Imaging Plasma Membraan Vervormingen Met pTIRFM

Het doel van deze procedure is om te laten zien hoe polarisatie-gebaseerde totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie wordt geïmplementeerd voor de studie van membraanremodellering tijdens gereguleerde exocytose. Dit wordt bereikt door eerst te zorgen dat optische elementen, namelijk de kwartgolfplaat en polarisatiekubussen, correct zijn gepositioneerd om discrete p en s excitatiepolarisaties te genereren. De tweede stap is om te verifiëren dat de p en s stralen colineair door de optische as van de microscoop passeren en hetzelfde deel van het beeldveld verlichten wanneer in totale interne reflectie fluorescentie of TIRF.

Vervolgens worden de cellen die geïmaged moeten worden gekleurd met de carbo cyanine die, die D en gestimuleerd met een depolariserende stimulus om exocytose te activeren. De laatste stap is het vastleggen van beelden van versmeltende dichte kernvesikels tijdens TIRF. Uiteindelijk wordt P-T-I-R-F gebruikt om beelden in realtime te verkrijgen om de membraantopologische veranderingen die het gevolg zijn van chromocel exocytose te monitoren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals pyrometrie en membraancapaciteit, is dat ptro F rechtstreeks een membraankromming en bij uitbreiding een fusiepoortdilatatie rapporteert. Het steilste deel van de leercurve met deze techniek is eerst leren om de p en s excitatiepolarisaties uit te lijnen, zodat ze colineair door de optische as van de microscoop reizen en hetzelfde deel van het beeldveld verlichten. Een tweede probleem dat vaak voorkomt, betreft het kleuren van cellen, namelijk hoe lang cellen moeten worden blootgesteld aan dd en wat een goed gekleurde cel is versus een slecht gekleurde cel.

Het demonstreren van de procedure zal worden uitgevoerd door TA vierkant rij, een afgestudeerde student van ons laboratorium. Om te beginnen, zet alle microscoopcomponenten, lasers en computers aan. Richt een straal van de 488 nanometer laser naar het achterste brandpunt van de lens met een numerieke apertuur van 1,49. Als de laserstraal op het achterste brandpunt is gericht, zal deze gecollimeerd en als een kleine, goed gedefinieerde stip op het plafond direct boven het objectief verschijnen.

Vervolgens wordt de X-galvanometerspiegel aangepast zodat de laserstraal van het objectief wordt verplaatst en met steeds steilere hoeken ten opzichte van de normaal van het objectief uittreedt. Controleer vervolgens of totale interne reflectie of TIR is bereikt. Voeg 10 microliters fluorescente microsferen toe aan één milliliter fysiologische zoutoplossing en een glazen bodemschaal. Alleen de fluorescentie van microsferen op de bodem van de schaal, dichtst bij de TIR-interface, zou gedetecteerd moeten worden.

Het detecteren van drijvende microsferen geeft aan dat de hoek tussen het invallende licht en de normaal van het objectief onvoldoende is. Voor polarisatie-gebaseerde beeldvorming, gebruik de uitgelijnde 488 nanometer straal als gids en pas de positie van de ruwe 561 nanometer laserstraal aan zodat deze langs een identieke optische baan reist. De 561 nanometer laser zal worden gebruikt voor de beeldvorming van de carbo cyanine kleurstof.

Een divergerende lens en spiegels bevinden zich stroomafwaarts van de 561 nanometer laser. Gebruik de afstelknoppen op de spiegels om de straal aan te passen zodat deze is uitgelijnd met de 488 nanometer straal en de stip scherp staat op het plafond. Wanneer de galvanometerspiegels in de nulpositie zijn, reflecteert een polarisatiekubus de verticale component van het elektrische veld en passeert de horizontale component.

Het wordt stroomafwaarts van de elliptisch gepolariseerde straal op een kleine vertaalbare schaal geplaatst. Om de daaropvolgende uitlijning van polarisatie te vergemakkelijken, gebruiken de straalbanen een tweede polarisatiekubus en spiegels om de stralen te hercombineren. Er wordt een sluiter geplaatst tussen de eerste polarisatiekubus en de verticale componentenspiegel.

Een tweede sluiter wordt geplaatst tussen de horizontale componentenspiegel en de tweede polarisatiekubus. Deze sluiters worden bediend door de beeldvormingssoftware, waardoor de gebruiker snel kan selecteren tussen straalpolarisaties. Gebruik een polarisatiefilter om de elektrische veldoriëntatie in elke straalbaan te verifiëren.

Een polarisatiefilter laat alleen transmissie toe in lijn met de as van het filter. Controleer of de verticale en horizontale componenten van de laserstraal met elkaar en met de 488 nanometer straal zijn uitgelijnd, en pas zo nodig aan. De drie stralen moeten allemaal worden gefocust op het achterste brandpunt en uittreeden uit het objectief naar dezelfde stip op het plafond.

Deze stip kan worden gemarkeerd met een X om toekomstige uitlijning te vergemakkelijken. Plaats vervolgens een druppel immersieolie op het objectief. Plaats de schaal met fluorescente microsferen.

Op het objectief, gaat u TIR in door de X-galvanometerspiegel te verplaatsen in de spiegelverplaatsingssoftware in TIR. De verticale component van de straal is de S-polarisatie en de horizontale component van de straal is nu de P-polarisatie centrum, een kwartgolfplaat of qw in de straalbaan. Direct stroomafwaarts van de laseropening bekijk elk gepolariseerd evanescent veld met een staaf domineer monster, dat naar verwachting willekeurig georiënteerd zal zijn.

Draai de qw-plaat om de gemiddelde pixelintensiteiten te matchen. Isolateer gezonde chromin cellen van de kat bijnierschors zoals beschreven in het tekstprotocol. Tel cellen met behulp van een hemo cytometer en bereid ze voor op transfectie. Transfecteer cellen met DNA dat het eiwit van belang codeert volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De instellingen die de beste balans bieden tussen transfectie-efficiëntie en celoverlevingspercentage.

Voor deze voorbereiding van boviene chromin cellen zijn 1, 100 volt, 40 milliseconden en één puls. Na transfectie worden cellen voorzichtig geplaatst op poly de lycine en collageen behandelde schalen in één milliliter verwarmd electro parading media. Plaats de schalen in een incubator van 37 graden Celsius. Voeg één milliliter van twee keer antibioticummedia toe aan elke schaal. Na zes uur, verander de media naar normale media de volgende