merk.</td></tr><tr><td>Stikstofgas</td><td>GTS-Welco (Flemington, NJ) www.praxairmidatlantic.com/</td><td>NI 5.0UH-R</td><td></td></tr></tbody></table>

bereiding van dna verknoopt polyacrylamide hydrogels

Preparation of DNA-crosslinked Polyacrylamide Hydrogels

Mechanobiology is een opkomende wetenschappelijk gebied dat de kritische rol van fysieke signalen in regisseren cel morfologie en functie-adressen. Bijvoorbeeld, het effect weefsel elasticiteit celfunctie is een belangrijk gebied van Mechanobiology onderzoek omdat weefsel stijfheid moduleert met de ziekte, ontwikkeling, en schade. Static weefsel nabootsen materialen, of materialen die niet kan wijzigen stijfheid wanneer cellen worden uitgeplaat, worden voornamelijk gebruikt om de effecten weefsel stijfheid op celfuncties te onderzoeken. Terwijl verzameld van statische studies informatie waardevol is, deze studies zijn niet indicatief voor het dynamische karakter van de cellulaire micro-omgeving in vivo. Om de effecten van dynamische stijfheid op celfunctie beter tegemoet ontwikkelden we een DNA verknoopt polyacrylamide hydrogel systeem (DNA gels). In tegenstelling tot andere dynamische substraten, DNA gels hebben de mogelijkheid om te verlagen of te verhogen van de stijfheid na fabricage zonder stimuli. DNA gels bestaan ​​uit DNA crosslinkten die worden gepolymeriseerd tot een polyacrylamide hoofdketen. Toevoegen en verwijderen verknopingen via levering van enkelstrengs DNA mogelijk maakt temporele, ruimtelijke en reversibele controle gel elasticiteit. We hebben laten zien in de vorige verslagen die de dynamische modulatie van DNA-gel elasticiteit beïnvloedt fibroblast en neuron gedrag. In dit verslag en video, bieden we een schema dat de DNA-gel verknoping mechanismen en stap-voor-stap instructies beschrijft over het preparaat DNA gels.

Voorafgaand aan onze studies, werden cel-ECM interacties waargenomen op statische compliant biomaterialen of op onomkeerbare en unidirectionele dynamische substraten. Deze substraten geen juiste weergave van de dynamische aard van de cellulaire micro-omgeving. Ons werk verschuift de bestaande technische paradigma door een meer fysiologische model voor het bestuderen van cel-ECM interacties op verzachtende en verstijving dynamische biomaterialen. In vorige studies analyseerden we de effecten van dynamische substraten op ...

Ons laboratorium heeft DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels, een dynamisch hydrogel systeem ontwikkeld om de effecten van modulerende weefsels stijfheid op celfunctie beter te begrijpen. Hier bieden we schema&#39;s, beschrijvingen en protocollen om deze hydrogels bereiden.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Mechanobiology is an emerging scientific area that addresses the critical role of physical cues in directing cell morphology and function. For example, ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van DNA-gecrosslinkte polyacrylamide-hydrogels die kunnen verstijven of verzachten door het pipetteren van enkelstrengs DNA's in het kweekmedium nadat de cellen op de gel zijn geplaatst. Dit wordt bereikt door eerst gelyofiliseerde SA one, SA two, L two, R two en controle-enkelstrengs DNA's opnieuw op te lossen in buffer en de SA one- en SA two-oplossingen afzonderlijk te polymeriseren tot een polyacrylamide-backbone. De tweede stap is het mengen van de gepolymeriseerde SA one- en SA two-oplossingen met de L two-oplossing om de DNA-gel te vormen.Vervolgens wordt de DNA-geloplossing met optische lijm geïmmobiliseerd op glazen dekglasjes. De laatste stap is het functionaliseren van de gels door ze te behandelen met sul sampa en daarna met PDL. Tot slot worden cellen op de DNA-gels geplaatst en wordt de elasticiteit van de gel gemoduleerd door toevoeging van R twee L twee of controle-enkelstrengs DNA om de gel respectievelijk te verzachten, te verstevigen of de elasticiteit van de gel ongewijzigd te laten.De resultaten van deze experimenten tonen aan dat de dynamische aard van het onderliggende substraat het celgedrag stuurt. Het voordeel van het gebruik van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals CRO's, lingo of ball-hydrogels, is dat DNA-gels geen stimulus zoals UV nodig hebben om hun elasticiteit te moduleren. In plaats daarvan worden DNA-gels respectievelijk verstevigd en verzacht via de diffusie van enkelstrengs DNA L twee of R twee door de gel. Centrifugeer eerst gelyofiliseerd enkelstrengs DNA SA één bij 2000 GS gedurende 15 seconden om ervoor te zorgen dat al het enkelstrengs DNA zich onderin de buis bevindt.Bereid na centrifugatie een 3 mM SA one-oplossing door 107 µL van een 1x tris, EDTA- of TE-buffer aan de buis toe te voegen. Verwarm de SA one NTE-buffer bij 70 °C gedurende vijf minuten of totdat het pellet met enkelstrengs DNA volledig is opgelost. Bereid vervolgens de gepolymeriseerde SA one-oplossing door 45 µL 40% acrylamide en 18 µL 10x tribo, EDTA- of TBE-buffer toe te voegen en centrifugeer dit mengsel om de menging te vergemakkelijken.Plaats een P 200 tip, sluit deze aan op een stikstofgasbron in de oplossing en laat langzaam stikstofgas gedurende twee tot drie minuten door de oplossing stromen. Centrifugeer het monster vervolgens 15 seconden bij 2000 Gs om de oplossing te verzamelen. Voeg na voltooiing 4,5 µL van 2% ammoniumpersulfaat of APS toe aan het monster om de gelpolymerisatie te initiëren en keer de buis meerdere keren om om te mengen. Voeg, na het centrifugeren van het monster om de oplossing te verzamelen voor een homogene polymerisatie, 4,5 µL van 20% tetraethylmethyleendiamine of TEMED toe aan het monster om de polymerisatie te katalyseren. Zodra het monster is gemengd en gecentrifugeerd, wordt de oplossing gedurende drie tot vijf minuten ontgast met stikstofgas om de polymerisatie te voltooien en niet-reactieve monomeren te minimaliseren.Incubeer de oplossing vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur om de polymerisatie te voltooien en de gepolymeriseerde SA one-oplossing te verkrijgen. Herhaal de vorige stappen met gelyofiliseerd SA two enkelstrengs DNA door respectievelijk 45 18 4 0,5 en 4,5 µL acrylamide T-B-E-A-P-S en teed toe te voegen aan 108 µL van de SA two-oplossing. Om de L two R two- en controle-oplossingen te bereiden, centrifugeert u het gelyofiliseerde enkelstrengs DNA en voegt u de volgende hoeveelheden TE-buffer toe aan het overeenkomstige gelyofiliseerde enkelstrengs DNA zoals eerder beschreven; verhit de oplossing totdat deze is opgelost voor de gelloplossing.Verwarm de gepolymeriseerde oplossingen SA één en SA twee bij 70 °C gedurende ongeveer één minuut, totdat de viscositeit van de oplossing is afgenomen. Voeg 10 µL of 10 delen van de gepolymeriseerde SA één-oplossing toe aan 10 µL of 10 delen van de gepolymeriseerde SA twee-oplossing.Meng vervolgens de gepolymeriseerde oplossingen SA één en SA twee door elkaar via afwisselende verhitting gedurende 15 seconden bij 70 °C en roeren gedurende 15 seconden met een pipetpunt, voor een totale duur van één minuut. Meng vervolgens zes µL of zes delen van de 100%L twee-oplossing om een 100%gel te vormen. Zodra het monster zoals eerder beschreven is gemengd, wordt de 100%gel in een Petrischaal van 60 mm gepipetteerd en wordt de gel gedurende één uur verhit bij de optimale annealing-temperatuur.Laat vervolgens de DNA-crosslinks verder re-hybridiseren door de gels vier uur bij kamertemperatuur te incuberen. Bedek de gel na een nachtelijke incubatie bij kamertemperatuur met PBS bevattend calcium en magnesium, verwijder de resterende buffer uit de Petrischaal en plaats de gel in een microcentrifugebuis. Verhit op dit punt de 100% gel bij 70 °C gedurende ongeveer 30 seconden of totdat de gel minder viskeus is.Plaats voor het pipetteren glazen dekglasjes op een warmteblok van 70 °C en laat deze één tot twee minuten opwarmen. Voeg een druppel optische lijm toe aan elk glazen dekglasje. Voeg vervolgens 20 µL van de 100% gel toe aan elk glazen dekglasje en laat de gel smelten en zich over de glasjes verspreiden.Verwijder elk glas met gel uit het warmteblok en plaats deze in een weefselkweekschaal met 24 putjes. Stel de gels 15 minuten lang bloot aan UV-licht van 365 nanometer. Nadat de gel één uur is verwarmd bij de optimale anale temperatuur en de DNA-crosslinks vier uur de tijd hebben gekregen om opnieuw te hybridiseren, wordt er PBS aan toegevoegd.Incubeer de gels vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Verwijder na incubatie de buffer uit de putjes met een pipet, waarbij u er zorg voor draagt dat de gel niet wordt geaspireerd. Voeg daarna sulfa sampa toe om elke gel te bedekken.Nadat de gels 15 minuten zijn blootgesteld aan 365 nanometer UV-licht, wordt de sulfa sampa verwijderd. Spoel de gels eenmaal met PBS om het overtollige sulfa sampa te verwijderen na het herhalen van de vorige stappen, en incubeer de gels gedurende de nacht bij vier graden Celsius in ongeveer 300 µL van 0,2 mg/mL poly-L-lysine. Was de gels na afloop tweemaal gedurende vijf minuten met PBS om overtollig polylysine te verwijderen en voeg het medium toe. Nadat de gels 30 minuten in het medium zijn geïncubeerd, wordt het medium onmiddellijk verwijderd voordat de cellen worden uitgeplaat voor celkweek en beeldvorming.Fibroblasten die groeiden op stijvende gels vertoonden geen veranderingen in de aspectratio, maar vertoonden een groter projectieoppervlak dan fibroblasten die groeiden op 100%gels. Fibroblasten die groeiden op 100%gels hadden een kleiner projectieoppervlak en een grotere aspectratio dan fibroblasten die groeiden op 80%gels. Deze resultaten geven aan dat het gedrag van fibroblasten afhankelijk is van de dynamische aard van de micro-omgeving.Neuronen die waren gekweekt op verzachtende gels vertoonden geen verschillen in het aantal primaire dendrieten of de axonlengte, maar vertoonden kortere primaire dendrieten dan neuronen die waren gekweekt op 50%gels. Net als in fibroblaststudies waren de neurofenotypes op statische gels verschillend van de neurofenotypes op dynamische gels. Neuronen die waren gekweekt op 50%gels hadden minder primaire dendrieten en langere axonen dan neuronen die waren gekweekt op 100%gels.Bij het uitvoeren van deze procedure is het uiterst belangrijk om de viskeuze gel nauwkeurig te pipetteren, aangezien de concentraties cruciaal zijn om het knappen van de gel te voorkomen; nauwkeurig pipetteren kan meerdere pogingen vereisen, en we bieden verschillende andere opties aan in het discussiegedeelte van dit protocol.

preparation-of-dna-crosslinked-polyacrylamide-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We presenteren protocollen voor de 3-dimensionale (3D) het inkapselen van de cellen binnen synthetische hydrogels. De inkapseling procedure is beschreven voor de twee meest gebruikte methodes van verknoping (michael-type naast en licht geïnitieerde vrije radicalen mechanismen), evenals een aantal technieken voor het beoordelen van ingekapselde cel gedrag.

Cellulaire Encapsulation in 3D Hydrogelen voor Tissue Engineering

Het effect van substrata stijfheid op cellulaire functie kan worden...

Het bestuderen van de effecten van Matrix stijfheid op de cellulaire functie gebruik Acrylamide-based Hydrogelen

In deze video, tonen we de experimentele technieken die gebruikt worden om compliant, extracellulaire matrix (ECM) gecoate substraten geschikt voor celcultuur fabriceren, en die vatbaar zijn voor trekkracht microscopie en het observeren van de gevolgen van ECM stijfheid op cel gedrag.

Voorbereiding van de Klacht Matrices voor het kwantificeren van Cellular Contractie

We presenteren een nieuw polyacrylamide hydrogel, genaamd hydroxy-PAAM, die een directe binding van ECM eiwitten mogelijk maakt met minimale kosten of deskundigheid. De combinatie van hydroxy-PAAM hydrogels met microcontactprinten vergemakkelijkt onafhankelijke controle van de vele signalen van de natuurlijke cel micro-omgeving voor het bestuderen van cellulaire mechanostransduction.

Voorbereiding van Hydroxy-PAAM Hydrogelen voor Ontkoppeling van de Effecten van Mechanotransductie Cues

Mechanische stijfheid in de tumor micro-omgeving speelt een cruciale rol in het besturen van kwaadaardige gedrag door het verhogen van invadopodia activiteit en actomyosine contractiliteit. Met polyacrylamidegels (PTA) kunnen invadopodia en trekkracht assays worden gebruikt om de invasieve en contractiele eigenschappen van kankercellen in reactie op stijfheid matrix.

Polyacrylamidegelen voor Invadopodia en Traction Force Testen op kankercellen

Hier wordt een methode beschreven die snelle, efficiënte en goedkope bereiding van polyacrylamide gels in een multiwell plate formaat mogelijk maakt. De methode vereist geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden overgenomen door elk onderzoekslaboratorium. Het zou bijzonder nuttig zijn in onderzoek gericht op het begrijpen van stijfheidsafhankelijke celreacties.

Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen

Celdifferentiatie wordt gereguleerd door een groot aantal micro-omgeving factoren, met inbegrip van zowel matrix samenstelling en de ondergrond eigenschappen. We beschrijven hier een techniek gebruikmaking cel microarrays in samenhang met trekkracht microscopie zowel celdifferentiatie en biomechanische cel- substraatinteracties als functie van de micro-omgeving context evalueren.

Een High-throughput Cell Microarray Platform voor Correlatieve Analyse van de Cel Differentiatie en trekkrachten

Dit protocol beschrijft de karakterisatie van de polymerase van DNA synthese van gemodificeerd DNA door middel van observatie van wijzigingen in het nabij-infraroodspectrum fluorescently geëtiketteerde DNA met behulp van de Elektroforese van het gel en gel beeldvorming. Acrylamide gels worden gebruikt voor hoge resolutie beeldvorming van de scheiding van korte nucleic zuren, die op verschillende tarieven afhankelijk van grootte migreren.

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden.

Horizontale Snijd Voorbereiding van de Retina

Deze video toont een procedure voor het genereren van neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale muis cortex. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming en een platform te bieden voor de neuronale ontwikkeling van transgene dieren die een postnatale dodelijke genmutatie dragen bestuderen.

De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

Leer de bereiding van DNA-verknoopte polyacrylamide hydrogels voor het bestuderen van weefselstijfheid en celfunctie. Deze methode maakt dynamische modulatie van gel-eigenschappen mogelijk zonder UV-stimulatie.

Bereiding van DNA verknoopt polyacrylamide hydrogels

Meer video's verkennen