Name: Extracellulaire Wire Tetrode Opname in Brain vrijlopende Insecten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T16:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Leer extracellulaire tetrode-opname in de hersenen van vrijlopende kakkerlakken. Deze methode synchroniseert neurale activiteit met videogedrag voor gedetailleerde analyse van insectenhersenfunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken Nick Kathman voor suggesties en helpen bij de voorbereiding van het manuscript. Deze techniek werd ontwikkeld in samenwerking met het werk ondersteund door de AFOSR onder subsidie ​​FA9550-10-1-0054 en de National Science Foundation onder Grant No IOS-1120305 om RER.

1. Voorbereiding van Tetrode Draden <ol><li> Trek een zeer dunne nichrome draad (12 micrometer diameter, PAC coating) van ongeveer 1,1 m lengte. Bevestig een tape tag aan elk uiteinde. Hang de draad over een horizontale draadstang zodanig dat de beide uiteinden op dezelfde hoogte bij de stationaire. </li><li> Herhaal stap 1.1 voor een tweede draad, waardoor twee uiteinden voor een totaal van 4, en leg deze naast de eerste draad (ongeveer 1 cm ertussen). </li><li> Plak de vier uiteinden samen met een tape-tag en bevestig het label om een ​​gemotoriseerd roterend opwikkelinrichting. Dit apparaat kan worden gemaakt van een goedkope gelijkstroommotor. </li><li> Wikkel de tetrode in een richting voor 2 min (60 min) en ontspannen in de tegenovergestelde richting gedurende 30 sec. </li><li> Gebruik een warmte kanon om de draden samensmelten. Raak de draden niet aan met het pistool. Gebruik drie op en neer gaat van wisselende richtingen, met elke pas duurt ongeveer 10 sec. </li><li> Snijd de bovenkant en de onderkant van de wond draden. De vier draden zijn getwist eend versmolten aan een uiteinde, maar gescheiden van de andere. </li><li> Voeg de ondersteunende buis. Snijd een 30 cm lengte van polyethyleen buis (diameter: binnen 0,28 mm, buiten 0,61 mm). Rijg de Tetrode heel langzaam en voorzichtig in de ondersteunende buis zodanig dat het niet knikken. </li><li> Zodra het gesmolten einde verschijnt er aan de andere kant, haal deze door, zodat er een gelijke lengte van de draad aan beide uiteinden van de geleidebuis. </li><li> Pak de afzonderlijke einde van elke draad met een tang. Met de basis van de vlam van een gasbrander voorzichtig verbranden de isolatie af van de laatste 2 of 3 mm van elke draad. Verwarm de draad tot het gloeit, maar niet krullen. </li><li> Sluit de Tetrode met een man-vrouw IC socket adapter die uw opname apparaat past. Zet de deinsulated einde van elke draad in een ander stopcontact van de adapter met een pincet. Stabiliseren van de draad in het stopcontact met een kleine koperen pin. Gebruik een fijne punt soldeerbout en vul de aansluiting met het gesmolten soldeer. Wees voorzichtig om geen contactde fragiele draad met de soldeerbout. </li><li> Controleer de impedantie van elke draad en de impedantie tussen elk paar draden. <ol><li> Plaats de gesmolten, gedraaide uiteinde in een bak met zout en sluit een koperdraad dirigent van de zoutoplossing om de meter ohm. </li><li> Sluit het andere uiteinde van de meter om de steekbout met de draad. De impedantie van elke draad moet onder 3 MQ. </li><li> Als de bovenstaande waarden niet worden bereikt, probeer het nog eens soldeerverbindingen. </li><li> Verwijder de draden van de zout, spoel ze schoon met water, en test de inter draad impedantie voor elke koppeling (n = 6). De inter impedantie dient boven 5 MQ. </li><li> Als de bovenstaande waarden niet worden bereikt, snijd een kleine hoeveelheid van de tip uit bij de gesmolten einde en opnieuw te testen. </li><li> Gooi alle draad set die niet voldoet aan zowel de impedantie eisen voor alle van de draden. </li></ol></li><li> Zet de Tetrode. <ol><li> Vouw een klein rechthoekig kartonnen doosje sligHTLV groter dan de socket adapter. </li><li> Breng de adapter in de doos met de mannelijke kant op de bodem. Doordringen in de doos zodanig dat alle pinnen van de mannelijke kant zijn buiten de box, terwijl de rest van de adapter in de doos. </li><li> Tape de hoeken van de doos aan de buitenkant. Gebruik kleine stukjes dubbelzijdig plakband aan de binnenkant van de doos aan een persoon draadstrengen stabiliseren. De draad moet worden gefuseerd zodra deze uit de doos. </li><li> Meng fast set 2 componenten epoxy en giet het in het vakje voor de adapter en alle draden vast te zetten. </li><li> Bevestig het nabije einde van de geleiding slang aan een kant van de doos met tandartsen maar laat de buis te openen, zodat de tetrode kan worden getrokken door vrij aan beide uiteinden. </li></ol></li><li> Slijp de Tetrode. <ol><li> Vóór elk experiment, snijd het topje van de Tetrode met een scherp scalpel, geen schaar. Dit voorkomt het breken en splaying van de draadeinden, terwijl het verstrekken van een schone vlakke rand voor de volgende stap. <ol&gt; <li> Gebruik een klein draaiend gereedschap verticaal gemonteerd met medium en fijne korrel schuren schijven (deze kunnen worden gecombineerd op een platform) om de Tetrode poetsen en verwijder enkele tip isolatie. Houd de bundel in de buurt van het einde met een pincet. Kantel de draad ingesteld einde aan een hoek van 45 ° ten opzichte van de schuren schijf en zachtjes aanraken om de matige snelheid draaiende schijf voor ongeveer 1 of 2 sec elk op het medium en vervolgens de fijne korrels. Herhaal dit drie keer, axiaal roteren van de bundel 90 ° elke keer. Het is essentieel dat de richting van rotatie van de schuurschijven weg van de ondiepe hoek van de draadeinden, anders scheiding van de draden optreden. </li><li> Het gewenste resultaat verandert de bundel uiteinde van een rechte rand een puntig met kleine hoeveelheden isolatie uit het uiteinde van elke draad. Controleer het punt met behulp van een dissectie microscoop voordat plating de Tetrode. Als een rafelen optreedt op het puntje, recut en repolish. </li><li> Als impedantie testen tijdens de subsequent plating stap toont extreem lage inter draad waarden (minder dan 4 MQ), geeft teveel materiaal verwijderd tijdens de polijststap. Recut en repolish de Tetrode. </li></ol></li><li> Plate de Tetrode. Plaats de punt van de tetrode tot een verzadigde kopersulfaatoplossing (85 ml water, 5 ml zwavelzuur, 50 g kopersulfaat). Plaat elke draad met een stroom van 2,5 uA met een stimulus isolator. Spuit de stroom voor 1 sec, pauze voor 1 sec en herhaal dit proces 4x. </li><li> Controleer de impedantie van elke draad en interimpedance van elk paar draden. De impedantie van elke draad moet tussen 0.5-1 MQ en de inter impedantie moet hoger zijn dan 4 MQ. </li><li> Monteer de adapter op de headstage van een multichannel opname systeem. </li><li> Bevestig een gebogen insect pin naar een micromanipulator. Bevestig het uiteinde van de Tetrode om het insect pin met tandartsen </li></ol></li></ol> 2. Bereiding van dieren <ol><li> Verdoven van dekakkerlak met ijs. </li><li> Na de kakkerlak niet meer beweegt, bedwingen de kakkerlak verticaal tegen een vlakke kurk oppervlak met grote zadel pinnen die het insect straddle maar een deel van zijn lichaam niet binnendringen. </li><li> Breng het preparaat in een plastic container en plaats ijs rond het dier bloedstroom en lichaamsbewegingen minimaliseren. </li><li> Plaats een plastic kraag in de nek naar het hoofd ondersteunen en plaats tandartsen rond het hoofd te stabiliseren. </li><li> Snijd een klein venster tussen de ocelli met een scheermesje en de nagelriem verwijderen uit het hoofd. </li><li> Verwijder bindweefsel en vet met een tang om de hersenen bloot. </li><li> Plaats enkele kakkerlak zoutoplossing in de kop capsule naar het hersenweefsel te dekken. </li><li> Naar de hersenen desheath, met een fijne tang om voorzichtig pak de mantel op de top van de hersenen en een andere fijne tang om de mantel uit elkaar scheuren in de draad geïmplanteerde gebied. </li><li> Open een klein gaatje in het hoofd capsule juist voor de hersenen with een insect pin. Plaats een vlecht van drie grotere diameters (56 micrometer) geïsoleerde koperen draden in het gat om te dienen als referentie / aardelektrode. </li><li> Laat de tip van de Tetrode aan de hersenen oppervlak met de micromanipulator en plaats het in de buurt van de hersenen regio van belang. </li><li> Plaats voorzichtig twee kleine stukjes dunne acetaatblad (2 mm x 1 mm), iets groter dan de kiespijn capsule, anterieure en posterieure de tetrode. </li><li> Zet het opnamesysteem. </li><li> Langzaam de Tetrode 150-250 urn onder de hersenen oppervlak, afhankelijk van de opnamekwaliteit. </li><li> Schakel het opnamesysteem. </li><li> Verplaats de twee stukken van acetaat vel zo dicht mogelijk bij de Tetrode mogelijk zonder aan te raken (figuur 1A). </li><li> Verhit een kleine spatel of afgeplatte injectienaald en zet het in tandtechnische was zodanig dat er vloeibare was aan het uiteinde van de spatel. Raak voorzichtig het uiteinde van elk stuk van acetaat vel uit deTetrode met de spatel zodat vloeibare wax kan stromen op elk stuk en dicht de kloof tussen haar en het hoofd cuticula. </li><li> Herhaal stap 2.16. Laat een kleine hoeveelheid vloeibare was op de acetaat vel per keer. Start het proces ver weg van de Tetrode en beweeg langzaam naar toe. Uiteindelijk de Tetrode zal worden verankerd door tandartsen. Voorkom dat heet kaarsvet in de holte en op de hersenen. </li><li> Gebruik dezelfde methode als de stappen 2.16 en 2.17 van de referentie / massa-elektrode met was te verankeren. </li><li> Verwarm de was die de tetrode hecht aan de micromanipulator om de tetrode weghaalt. </li><li> Loop de Tetrode in de tandheelkundige wax op het hoofd van een trekontlasting (Figuur 1B) te verstrekken. </li><li> Bedek de trekontlasting lus met tandartsen (figuur 1C). </li><li> Verwijder voorzichtig de beperkingen en de overdracht van de voorbereiding op een petrischaal. Beperken de voorbereiding dorsale zijde naar boven met grote zadel pinnen. </li><li> Hechteneen stang aan de pronotum met een lijmpistool. Dit is een houten stok die zich uitstrekt van het pronotum over de buik. </li><li> Bevestig het uiteinde van de Tetrode buis met het achterste uiteinde van de staaf met tandartsen. </li><li> Veranker de Tetrode en het referentie / aardelektrode aan het voorste uiteinde van de staaf met tandartsen. </li><li> Trek de tetrode uit het stopcontact uiteinde van de slang zoveel mogelijk, maar niet ruk aan het, om de kans dat het dier het deel van de tetrode beschadigen buiten de buis (figuur 1D) elimineren. </li><li> Verwijder alle beperkingen. Bevestig de referentie / aardelektrode naar de Tetrode buis met tandartsen. </li><li> Wacht minstens 60 minuten om het dier te herstellen van de anesthesie ijs voordat experiment. </li></ol> 3. Experimentele Procedures <ol><li> Sluit een PC met zowel het opnamesysteem en een LED-licht met behulp van een USB naar seriële poort kabel. </li><li> Start neurale opnames. </li><li>Start video-opnames met 20 frames per seconde voor het lopen experimenten met het beeld Motmot acquisitie pakket 16 of 120 fps voor het beklimmen van experimenten met behulp van een high speed camera. </li><li> Plaats de kakkerlak in een 40 cm x 40 cm Plexiglas arena te wandelen experimenten of een 58 cm lang, 5 cm breed en 5 cm hoog arena voor het beklimmen van experimenten. The walking arena heeft een transparante barrière uitstrekt van het midden van de rechter muur naar het midden van de arena, waarboven de headstage zich bevindt. De barrière wordt gebruikt om te voorkomen dat de dieren lopen in gebieden waar de camera uitzicht is geblokkeerd door de headstage. De klimfaciliteit heeft een acryl blok (ofwel 1,2 cm of 1,8 cm en 5 cm breed) of een plank bij een vergelijkbare lengte in het midden. </li><li> Genereer een TTL puls van de pc met behulp van een aangepaste MATLAB commando. (S = seriële (&#39;COM4&#39;); fopen (s); s.RequestToSend = &#39;uit&#39; / s.RequestToSend = &#39;op&#39; /; fclose (s), verwijderen (s) ;). De TTL puls genereert een keeraanstampen voor het opnamesysteem en ofwel wordt in-of uitgeschakeld de LED-licht. </li><li> Laat de kakkerlak naar de arena te verkennen tot het niet verder bewegen voor meer dan 30 seconden te lopen experimenten. Laat de kakkerlak om ofwel klimmen over het blok / plank of tunnel door de plank voor het beklimmen van experimenten. </li><li> Stop video-opnames. </li><li> Stop neurale opnames. </li><li> Noteer het tijdstempel gegenereerd door de TTL puls. </li><li> Verwijder de kakkerlak uit de arena en wacht minstens 3 minuten. </li><li> Herhaal stap 3,2-3,10 voor de volgende proef. </li><li> Zodra alle opnames zijn voltooid, geeft 5 seconden van 5 uA DC stroom door een van de uiteinden draad (anode) en de referentie-elektrode (kathode) koper storten de hersenen op de draad tip. </li></ol> 4. Offline Analyse <ol><li> Synchroniseer video en neurale gegevens door het koppelen van het frame waar de LED-verlichting wordt ingeschakeld en de tijdstempel geregistreerd door het systeem opdat moment. </li><li> Mark draad tip locaties. Gebruik Timms intensivering procedures neer te slaan en observeer de koper in 12 micrometer seriecoupes 17. Prominente deposito moet zichtbaar zijn in 3-8 aangrenzende secties (ongeveer 18-48% van de lengte van de dorsale ventrale vlak van het gebied dat we opnemen) (Figuur 2). </li><li> Correleren specifieke elektrische impulsen om de activiteit van enige neuronen. Volg spike uitzoeken in detail vastgelegd elders 10,14,18 procedures. Gebruik het programma KlustaKwik (versie 1.5, auteur K. Harris, Rutgers University) om de eerste, geautomatiseerde clustering genereren. Importeren ze in het programma MClust (versie 3.5, auteurs AD Redish et al.., University of Minnesota) voor verdere verfijning en analyse (Figuur 3). </li><li> Volg de bewegingen van de kakkerlak. Voor het lopen experimenten, haal de positie van de kakkerlak (visuele) zwaartepunt en zijn lichaam oriëntatie in elk frame van de video-opnamen met behulp van de Caltech Multiple Fly Tracker (versie 0.1.5.6; http://ctrax.sourceforge.net/) en de bijbehorende FixErrors toolbox voor MATLAB 19. Voor het beklimmen van experimenten, haal de positie van het blok en het hoofd van de kakkerlak en pronotum in elk frame van de video met behulp van motion analyse software pakket. </li></ol>

<ol><li>Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+complex+and+the+genetic+dissection+of+locomotor+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The central complex and the genetic dissection of locomotor behaviour.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 633-638 (2002).</li>
<li>Pick, S., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goal-driven+behavioral+adaptations+in+gap-climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Goal-driven behavioral adaptations in gap-climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 15, 1473-1478 (2005).</li>
<li>Triphan, T., Poeck, B., Neuser, K., Strauss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+targeting+of+motor+actions+in+climbing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual targeting of motor actions in climbing Drosophila.</a> Curr. Biol. 20, 663-668 (2010).</li>
<li>Heinze, S., Gotthardt, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+polarized+light+information+in+the+central+complex+of+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuorosci%22%5BJournal%5D)">Transformation of polarized light information in the central complex of the locust.</a> J. Neuorosci. 29, 11783-11793 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maplike+representation+of+celestial+E-vector+orientations+in+the+brain+of+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maplike representation of celestial E-vector orientations in the brain of an insect.</a> Science. 315, 995-997 (2007).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+of+the+central+complex+of+the+desert+locust%3A+Intrinsic+and+columnar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture of the central complex of the desert locust: Intrinsic and columnar neurons.</a> J. Comp. Neurol. 511, 454-478 (2008).</li>
<li>Heinze, S., Homberg, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+input+to+the+output%3A+new+sets+of+neurons+complement+the+polarization+vision+network+in+the+locust+central+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Linking the input to the output: new sets of neurons complement the polarization vision network in the locust central complex.</a> J. Neurosci. 29, 4911-4921 (2009).</li>
<li>Heinze, S., Reppert, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun+compass+integration+of+skylight+cues+in+migratory+monarch+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sun compass integration of skylight cues in migratory monarch butterflies.</a> Neuron. 69, 345-358 (2011).</li>
<li>Brill, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+via+a+dual+olfactory+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing via a dual olfactory pathway in the honeybee.</a> J Neurosci. 33, 2443-2456 (2013).</li>
<li>Guo, P., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+cockroach+brain+is+linked+to+turning+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the cockroach brain is linked to turning behaviors.</a> J. Exp. Biol. 216, 992-1002 (2013).</li>
<li>Ritzmann, R. E., Ridgel, A. L., Pollack, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-unit+recording+of+antennal+mechanosensitive+units+in+the+central+complex+of+the+cockroach%2C+Blaberus+discoidalis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%22%5BJournal%5D)">Multi-unit recording of antennal mechanosensitive units in the central complex of the cockroach, Blaberus discoidalis.</a> J. Comp. Physiol. A. 194, 341-360 (2008).</li>
<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neuronal ensembles.</a> Nature Neurosci. 7.5, 446-445 (2004).</li>
<li>Huston, S. J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+sensorimotor+integration+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Studying sensorimotor integration in insects.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 21, 527-534 (2011).</li>
<li>Bender, J. A., Pollack, A. J., Ritzmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+the+central+complex+of+the+insect+brain+is+linked+to+locomotor+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural activity in the central complex of the insect brain is linked to locomotor changes.</a> Curr. Biol. 20, 921-926 (2010).</li>
<li>Harrison, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+Neural%2FEMG+telemetry+systems+for+small+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%22%5BJournal%5D)">Wireless Neural/EMG telemetry systems for small freely moving animals.</a> IEEE. 5, 103-111 (2011).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol. Med. 4, 5(2009).</li>
<li>Strausfeld, N. J., Miller, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTyrer%2C+NM+%22Neuroanatomical+Techniques.+Insect+Nervous+System%22">Neuroanatomical Techniques. Insect Nervous System</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Daly, K., Wright, G., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+features+of+odorants+systematically+influence+slow+temporal+responses+across+clusters+of+coordinated+antennal+lobe+units+in+the+moth%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophsyiol%22%5BJournal%5D)">Molecular features of odorants systematically influence slow temporal responses across clusters of coordinated antennal lobe units in the moth, Manduca sexta.</a> J. Neurophsyiol. 92, 236-254 (2004).</li>
<li>Branson, K., Robie, A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6, 451-457 (2009).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Terwijl de vorige elektrofysiologische studies over de CC of andere regio&#39;s van het insect hersenen ons heeft verstrekt inzicht in de centrale controle van het gedrag, de meeste van hen werden uitgevoerd in zowel ingetogen bereidingen 9,11 of tethered degenen 10,14. Dientengevolge, het dier zintuiglijke ervaring en fysiologische toestand kan verschillen van die in een natuurlijke omgeving. Bovendien is de gedragstaken dat het dier kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak onder deze omstandighede...

Dit artikel beschrijft een succesvol systeem voor het opnemen van neuronen in het centrale complex (CC) van de kakkerlak, Blaberus discoidalis, als het insect loopt in een arena en deals met voorwerpen die ervoor zorgen dat het om te draaien, tunnel onder of klimmen over obstakels. De draden kunnen ook worden aangesloten op een stimulator activiteit te roepen in de omliggende neuropil met als gevolg gedragsveranderingen. In de afgelopen tien jaar veel aandacht is gericht op de rol die de verschillende gebieden van de hersenen in het controleren van gedrag van insecten. Veel van deze focus is gericht op de middellijn hersenen neuropils die gezamenlijk worden aangeduid als het centrale complex (CC). Er is vooruitgang geboekt als gevolg van grote rassen van technieken gericht vragen over de rol van de CC in gedrag. Deze technieken variëren van neurogenetische manipulaties, voornamelijk in Drosophila, gekoppeld behavimondelinge analyse 1-3, om elektrofysiologische technieken die de neurale activiteit in de CC en poging om die activiteit betrekking hebben op gedragsmatig relevante parameters te monitoren. Elektrofysiologische technieken omvatten intracellulaire opname van individuele geïdentificeerde neuronen 4-9 en extracellulaire, vaak met multi channel sondes 10,11. Deze twee technieken zijn gratis. Intracellulaire opname met scherpe elektroden of whole cell patch biedt zeer gedetailleerde gegevens over geïdentificeerde neuronen, maar is beperkt tot een of twee cellen tegelijk, vereist weinig of geen beweging, en kan worden gehandhaafd voor een relatief korte periode van tijd. Extracellulaire opnames kunnen eenvoudig worden ingesteld, hoeft terughoudendheid niet nodig, en kan worden gehandhaafd voor uren. Met multi channel tetrodes en cluster snijden, kan vrij grote populaties van neuronen tegelijkertijd 9,12 worden geanalyseerd. Terwijl de hele cel patch is met succes gebruikt in tethered insecten 13, vinden wij dat er ook behoefte aan technieken die ons toelaten om neurale activiteit op te nemen in de hersenen voor langere tijd in vrij gedragen insecten zoals zij omgaan met belemmeringen voor voorwaartse beweging. De noodzaak om op te nemen als het insect beweegt en stuitert op en neer duwde ons naar extracellulaire technieken. We hebben goed succes opname had ingehouden preparaten handel verkrijgbare 16 kanalen silicium sondes 11, maar de geringe omvang van zelfs grote kakkerlakken betekent dat de probes lichaam worden gemonteerd af. Dat, in combinatie met de gevoeligheid van de sonde tanden, die ze ongeschikt voor een gratis wandel preparaat. In twee eerdere projecten, gebruikten we bundels van fijne draden die een Tetrode soortgelijke opname eigenschappen te bereiken, maar in een meer robuuste regeling. Deze Tetrode bundels liet ons op te nemen van tethered kakkerlakken eend betrekking CC eenheid activiteit op veranderingen in te lopen en de snelheid 14 gedrag als gevolg van antennal contact met een staaf 10 draaien. Zo nuttig als deze tethered voorbereidingen zijn en zullen blijven, doen ze presenteren een aantal beperkingen. Ten eerste, het gedrag dat het insect kan uitvoeren zijn beperkt tot een vlak. Dat wil zeggen, we konden gemakkelijk veranderingen in loopsnelheid of draaien roepen, maar klimmen en tunneling acties waren niet mogelijk, in ieder geval met de typische tether regeling. Ten tweede, onze tethered voorbereidingen zijn &quot;open loop&quot;. Dat is, zij niet toestaan ​​normale voortbewegingsapparaten feedback aan het systeem. Dus, zoals de kakkerlak ingeschakeld onze tether, de visuele wereld was niet dienovereenkomstig gewijzigd. Het is mogelijk om gesloten lus tether systemen te bouwen om dit soort feedback te introduceren. Ze worden echter beperkt door de complexiteit van de programmering en hardware van de gesimuleerde visuele omgeving. Nevertheless, vonden we dat we op onze bestaande tethered opname methoden zou kunnen verbeteren door het opnemen van het dier als het vrij in een arena of track en kwam objecten als hij zou in zijn natuurlijke omgeving gelopen. Hoewel draadloze systemen voor de registratie van hersenactiviteit 15 zou ideaal zijn, de huidige systemen hebben beperkingen in het aantal opname-kanalen, de tijd van data-acquisitie, het leven en het gewicht van de batterij. Daarom hebben we gekozen om te proberen onze tethered opnamesysteem voor gebruik aan te passen in vrij bewegende preparaten. Betere draadloze systemen beschikbaar komen, kan deze techniek gemakkelijk worden aangepast aan dergelijke inrichtingen. Het systeem dat wordt beschreven in dit artikel is licht van gewicht, werkt erg goed en lijkt weinig schadelijk effect op het gedrag van de kakkerlak hebben. Met een goedkope high speed camera en cluster snijden software, kan de activiteit in individuele hersenen neuronen worden gerelateerd aan beweging. Hier beschrijven we de preparatie van de Tetrode draden en hun implantatie in de hersenen van het insect en opnametechnieken voor elektrische activiteit en beweging en hoe die gegevens kunnen elkaar worden gebracht voor verdere analyse.

<table><tbody><tr><td>Nichrome draad&nbsp;</td><td>Sandvik Heating Technology</td><td>Kanthal RO-800</td><td>Gebruik voor tetrode</td></tr><tr><td>Biomedische polyethyleen buis</td><td>A-M Systems</td><td>800700</td><td>Gebruik voor tetrode buis</td></tr><tr><td>Lynx-8</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Gebruik voor multiunit opname</td></tr><tr><td>Cheetah 32</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>Gebruik voor multiunit opname</td></tr><tr><td>Hoge snelheidscamera</td><td>Basler</td><td>A602f</td><td>Gebruik voor video-opname voor loopexperimenten</td></tr><tr><td>Hoge snelheidscamera</td><td>Casio</td><td>EX-FC150</td><td>Gebruik voor video-opname voor klimexperimenten</td></tr><tr><td>WINanalyze</td><td>Winanalyze</td><td>versie 1.4 3D</td><td>Gebruik voor videotracking&nbsp;</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>MATLAB R2012b</td><td>Gebruik voor TTL pulsgeneratie en offline data-analyse</td></tr></tbody></table>

extracellulaire wire tetrode opname in brain vrijlopende insecten

Extracellular Wire Tetrode Recording in Brain of Freely Walking Insects

Toenemende belangstelling voor de rol van de hersenactiviteit in insecten motorbesturing vereist dat we in staat zijn toezicht te houden op neurale activiteit, terwijl insecten voeren natuurlijk gedrag. We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons de activiteit opnemen van meerdere neuronen tegelijk terwijl een tethered kakkerlak gedraaid of veranderde loopsnelheid. Terwijl een grote stap vooruit, tethered voorbereidingen bieden toegang tot beperkte gedrag en vaak geen feedback processen die zich in vrij bewegende dieren. We presenteren nu een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt op te nemen van het centrale complex van vrij bewegende kakkerlakken als ze lopen in een arena en omgaan met barrières door te draaien, klimmen of tunneling. In combinatie met hoge snelheid video en cluster snijden, kunnen we nu betrekking hersenactiviteit om verschillende parameters van de beweging van vrij gedragen insecten.

We namen de neurale activiteit van 50 eenheden van de CC in 27 voorbereidingen voor wandelen experimenten. Voor 15 van deze preparaten (23 eenheden), werden klimmen experimenten ook uitgevoerd. Individuele eenheden worden benoemd op basis van voorbereiding en eenheid nummers (bijv. unit 1-2 geeft voorbereiding 1, unit 2). Momentopnamen van de video van een klimmen proef zijn weergegeven in Figuur 4. Het hele video is in aanvullende Video 1 (Het gelu...

We hebben eerder ontwikkelde een techniek voor het implanteren van Tetrode draden in de centrale complex van kakkerlak hersenen die ons in staat stelt te controleren activiteit in individuele eenheden van tethered kakkerlakken. Hier presenteren we een aangepaste versie van die techniek die ons in staat stelt om ook hersenactiviteit opnemen in vrij bewegende insecten.

Extracellulaire Wire Tetrode Opname in Brain vrijlopende Insecten

Increasing interest in the role of brain activity in insect motor control requires that we be able to monitor neural activity while insects perform ...

Het algemene doel van deze procedure is om complexe neurale activiteit in de hersenen te registreren en deze te coördineren met het via video opgenomen gedrag van vrij bewegende insecten. Dit wordt bereikt door eerst flexibele registratietetra's te vervaardigen door middel van het slijpen van extreem dunne draden, het testen en coaten van de punt, en het gebruik van materiaal om de locatie te markeren en de draad in polyethyleenbuisjes te stabiliseren. De tweede stap bestaat uit het inbrengen van de registratietetra in de hersenen, het stabiliseren hiervan met acetaat en was, en het bevestigen van een ontlastingslus aan de kop.Vervolgens wordt de neurale activiteit geregistreerd, samen met een video-opname van het locomotorisch gedrag. Synchroniseer de video met de opname via een synchronisatiepuls naar een LED en de versterker. De laatste stap is het neerslaan van koper met behulp van een continue elektrische stroom en het intensiveren van de kleuring via de Tims-methode om de registratieplaats te visualiseren.Uiteindelijk stellen extracellulaire sorteertechnieken met een hoge dichtheid voor meerdere eenheden ons in staat om neurale eenheden te identificeren, terwijl de analyse va

extracellular-wire-tetrode-recording-brain-freely-walking

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We beschrijven een methode om motorische activiteit, afgestemd op de elektrisch opgenomen tarsale contact signaal in een vastgebonden insect record, lopen op een gladde ondergrond. Dit wordt gebruikt om de neurale basis van adaptief gedrag onder verminderde invloed van de mechanische interactie tussen de benen door het substraat te bestuderen.

Het bestuderen van de neurale basis van Adaptive locomotorisch gedrag bij insecten

The video demonstrates a procedure for implanting a wireless bidirectional multichannel electrode unit into a rat brain to record and stimulate multichannel neural networks.

Implanting a Wireless Bidirectional Microelectrode System in a Rat Brain

The video demonstrates the extracellular recording of neuronal activity from the central nervous system (CNS) of Drosophila larvae. The transected CNS is positioned in a recording chamber, and the electrical activity from a descending nerve is recorded to establish the baseline firing frequency. A test agent is then introduced, and the change in firing frequency is recorded to determine the agent's excitatory or inhibitory effect.

Extracellular Recording of Electrical Activity in the Drosophila Central Nervous System

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Dit artikel beschrijft de kakkerlak buikzenuwkoord dissectie en extracellulaire opnames van de Cercal zenuw en voegwoorden. Opgeroepen reacties worden opgewekt door elektrische stimulatie van de Cercal zenuw of direct mechanische stimulatie van de cerci.

Neurale Opnemen vanaf een Intact Cockroach zenuwstelsel

Gelijktijdige extracellulaire langdurige opnames van twee verschillende hersengebieden neuropiles of twee verschillende anatomische traktaten werden opgericht in honingbijen. Deze opnamen kan de onderzoek temporele aspecten van neuronale verwerking in verschillende hersengebieden in het neuron en op het ensemble niveau in een dier gedragen.

Gelijktijdige Langdurige Recordings op Twee Neuronale Processing Fasen in Behaving Honingbijen

Deze methode zorgt voor een tastbaar, vertrouwde omgeving voor de muis te navigeren en te verkennen tijdens microscopische beeldvorming of eencellige elektrofysiologische opnames, die stevige fixatie van het hoofd van het dier nodig heeft.

Flat-gevloerd Air-opgeheven Platform: Een nieuwe methode voor het combineren Gedrag met Microscopie of Electrofysiologie op Awake vrij bewegende Knaagdieren

We presenteren methoden voor de constructie van elektroden om gelijktijdig extracellulaire neurale activiteit op te nemen en meerdere neuroactieve stoffen in de buurt van de opnameplaatsen bij wakkere muizen vrij te geven. Deze techniek maakt de gedetailleerde analyse van veronderstelde lokale synaptische input naar de belangrijke neuron mogelijk.

Extracellulaire van neuronale activiteit Gecombineerd met Microiontophoretic Toepassing van neuroactive stoffen in Awake Muizen

Wij presenteren drie nieuwe methoden om gustatorische codering te bestuderen . Met behulp van een simpel dier beschrijven de mot Manduca sexta ( Manduca ) een dissectieprotocol, het gebruik van extracellulaire tetrodes om de activiteit van meerdere gustatorreceptorneuronen op te nemen en een systeem voor het leveren en bewaken van nauwkeurig ingestelde pulsen van tastanten.

Nieuwe methoden voor het bestuderen van Gustatorische codering

Een draadloze, bidirectionele systeem voor meerkanaals neurale opnamen en stimulatie in vrij gedragen ratten wordt ingevoerd. Het systeem is licht en compact, dus met minimale impact op het gedrags repertoire van animal´s. Bovendien biedt dit systeem bidirectionele een geavanceerde tool om te beoordelen van de causale relaties tussen hersenen activering patronen en gedrag.

Een draadloze, bidirectionele Interface voor In Vivo opname en stimulatie van neurale activiteit in vrij gedragen ratten

Een nieuwe draadloze techniek voor het opnemen van extracellulaire neurale signalen uit de hersenen van vrij zwemmen goudvis wordt gepresenteerd. Het opnameapparaat bestaat uit twee tetrodes, een Microdrive, een neurale datalogger en een waterdichte behuizing. Alle onderdelen zijn op maat gemaakt, met uitzondering van de datalogger en de connector.

Draadloze elektrofysiologische opname van neuronen door beweegbare Tetrodes in vrij zwem vissen

Leer extracellulaire tetrode-opname in de hersenen van vrijlopende kakkerlakken. Deze methode synchroniseert neurale activiteit met videogedrag voor gedetailleerde analyse van insectenhersenfunctie.

Extracellulaire Wire Tetrode Opname in Brain vrijlopende Insecten

Meer video's verkennen