Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Het algemene doel van het volgende experiment is het extraheren van eiwitten uit menselijk en muizenbreinweefsel voor proteomica-analyse. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een gemeenschappelijke lysisbuffer om dezelfde eiwitextractie te verkrijgen, aangepast voor tweedimensionale elektroforese-benaderingen. Vervolgens wordt tweedimensionale fluorescentie-differentiaalgelelektroforese gebruikt om eiwitten te scheiden voor identificatie via massaspectrometrie.

Hierna volgt een miniatuur 2D-gelelektroforese met immunoblotting om post-translationele modificaties te identificeren. De resultaten kunnen de globale proteïne-expressie aantonen. Gast-translationele veranderingen van alle ligamentisatie- en katalytische producten op basis van de verschillen in isoelectrisch punt en molecuulgewicht.

De combinatie van 2D-dash en 2D-monolo kan ons helpen om kernvragen in het veld van de neuroproteomica te beantwoorden door gelijktijdig informatie te verschaffen over expressieveranderingen. Posttranslationele modificatie en katabolisme in producten. Begin met het oogsten en homogeniseren van het hersenweefsel. Bereid het weefsel voor op 10% gewicht-volumeverhouding in extractiebuffer voor menselijk hersenweefsel.

Homogeniseer het weefsel met een glazen pipetteerder; gebruik echter een Teflon-homogenisator voor knaagdierweefsel om elk van de homogenaten te desintegreren. Sonicate het mengsel op 60 hertz met 30 pulsen van een halve seconde. Bepaal vervolgens de proteïneconcentratie met een Bradford-assay waarbij BSA als standaard wordt gebruikt.

Verzamel nu de oplossingen voor chloroform-methanolprecipitatie in een ijsbad. Plan om ongeveer 125 µg te verzamelen voor 11 cm IPG-strips of ongeveer 1,25 mg voor 18 cm IPG-strips. Zodra de oplossingen op 4 °C zijn, wordt de precipitatie volledig op ijs uitgevoerd.

Voeg eerst drie volumes methanol toe, gevolgd door één volume chloroform. Schud dit mengsel. Voeg vervolgens drie volumes koud water toe.

Vortex dit mengsel gedurende één minuut en centrifugeer de monsterbuis bij 12,000 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Aspireer het supernatant en gooi dit weg. Voeg vervolgens drie volumes methanol toe, vortex en centrifugeer de eiwitten op dezelfde wijze.

Droog het verzamelde eiwitpellet onder nitrogengas vóór 2D DIGE. Resuspendeer het eiwit in 2D-buffer op 2,5 mg/mL. Sonicate vervolgens de monsters zoals eerder beschreven tot ze worden gebruikt.

Bewaar deze bij -80 °C vóór het begin van deze stap en na de eiwitprecipitatie. Het is noodzakelijk om de eiwitconcentratie nogmaals te bepalen middels een Bradford-assay. Volg hiervoor dezelfde procedure als eerder beschreven vóór de markering met psy-kleurstof.

De kwaliteit van het eiwitmonster wordt voor dat doel geverifieerd middels SDS-PAGE. Verdun 15 µg eiwit in LDS en verwarm dit tot 37 °C in een warmtebad of heating block. Laat ze vervolgens lopen op een polyacrylamidegel en kleur de gel gedurende ten minste een uur met een Coomassie Blue-oplossing.

Bewaar de gel vervolgens gedurende de nacht in een oplossing van 7% azijnzuur en 10% ethanol. Zodra de kwaliteit van het eiwitmonster is vastgesteld, wordt de volgende dag gestart met de SD-labelingsprocedure. Meet eerst de pH van het lysaat, welke basisch tot neutraal moet zijn.

De optimale pH voor de daaropvolgende reacties is 8,6. Stel vervolgens de kleurstofconjugatiereacties op voor elk eiwitmonster. Meng 50 micrograms met 400 picomoles S3-kleurstof en 50 micrograms met 400 picomoles S5-kleurstof.

Voer dit in quadruplex uit voor een totaal van acht D-koppelingsreacties per monster. Maak voor elk getest monster een complementaire set DI-koppelingsreacties met proteïne uit de controle, zoals afkomstig van een ziek brein. Richt vervolgens voor elk paar reacties een interne controlereactie in met 400 picomoles CY twee en een gelijke representatie van alle proteïnen voor een totaal van 250 micrograms.

SAI-markering wordt bereikt door alle reactiemengsels gedurende een uur bij vier graden Celsius in het donker te incuberen. Combineer na de incubatie alle sets van drie verschillende cyaan-reacties in volumes van 150 microliter met elke set reacties van 200 microliters 2D-buffer. Ga vervolgens verder met de stappen voor 2D-elektroforese.

Begin met het prepareren van ongelabelde eiwitoplossingen voor de preparatieve gel, waaruit eiwitspots zullen worden uitgesneden voor elk monster en voor de positieve controle. Verdeel 300 tot 350 micrograms ongelabeld eiwit over de 2D-buffer en laat deze rehydrateren in contact met de IPG-strip. Laad vervolgens de IPG-strips en breng het gelabelde en ongelabelde eiwit over naar een rehydratie.

Dek vervolgens elke put af met een IPG-reactiestrip. Voeg hierna een laag minerale olie toe en laat de strips 's nachts passief rehydrateren met de eiwitoplossing bij een temperatuur van maximaal 25 °C. Voer de volgende dag de isoelektrische focussering van de IPG-strips uit.

Verwijder vervolgens de olie en bewaar de IPG-strips bij -20 °C om de IPG-strips te equilibreren. Dompel ze gedurende 15 minuten onder in equilibratiebuffer. Breng de strips daarna over naar 4,7% IDO acetamide in equilibratiebuffer zonder DTT, terwijl de strips worden gebad.

Gebruik een groot 2D-gelsysteem om per monster vier 12% SDS-PAGE-gels te gieten in glazen platen met lage fluorescentie voor de gelabelde eiwitten. Giet daarnaast voor elk van de niet-gelabelde eiwitten één 12% SDS-PAGE-gel in standaard glazen platen met een dikte van 1,5 millimeter. Dit zijn de preparatieve gels.

Wanneer de gels zijn afgekoeld, brengt u de strips aan op de bovenkant van de gels en bedekt u de strips met 0,5% Aros. Zodra deze zijn afgekoeld, laat u de gels een nacht lang lopen bij 2,5 watt bij vier graden Celsius en analyseert u ze de volgende dag. Veel 2D-reacties kunnen worden uitgevoerd met eiwitmonsters die zijn gebruikt voor de preparatieve gels. Meet minder dan 100 micrograms monster af in 200 microliters 2D-buffer.

Vortex vervolgens de monstermengsels krachtig en centrifugeer ze kort. Breng de monsters aan op 11 centimeter IPG-strips en laat ze de volgende dag gedurende de nacht passief rehydrateren onder een laag minerale olie. Voer de isoelektrische focussering uit.

Breng de strips vervolgens over in drie baden met equilibratiebuffer voor 15 minuten per bad. De strips worden daarna geanalyseerd op 2D SDS-PAGE-gels. Leg elke strip op een precast gel met het passende molecuulgewicht.

Polyacrylamide voor het eiwit van belang. Breng de gels vervolgens over op een NITROCELLULOSE PVDF-membraan en analyseer deze met antilichamen volgens de ontwikkeling van dit protocol. Drie verschillende lyses.

Buffers werden getest. Ten eerste werd een veelgebruikte biochemische en moleculaire biologiebuffer getest: Tris SDS.

Tris SDS vertoonde een slechtere resolutie in vergelijking met een andere geteste buffer, UTS. De derde buffer werd uitgesloten omdat er geen testbare monsters mee konden worden bereid. Vervolgens werden de proteomen van de menselijke en muizenhersenen onderzocht.

Monsters van de menselijke controle-cortex en monsters van de ad-cortex werden vergeleken. Muizenherseneiwitten van muizen met AD-achtige tau-pathologie werden eveneens bekeken vanuit het menselijke monster. SCI twee werd onafhankelijk bekeken, evenals S SI drie en sci vijf voor elke D. De hoge spotresolutie maakte de uitlijning eenvoudig.

Kwalitatieve mini-2D-analyse werd gebruikt om posttranslationele modificaties te onderzoeken; een geligamenteerd alpha-synucleïne in vetweefsel vertoonde een normaal profiel, maar werd ook aangetroffen als een dimeer, gemarkeerd met een asterisk. Pijlen geven aan waar alpha-synucleïne werd aangetroffen. Ubiquitineerd amyloid-precursorproteïne werd eveneens geanalyseerd via mini-2D.

Sporadische AD werd vergeleken met familiale AD. Bij familiale AD zijn de concentraties van bèta-amyloïde 1-42 en ISO-varianten lager, omdat liga-vormen werden aangetroffen bij 8 kilodalton. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het proteoom bestudeerd kan worden om complexe monsters te vergelijken door eiwitexpressiemodificaties te meten.