Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting
April 10th, 2014
Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.
Het algemene doel van het volgende experiment is om eiwit uit menselijk en muis hersenweefsel te extraheren voor proteomics-analyse. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een gemeenschappelijke lysoplossing om dezelfde eiwitextractie te verkrijgen, aangepast voor tweedimensionale elektroforese-aanpak. Vervolgens wordt tweedimensionale fluorescentie-verschilgelelektroforese gebruikt om eiwitten te scheiden voor identificatie door massaspectrometrie.
Dit wordt gevolgd door een miniatuur 2D-gelelektroforese met immunoblotting om post-translationele modificaties te identificeren. De resultaten kunnen globale eiwitexpressie laten zien. Gastvertaling verandert alle ligamentisatie en katalytische producten op basis van de verschillen in iso-elektrisch punt en moleculair gewicht.
De combinatie van 2D-streep en 2D-monolo kan ons helpen om de sleutelvraag in het neuroproteomics-veld te beantwoorden door tegelijkertijd informatie te verstrekken over expressieveranderingen. Post-modificatie en katabolisme in producten. Begin met het oogsten en homogeniseren van hersenweefsel. Bereid het weefsel voor op 10% gewicht naar volume in extractiebuffer voor menselijk hersenweefsel.
Homogeniseer het weefsel met behulp van een glazen Pipetter, gebruik echter een Teflon-homogenisator voor knaagdierweefsel om het homogenaat te desintegreren. Soniceer het op 60 hertz met 30 pulsen van een halve seconde. Bepaal vervolgens de eiwitconcentratie met een Bradford-assay met behulp van BSA als standaard.
Verzamel nu de oplossingen voor chloroform-methanol-precipitatie in een emmer met ijs. Plan om ongeveer 125 microgram te verzamelen voor 11 centimeter IPG-strips of ongeveer 1,25 milligram voor 18 centimeter IPG-strips. Zodra de oplossingen op vier graden Celsius zijn, voer de precipitatie volledig op ijs uit.
Voeg eerst drie volumes methanol toe, vervolgens een van chloroform. Schud dit mengsel. Voeg vervolgens drie volumes koud water toe.
Vortex deze mix gedurende één minuut, centrifugeer de monsterbuis gedurende 30 minuten bij 12.000 Gs bij vier graden Celsius. Aspireer en gooi de supernatant weg. Voeg vervolgens drie volumes methanol toe, vortex en centrifugeer de eiwitten op dezelfde manier neer.
Droog het verzamelde eiwitpelletje onder stikstofgas voordat u 2D DIGE uitvoert. Breng het eiwit opnieuw op in 2D-buffer bij 2,5 milligram per milliliter. Soniceer vervolgens de monsters zoals eerder gedaan totdat ze worden gebruikt.
Bewaar ze bij min 80 graden Celsius voordat u met deze stap begint en na eiwitprecipitatie. Het is noodzakelijk om de eiwitconcentratie opnieuw te bepalen door middel van een Bradford-assay. Volg dezelfde procedure als eerder werd getoond vóór psy-kleurstoflabeling.
De kwaliteit van het eiwitmonster wordt geverifieerd door SDS-pagina voor dat doel. Verdun 15 microgram eiwit in LDS en verwarm het tot 37 graden Celsius in een verwarmingsbad of -blok. Voer ze vervolgens uit op een polyacrylamidegel en kleur de gel gedurende ten minste een uur met kumasi-blauw oplossing.
Bewaar de gel dan een nacht in een oplossing van 7% azijnzuur en 10% ethanol. Zodra de kwaliteit van het eiwitmonster is vastgesteld, wordt de volgende dag de SD-labelingsprocedure gestart. Meet eerst de pH van het lysate, die basisch tot neutraal moet zijn.
De optimale pH is 8,6 voor volgende reacties. Stel vervolgens de kleurstofconjugatiereacties voor elk eiwitmonster in. Meng 50 microgram met 400 picomolen van S3-kleurstof en 50 microgram met 400 picomolen van S vijf-kleurstof.
Doe dit in quadruplex voor een totaal van acht D-koppelingsreacties per monster. Maak voor elk getest monster een complementaire set DI-koppelingsreacties met eiwit van de controle, zoals van een zieke hersenen. Zorg er dan voor dat voor elk paar reacties een interne controlereactie wordt ingesteld met 400 picomolen van CY twee en een gelijkmatige vertegenwoordiging van alle eiwitten tot 250 microgram.
SAI-labeling wordt bereikt door alle reactiemengsels gedurende een uur in het donker op vier graden Celsius te incuberen. Na de incubatie combineer alle sets van drie verschillende cyaanreacties in 150 microliter volumes naar elke set reacties bij 200 microliters van 2D-buffer. Ga vervolgens verder met de 2D-elektroforese-stappen.
Begin met het voorbereiden van niet-gelabelde eiwitoplossingen voor de preparatieve gel waaruit eiwitspots voor elk monster en voor de positieve controle zullen worden uitgesneden. Doseer 300 tot 350 microgram niet-gelabeld eiwit in 2D-buffer en laat ze rehydrateren in contact met de IPG-strip. Laad vervolgens de IPG-strips, breng het gelabelde en het niet-gelabelde eiwit over naar een rehydratie.
Bedek vervolgens elke put met een IPG-reactiestrook. Volg dit met een laag minerale olie en laat de strips overnacht passief rehydrateren met de eiwitoplossing bij niet meer dan 25 graden Celsius. De volgende dag voert u iso-elektrisch focussen van de IPG-strips uit.
Verwijder vervolgens de olie en bewaar de IPG-strips bij min 20 graden Celsius om de IPG-strips te gelijken. Dompel ze gedurende 15 minuten in evenwichtsbuffer. Breng vervolgens de strips over naar 4,7% IDO-acetamid in evenwichtsbuffer, zonder DTT, terwijl u de strips laat baden.
Gebruik een groot 2D-gelsysteem om vier 12% SDS-pagina-gels per monster in laagfluorescentie glasplaten voor de gelabelde eiwitten te gieten. Giet ook één 12% SDS-pagina-gel in standaardglasplaten van 1,5 millimeter dik voor elk van de niet-gelabelde eiwitten. Dit zijn de preparatieve gels.
Wanneer de gels zijn afgekoeld, brengt u de strips over naar de bovenkant van de gels en bedekt u de strips met 0,5% Aros. Zodra ze zijn afgekoeld, laat u de gels overnacht draaien bij 2,5 watt bij vier graden Celsius en analyseert u ze de volgende dag. Veel 2D-reacties kunnen worden uitgevoerd met eiwitmonsters die voor de preparatieve gels zijn gebruikt. Meet minder dan 100 microgram monster uit in 200 microliters 2D-buffer.
Vortex de monstermengsels vervolgens krachtig en draai ze snel. Laad de monsters op
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op het extraheren van eiwitten uit menselijk en muis hersenweefsel met behulp van een gemeenschappelijke lysisbuffer voor proteomicsanalyse. De methode maakt de identificatie en karakterisering van eiwitten mogelijk door middel van geavanceerde elektroforesetechnieken.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Proteomics
- Neurowetenschap
- Biochemie
Achtergrond
- Eiwitextractie is cruciaal voor het begrijpen van hersenfunctie.
- Tweedimensionale elektroforesetechnieken verbeteren eiwitscheiding.
- Post-translationele modificaties kunnen de eiwitfunctie aanzienlijk beïnvloeden.
- Betrouwbare methoden zijn nodig voor reproduceerbare resultaten in biopsies en modellen.
Doel van het onderzoek
- Om eiwitten uit hersenweefsel te extraheren voor analyse.
- Om tweedimensionale fluorescentieverschilgelelektroforese te gebruiken.
- Om post-translationele modificaties te identificeren door middel van immunoblotting.
Gebruikte methoden
- Eiwitextractie met ureum/thioureum/SDS-buffer.
- Tweedimensionale fluorescentieverschilgelelektroforese (2D-DIGE).
- Mini 2D gelelektroforese voor immunoblotting.
- Massaspectrometrie voor eiwitidentificatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie van eiwitten uit menselijk en muis hersenweefsel.
- Identificatie van eiwitten met behulp van massaspectrometrie.
- Karakterisering van post-translationele modificaties.
- Verbeterde reproduceerbaarheid van resultaten uit biopsies en modellen.
Conclusies
- De methode biedt betrouwbare resultaten voor proteomicsanalyse.
- Het vergemakkelijkt de studie van eiwitexpressie en -modificaties.
- Deze aanpak kan worden toegepast op verschillende neurologische studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
