Name: Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor eiwitextractie uit menselijk en muizenhersenweefsel voor proteomics-analyse. Deze methode combineert 2D-DIGE en mini 2DE immunoblotting voor identificatie van post-translatiemodificaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door Inserm, Universiteit van Lille 2, MEDIALZ, Labex (uitmuntendheid laboratorium, programma investeren voor de toekomst) en DISTALZ (ontwikkeling van innovatieve strategieën voor een transdisciplinaire benadering van de ziekte van Alzheimer). FJ.FG is momenteel een ontvanger gemeenschap van ANR (Franse Nationale Research Agency / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), maar dit werk ook onder de steun van een subsidie ​​van de JCCM (Spanje).

1. Homogenisering en Total Eiwitextractie van de mens en de muis hersenweefsel <ol><li> Hersenweefsel homogenisering. Homogeniseer het hersenweefsel 10% (w / v) in 8 M ureum, 2 M thioureum en 1% w / v SDS buffer (UTS) met een potter glas (menselijke monsters) of Teflon homogenisator (voor muizen monsters). Ultrasone trillingen bij 60 Hz 30 pulsen met een ultrasone generator toepassing van 0,5 sec voor volledige desintegratie weefsels 13, 14. <ol><li> Bepaal eiwitconcentratie met Bradford assay, met behulp van BSA als standaard. Dit UTS buffer extractie is volledig compatibel met een dimensie SDS-PAGE zolang lysates zijn niet over-verhit tot carbamylering 15 voorkomen. </li><li> Voeg 1% (w / v) Amberlite en incubeer onder voorzichtig mengen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Daarna filteren op 0,22 pm spuit filters en tenslotte de SDS toe te voegen aan de ureum / thioureum oplossing. Deze stap vermindert de hoeveelheid urinezuur en isocyaanzuur, die in equilibrium met ureum in oplossing en de afbraakproducten vergemakkelijken. </li></ol></li><li> Chloroform / methanol eiwitprecipitatie. Neerslag tussen 100-150 ug eiwit 11 cm IPG strips en 1-1,5 mg 18 cm die (onafhankelijk van de pH bereik gekozen om de IEF voeren). <ol><li> Voer alle stappen op ijs of bij 4 ° C. Koel chloroform en methanol bij 4 ° C gedurende 30 minuten voordat de precipitatie procedure. </li><li> Voeg drie delen methanol en een volume van chloroform tot een volume van UTS lysaat. Hand schudden van het mengsel en voeg drie delen van koud water. Vortex gedurende 1 min en de pellet eiwitten door centrifugatie bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant met behulp van een Pasteur pipet en voeg drie delen van koude MeOH. Vortex opnieuw en centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Tenslotte gooi supernatant en droog de ​​pellet onder N2. </li></ol></li><li> Bereiding van eiwitten voor 2D analyse.Resuspendeer de pellet gedroogd eiwit in 2D-buffer (8 M ureum, 2 M thioureum aangevuld met 4% CHAPS). Was de oplossing met Amberlite zoals boven aangegeven en proberen om het aandeel van 500 ug eiwit per 200 gl buffer 2D bewaren 2D-DIGE. Opmerking: 2D buffer bij -80 ° C worden opgeslagen of bij 4 ° C gehouden gedurende een week (ureum afbraak te voorkomen). <ol><li> Ultrasone trillingen en monsters worden bij -80 ° C totdat het uitvoeren van de volgende stap. Opmerkelijk, kan dit protocol worden gebruikt na mierenzuur oplosbaarheid van eiwit aggregaten 10. Kort verdampen mierenzuur onder N2 en resuspendeer de pellet beschreven. </li></ol></li></ol> 2. 2D-DIGE <ol><li> Monsters te testen kwaliteit. Dosis monsters opnieuw met Bradford methode. Verdun 15 ug van eiwitten in LDS monsterbuffer warmte bij 37 ° C en 15 laden op 4-12% polyacrylamidegels. </li><li> Coomassie kleuring. Vlekken polyacrylamidegel met 0,1% (w / v) CoomassieG 250, 50% EtOH en 10% (v / v) azijnzuur oplossing ten minste 1 uur. Laten achtergrond overnacht Destain in 7% azijnzuur en 10% (v / v) ethanol oplossing. </li><li> Pre-elektroforetische etikettering van de monsters. Voorafgaand aan het uitvoeren cyanine kleurstof etikettering, verifiëren de pH van het monster, die basisch of neutraal zou zijn omdat de N-hydroxysuccinimide substitutie efficiënter bij basische pH en gezien optimaal bij pH 8,6 te zijn. <ol><li> Label minimaal twee monsters van studie met Cy3 of Cy5 fluorescente kleurstoffen met een verhouding van 50 ug protein/400 pmol kleurstof en houd gedurende 1 uur bij 4 ° C in het donker aan NHS ester reactieve groep van de cyaninen met de geprotoneerde amine vergemakkelijken groepen lysinen. </li><li> Verminder monster variaties maken van een cross-labeling met Cy3 en Cy5 kleurstoffen, het vermijden van een preferentiële koppeling van een monster aan een bepaalde cyanine. Merk op dat de cyanine kleurstof minimale labeling kan worden aangepast aan kleine hoeveelheid eiwitten met het houden van de verhouding van 1 pg protein per 8 pmol cyanine-kleurstof. Zo ja, kan de mini-2DE systeem worden gebruikt in plaats van de grote 2D gel systeem. Hierdoor wordt de 2D-DIGE analyse een kleine hoeveelheid hersenweefsel mogelijk. </li><li> Label een pool van beide monsters met dezelfde hoeveelheid eiwit (50 ug totaal) Cy2 fluorescente kleurstof en als interne standaard. Gebruik dezelfde voorwaarden als eerder aangegeven. </li><li> Complete om een ​​totaal volume 350 pi met 2D buffer die 1,1% Destreak reagens, 1,2% IPG-buffer en sporen van broomfenolblauw het totaal 150 ug van gelabelde eiwitten (50 ug Cy2, Cy3 50 ug en 50 ug Cy2). Voer deze stap in viervoud met vier onafhankelijke strips. Bovendien bereiden twee extra niet-gelabelde stroken (een voor elk monster) met 350-450 ug eiwit voor de preparatieve gels. </li><li> Laat de zes geladen strips bedekt met minerale olie &#39;s nachts voor passieve rehydratatie. </li></ol></li><li> Isoelectrofocusing. Voer de IEF bij 206; C. Voor een pH 3-11NL, 18 cm strip het protocol is: maximale stroom instelling is 50 uA / strip in 8 etappes: 1) 150 V stap voor 1 uur, 2) 200 V stap voor 5 uur, 3) 500 V gradiënt voor 2 uur, 4) 1000 V gradiënt gedurende 2 uur, 5) 2000 V gradiënt gedurende 2 uur, 6) 4000 V helling van 2 uur, 7) 8000 V gradiënt gedurende 2 uur en 8) voor in totaal 24.000 V · u stap . Na IEF verzending de overmaat minerale olie met behulp van chromatografie papier en bewaar de stroken bij -20 ° C totdat de tweede dimensie. </li><li> IPG Strips verevening. Equilibreren stroken 6 M ureum, 2% SDS, 30% Glycerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6 buffer met 1% DTT gedurende 15 minuten en na 4,7% van iodoacetamide in dezelfde buffer maar zonder DTT. </li><li> Tweede dimensie of SDS-PAGE elektroforese. Maak de zes 12% SDS-PAGE gels (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% acrylamide / bisacrylamide, 0,1% (w / v) SDS, 0.072% (w / v) APS en 0,1% (v / v) TEMED ) tegelijkertijd met een grote 2D systeem met vier lage fluorescentie glasplaten voor de strips met fluorescentie monsters en twee glazen platen met 1,5 mm dikte preparatieve gels heeft het eiwit spots uit te snijden. <ol><li> Plaats de zes IPG strips bovenop de gels en over gelaagde met 0,5% (w / v) agarose. Running buffer bestaat uit 25 mM Tris, 192 mM glycine en 0,1% (w / v) SDS. Het uitvoeren van de migratie op 2,5 W / gel &#39;s nachts met een koelsysteem ingesteld op 4 ° C 16,17. </li></ol></li><li> Fluorescentie afbeeldingen acquisitie en analyse. Gebruik een Typhoon 9400 scanner om de fluorescentie gels beelden (12 beelden voor een experiment) te verkrijgen. Scan Cy2, Cy3 en Cy5 afbeeldingen voor elke gel bij 488/520 nm, 532/580 nm en 630/670 nm excitatie / emissie golflengten, respectievelijk. Gebruik informatic software om de beelden te analyseren. Gegevens zijn representatief voor de veranderingen spot volume voor de distributie van het signaal over de vier gels tussen de twee onderzochte monsters. </li><li> Coomassie kleuring voor grote gels. Bevestig de preparatieve gels in 50% (v / v) EtOH en 3% (v / v) fosforzuur oplossing ten minste 24 uur. Dan na, twee keer wassen met ultra zuiver water gedurende 20 minuten. Voer kleuring in 34% (v / v) MeOH, 17% (w / v) ammoniumsulfaat en 2% orthofosforzuur gedurende 1 uur voor het toevoegen van 0,1% (w / v) Coomassie Blue G-250. Houd de gels in kleur gedurende ten minste 48 uur en ontkleurd in ultra puur water. <ol><li> Spots voor MS identificatie. Zodra fluorescentie beelden worden geanalyseerd, biedt de software een lijst van plekken waarvan de expressie is statistisch verschillend. Handmatig uitsnijden deze vlekken uit de preparatieve gelen. Deze procedure vergt oefening en enkele handvaardigheid om keratine besmetting te voorkomen. Dan monsters kunnen in water worden bewaard bij -20 ° C totdat zendt MS. Spot identificatie perfect verenigbaar met tandem massaspectrometrie (MS / MS) en relevantie eiwit identiteiten wordt beoordeeld volgens de waarschijnlijkheid gebaseerde MOWSE score berekend met een p-waarde van 0,05 (p &lt;0,05) 18. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Kwalitatieve Mini-2DE Assay <ol><li> Resuspendeer maximaal 100 ug eiwit monster in 2D buffer tot een eindvolume van 200 ul van een 11 cm IPG strip. Bij overexpressie systeem of gezuiverd eiwit, kan het uitgangsbedrag worden verlaagd tot 20 ug. </li><li> Voeg 1,1% (v / v) Destreak Reagent, 0,55% (v / v) IPG buffer en sporen van broomfenolblauw tot een eindvolume van 200 pl. Dan, vortex, maak een snelle spin en laden in een IPG strip voor passieve rehydratie nachts bedekt met minerale olie (om de strip in zijn oorspronkelijke dikte te brengen). Opmerking: de verhouding van IPG buffer hetzelfde voor alle interval gewenste pH (pH 3-11, 4-7, 7-11, enzovoort), maar de samenstelling varieert in functie van het pH-gebied gekozen. </li><li> Isoelectrofocalisation. Voer IEF bij 20 ° C. De duur van het programma afhankelijk van de pH interval gekozen. Opmerkelijk parameters zoals electroendosmosis kan de IEF profiel verstoren en in deze gevallen,optimalisatie in electrofocalisation tijd nodig is 19. Let op: het is niet per se een langere IEF die betere resultaten geeft, maar het verkorten van de tijd van IEF kan ook het verbeteren van de resolutie. Na IEF kan IPG strips worden bewaard bij -20 ° C gedurende maanden. </li><li> IPG strips verevening. Equilibreren van de strips in een buffer die 25 mM Tris-HCl pH 6,8, 20 mM DTT, 10% glycerol, 5% SDS, 0,05% broomfenol blauw. Maak drie equilibrering baadt gedurende 15 minuten met het veranderen van de bufferoplossing tussen elk bad. </li><li> SDS-PAGE. Laag de IPG strip op een prefab gel (IPG 1 en 11 cm IPG strip) met een percentage polyacrylamide gekozen afhankelijk van het MW van het eiwit van belang. Vervolgens dep de gel op een nitrocellulose / PVDF membraan aan 100 mV gedurende 33 minuten. </li><li> Incubeer overnacht met de vereiste antilichaam en visualiseren door peroxidaseactiviteit. Voer de uitlijning van immunoblots gebruik ongerelateerde polypeptiden onthuld door de secundaire antilichaam. Bereik een semi-quantittieve analyse door densitometrie van het volume en de intensiteit van de sporen / vlekken met ImageJ software. </li></ol>

<ol><li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grand+challenges+in+global+mental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li>
<li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Deyn%2C+PP+%22Animal+Models+of+Dementia+Vol.+48+Neuromethods+449-468%22">Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468</a>. , Humana Press. 449-468 (2011).</li>
<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li>
<li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li>
<li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys%2Fcys+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis%3A+a+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li>
<li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li>
<li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843(2009).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer%27s+disease%3A+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer%27s+and+Pick%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li>
<li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li>
<li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li>
<li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li>
<li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li>
<li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li>
<li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57(2010).</li>
<li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients%3A+IPG+Strip+Equilibration%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li>
<li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2%2F3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li>
<li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li>
<li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li>
<li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li>
<li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li>
<li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li>
<li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li>
<li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li>
<li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins%2C+neurotransmission+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li>
<li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li>
<li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer%27s+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li>
<li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia%3A+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li>
<li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li>
<li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+neuropathological%2C+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li>
<li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li>
<li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank%3A+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li>
<li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li>
<li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+%282-D+DIGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li>
<li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li>
<li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Het ontdekken van pathologische expressie veranderingen van eiwitten, zoektocht naar biomarkers en de modulatie van mogelijke pistes voor farmacologische doelwitten behoren tot de doelstellingen van de Neuroproteomics benadert 30. Temidden van de opkomende instrumenten, het veld 2DE voegt een veelbelovende afwachtend. Niettemin moet een consensus om variabiliteit te minimaliseren en verhoging reproduceerbaarheid in de experimenten worden bereikt. In het verlengde van dit idee een gestandaardiseerd protocol om...

Psychische en neurologische aandoeningen vertegenwoordigen 13% van de wereldwijde ziektelast, moet nieuwe uitdagingen zoals pathofysiologische mechanismen, risicofactoren en prodromale biomarkers worden onderzocht 1. In lijn met deze doelstelling, proteomics studies van het menselijk brein onmisbaar geworden moleculaire pathways betrokken bij processen zoals geheugen, gedrag, emoties en neuronale plasticiteit bijvoorbeeld, niet alleen voor de fysiologische, maar ook voor pathologische omstandigheden duidelijk worden. Daarom is het gebruik van diermodellen en meer specifiek de transgene muizen, brengt een groot aantal mogelijkheden om de etiologie van humane neurodegeneratieve aandoeningen 2 nabootsen. Proteomics benaderingen zijn tegenwoordig beschikbaar om deze nieuwe perspectieven te bereiken op het gebied neurowetenschappen. Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtige en waarschijnlijke eenvoudige methode waarmee vergelijken het proteoom van een groot aantal monsters. Bovendien is ook eenkrachtige methode om een ​​isolaat uit een complex mengsel te identificeren en verder geanalyseerd door massaspectrometrie. Deze techniek bestaat in hoofdzaak in twee opeenvolgende stappen: 1) eiwit gescheiden volgens hun iso-elektrisch punt (pI) van isoelectrofocusing (IEF). Meer bepaald wordt een elektrische potentiaal aangebracht over de Immobiline acrylamide strips onder een pH-gradiënt en dan eiwitten zal migreren en zich richten op een bepaalde pI in functie van de globale netto-lading. 2) Isoelectrically gericht eiwitten denatureren en negatief geladen door toevoeging van natriumdodecylsulfaat (SDS), waardoor eiwitten in de eerste structuur gescheiden afhankelijk van hun schijnbaar molecuulgewicht (MW) van SDS-PAGE 3. Deze twee verschillende eigenschappen kunnen we een dubbele waarde aan in de studie van het proteoom verder gaan aanpakken. Enerzijds Deze benadering biedt de mogelijkheid om een ​​kwantitatieve analyse uit te voeren met minimale kleurstoffen 2D-DIGE methode en anderzijds een qualitative analyse door mini-2DE gekoppeld aan western blotting. Kwantitatieve analyse van 2D-DIGE schenkt eiwit expressie verandert over de hele steekproef proteoom. In het kort worden monsters gelabeld met drie cyaninen (Cy2, Cy3 en Cy5) emitteert bij drie verschillende golflengten (blauw, groen en rood). Deze fluor minimale kleurstoffen die N-hydroxy-succinimidyl ester groep reageren met de ε-aminogroep van lysines residuen van eiwitten waardoor covalente amide bindingen 4. Lysineresiduen zijn gelabeld slechts tussen de 1-3% en dus meerdere labels toevoeging per eiwit en grote netto lading wijzigingen 5, 6 voorkomen. Cy3 en Cy5 worden vaak gebruikt om twee onafhankelijke steekproeven benoemen terwijl Cy2 labels een mengeling van gelijke delen van de monsters te vergelijken. De twee belangrijkste voordelen zijn dat alle gelabelde monsters zijn gemengd en IEF en SDS-PAGE worden uitgevoerd in een gel uitgevoerd in een keer voor elke stap, het vermijden van de inter variabiliteit onder experimenten te wijten aan vergelijking gels. Bovendien presenteert een hoge detectiegrens van circa 1 femtomole eiwit 7. Gels worden gescand en 2D software vergelijkt het 2D gel fluorescentie afbeeldingen waar Cy2 dient als interne standaard ter identificatie van statistische verschillen tussen de plaatsen voor de achterste identificatie door massaspectrometrie. De 2D analyse software met de interne standaard bereikt een snelle detectie van minder dan 10% verschillen tussen monsters met meer dan 95% van statistische betrouwbaarheid 8. Kwalitatieve analyse door mini-2DE is een cruciale stap voor eiwitkarakterisering. Het principe is hetzelfde als eerder beschreven voor pI en MW scheiding, maar in dit geval eiwitten die door een kleine polyacrylamidegel naar een membraan en immunoblotting wordt daarna uitgevoerd. Terwijl een dimensie gelelektroforese bepaald veranderingen in eiwitexpressie voor een of meer eiwitten epitopen in functie van het antilichaam, de informatin van mini-2DE begiftigt met twee extra parameters. Ten eerste, het eiwit isovariants veranderen in functie van de PI, wat aangeeft dat post-translationele modificaties zou kunnen plaatsvinden. Ten tweede mag de massa van identificatie spectrometrie indicatief plausibele zymogenen en katabole producten van eiwitten. Daarom wijzigingen waargenomen door 2D-DIGE zijn waarschijnlijk een aanwijzing voor de mechanismen die ten grondslag liggen aan veranderingen in de wereldwijde proteoom profiel. De aanpassing van het immunoblots tussen verschillende monsters voor hetzelfde eiwit epitoop / s door mini-2DE kan zuurgraad veranderingen die licht werpen in post-translationele variaties iets waargenomen of zelfs niet door monodimensional immunoblotten 9, 10 weerspiegelen. Bovendien, deze analyse informeert over de mogelijke splitsingsplaatsen vanwege de kennis van de pI en MW van de metabolische residuen 11,12. De combinatie van deze twee technieken biedt een aanvullende proteomics analyse. Aan de ene kant 2D-DIGE biedt een type verschillen waardoor een nauwkeurige isolatie van polypeptiden waarvan de expressie is anders. Deze verschillen bestaan ​​in hoofdzaak in het uiterlijk of de verdwijning van een plek of toename / afname van de intensiteit van een gegeven een door software analyse van de tl-gels. Deze vaststellingen zelf waarschijnlijk niet de aard van de wijziging waargenomen verklaren. Daarom, wanneer het polypeptide wordt geïsoleerd en geïdentificeerd door massaspectrometrie, het gebruik van mini-2DE kunnen precies bevestiging 1) de identiteit van het eiwit geïsoleerd en 2) de aard van de verschil verandering in de isovariant / isovorm niveau expressie, post-translationele modificaties en splitsing werkwijzen bijvoorbeeld. Het is echter noodzakelijk om een ​​conferentie lysisbuffer beide geschikt voor 2D-DIGE en mini-2DE om mogelijke dispersies door het gebruik van extractie protocollen die zeer verschillend beperken ontwikkelen. In dit artikel, we Debeschreven een aangepast protocol voor de voorbereiding, de winning en de prestaties van 2D-DIGE en mini-2DE technieken voor de hersenen eiwitten afkomstig van mens en muis weefsel.

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referentie in functie van het pH-interval/grootte</td></tr><tr><td>IPG Buffer, pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referentie in functie van het gewenste pH-interval</td></tr><tr><td>AMBERLITE IRN-150L MIXED BED RESIN 1&nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td><td>GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>KIT BOX IPG 1 * 1 KIT</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>Kunststof doos om de passieve rehydratie uit te voeren</td></tr><tr><td>MILLEX GS Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT Precast Gels 13.3 x 8.7 cm (W x L)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Referentie in functie van het MW om te scheiden</td></tr><tr><td>IPGphor III Isoelectric Focusing Unit</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix Large Electrophoresis System</td><td>GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&nbsp;</td><td>Gel Company</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

consensus brain-afgeleide eiwit, extraction protocol voor de studie van mensen en muizen brain proteome behulp zowel 2d-dige en mini 2de immunoblotting

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Tweedimensionale gelelektroforese (2DE) is een krachtig hulpmiddel om proteoom veranderingen mogelijk gerelateerd aan verschillende fysiologische of pathologische omstandigheden duidelijk worden. In principe is deze techniek gebaseerd op de scheiding van eiwitten op basis van hun iso-elektrisch punt in een eerste stap, en anderzijds naar hun molecuulgewichten door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE). In dit rapport wordt een geoptimaliseerd monstervoorbereiding protocol voor kleine hoeveelheid menselijke post-mortem en muis hersenweefsel wordt beschreven. Deze methode maakt het mogelijk om zowel tweedimensionale fluorescentie verschil gelelektroforese (2D-DIGE) en mini 2DE immunoblotting voeren. De combinatie van deze benaderingen kan men niet alleen nieuwe eiwitten en / of eiwitmodificaties voorbeeld in hun expressie door de compatibiliteit met massaspectrometrische detectie, maar ook een nieuw inzicht in markers validatie. Zo, mini-2DE gekoppeld aan western blotting vergunningen om bericht te identificeren en te valideren-Translationele modificaties, eiwitten katabolisme en geeft een kwalitatieve vergelijking tussen verschillende omstandigheden en / of behandelingen. Hierin geven we een methode om onderdelen van eiwitcomplexen gevonden in AD en Lewy body dementie, zoals de amyloïd-beta peptide en de alfa-synucleïne bestuderen. De werkwijze kan dus worden aangepast voor de analyse van het proteoom en onoplosbare eiwitten extraheren uit menselijk hersenweefsel en muismodellen ook. Tegelijkertijd kan het nuttige informatie voor de studie van moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij neurodegeneratieve ziekten als potentiële nieuwe biomerkers en therapeutische targets.

Proteomics on hersenweefsel blijft een uitdaging omdat geen ideale buffer bestaat om 100% van eiwitten, in het bijzonder membraan-geassocieerde eiwitten van het cytoskelet of herstellen. De eerste reeks experimenten waren gericht op de zoektocht naar een geschikte lysebuffer compatibel met de twee benaderingen en die het mogelijk maakt om een ​​groot panel van eiwit te herstellen. Zo werden drie lysis buffers onderzocht op de meest geschikte bepalen. Eerst werd het gebruikt gemeenschappelijke biochemische en moleculaire...

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het extraheren van eiwitten uit menselijk en muizenbreinweefsel voor proteomica-analyse. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een gemeenschappelijke lysisbuffer om dezelfde eiwitextractie te verkrijgen, aangepast voor tweedimensionale elektroforese-benaderingen. Vervolgens wordt tweedimensionale fluorescentie-differentiaalgelelektroforese gebruikt om eiwitten te scheiden voor identificatie via massaspectrometrie.Hierna volgt een miniatuur 2D-gelelektroforese met immunoblotting om post-translationele modificaties te identificeren. De resultaten kunnen de globale proteïne-expressie aantonen. Gast-translationele veranderingen van alle ligamentisatie- en katalytische producten op basis van de verschillen in isoelectrisch punt en molecuulgewicht.De combinatie van 2D-dash en 2D-monolo kan ons helpen om kernvragen in het veld van de neuroproteomica te beantwoorden door gelijktijdig informatie te verschaffen over expressieveranderingen. Posttranslationele modificatie en katabolisme in producten. Begin met het oogsten en homogeniseren van het hersenweefsel. Bereid het weefsel voor op 10% gewicht-volumeverhouding in extractiebuffer voor menselijk hersenweefsel.Homogeniseer het weefsel met een glazen pipetteerder; gebruik echter een Teflon-homogenisator voor knaagdierweefsel om elk van de homogenaten te desintegreren. Sonicate het mengsel op 60 hertz met 30 pulsen van een halve seconde. Bepaal vervolgens de proteïneconcentratie met een Bradford-assay waarbij BSA als standaard wordt gebruikt.Verzamel nu de oplossingen voor chloroform-methanolprecipitatie in een ijsbad. Plan om ongeveer 125 µg te verzamelen voor 11 cm IPG-strips of ongeveer 1,25 mg voor 18 cm IPG-strips. Zodra de oplossingen op 4 °C zijn, wordt de precipitatie volledig op ijs uitgevoerd.Voeg eerst drie volumes methanol toe, gevolgd door één volume chloroform. Schud dit mengsel. Voeg vervolgens drie volumes koud water toe.Vortex dit mengsel gedurende één minuut en centrifugeer de monsterbuis bij 12,000 Gs gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Aspireer het supernatant en gooi dit weg. Voeg vervolgens drie volumes methanol toe, vortex en centrifugeer de eiwitten op dezelfde wijze.Droog het verzamelde eiwitpellet onder nitrogengas vóór 2D DIGE. Resuspendeer het eiwit in 2D-buffer op 2,5 mg/mL. Sonicate vervolgens de monsters zoals eerder beschreven tot ze worden gebruikt.Bewaar deze bij -80 °C vóór het begin van deze stap en na de eiwitprecipitatie. Het is noodzakelijk om de eiwitconcentratie nogmaals te bepalen middels een Bradford-assay. Volg hiervoor dezelfde procedure als eerder beschreven vóór de markering met psy-kleurstof.De kwaliteit van het eiwitmonster wordt voor dat doel geverifieerd middels SDS-PAGE. Verdun 15 µg eiwit in LDS en verwarm dit tot 37 °C in een warmtebad of heating block. Laat ze vervolgens lopen op een polyacrylamidegel en kleur de gel gedurende ten minste een uur met een Coomassie Blue-oplossing.Bewaar de gel vervolgens gedurende de nacht in een oplossing van 7% azijnzuur en 10% ethanol. Zodra de kwaliteit van het eiwitmonster is vastgesteld, wordt de volgende dag gestart met de SD-labelingsprocedure. Meet eerst de pH van het lysaat, welke basisch tot neutraal moet zijn.De optimale pH voor de daaropvolgende reacties is 8,6. Stel vervolgens de kleurstofconjugatiereacties op voor elk eiwitmonster. Meng 50 micrograms met 400 picomoles S3-kleurstof en 50 micrograms met 400 picomoles S5-kleurstof.Voer dit in quadruplex uit voor een totaal van acht D-koppelingsreacties per monster. Maak voor elk getest monster een complementaire set DI-koppelingsreacties met proteïne uit de controle, zoals afkomstig van een ziek brein. Richt vervolgens voor elk paar reacties een interne controlereactie in met 400 picomoles CY twee en een gelijke representatie van alle proteïnen voor een totaal van 250 micrograms.SAI-markering wordt bereikt door alle reactiemengsels gedurende een uur bij vier graden Celsius in het donker te incuberen. Combineer na de incubatie alle sets van drie verschillende cyaan-reacties in volumes van 150 microliter met elke set reacties van 200 microliters 2D-buffer. Ga vervolgens verder met de stappen voor 2D-elektroforese.Begin met het prepareren van ongelabelde eiwitoplossingen voor de preparatieve gel, waaruit eiwitspots zullen worden uitgesneden voor elk monster en voor de positieve controle. Verdeel 300 tot 350 micrograms ongelabeld eiwit over de 2D-buffer en laat deze rehydrateren in contact met de IPG-strip. Laad vervolgens de IPG-strips en breng het gelabelde en ongelabelde eiwit over naar een rehydratie.Dek vervolgens elke put af met een IPG-reactiestrip. Voeg hierna een laag minerale olie toe en laat de strips 's nachts passief rehydrateren met de eiwitoplossing bij een temperatuur van maximaal 25 °C. Voer de volgende dag de isoelektrische focussering van de IPG-strips uit.Verwijder vervolgens de olie en bewaar de IPG-strips bij -20 °C om de IPG-strips te equilibreren. Dompel ze gedurende 15 minuten onder in equilibratiebuffer. Breng de strips daarna over naar 4,7% IDO acetamide in equilibratiebuffer zonder DTT, terwijl de strips worden gebad.Gebruik een groot 2D-gelsysteem om per monster vier 12% SDS-PAGE-gels te gieten in glazen platen met lage fluorescentie voor de gelabelde eiwitten. Giet daarnaast voor elk van de niet-gelabelde eiwitten één 12% SDS-PAGE-gel in standaard glazen platen met een dikte van 1,5 millimeter. Dit zijn de preparatieve gels.Wanneer de gels zijn afgekoeld, brengt u de strips aan op de bovenkant van de gels en bedekt u de strips met 0,5% Aros. Zodra deze zijn afgekoeld, laat u de gels een nacht lang lopen bij 2,5 watt bij vier graden Celsius en analyseert u ze de volgende dag. Veel 2D-reacties kunnen worden uitgevoerd met eiwitmonsters die zijn gebruikt voor de preparatieve gels. Meet minder dan 100 micrograms monster af in 200 microliters 2D-buffer.Vortex vervolgens de monstermengsels krachtig en centrifugeer ze kort. Breng de monsters aan op 11 centimeter IPG-strips en laat ze de volgende dag gedurende de nacht passief rehydrateren onder een laag minerale olie. Voer de isoelektrische focussering uit.Breng de strips vervolgens over in drie baden met equilibratiebuffer voor 15 minuten per bad. De strips worden daarna geanalyseerd op 2D SDS-PAGE-gels. Leg elke strip op een precast gel met het passende molecuulgewicht.Polyacrylamide voor het eiwit van belang. Breng de gels vervolgens over op een NITROCELLULOSE PVDF-membraan en analyseer deze met antilichamen volgens de ontwikkeling van dit protocol. Drie verschillende lyses.Buffers werden getest. Ten eerste werd een veelgebruikte biochemische en moleculaire biologiebuffer getest: Tris SDS.Tris SDS vertoonde een slechtere resolutie in vergelijking met een andere geteste buffer, UTS. De derde buffer werd uitgesloten omdat er geen testbare monsters mee konden worden bereid. Vervolgens werden de proteomen van de menselijke en muizenhersenen onderzocht.Monsters van de menselijke controle-cortex en monsters van de ad-cortex werden vergeleken. Muizenherseneiwitten van muizen met AD-achtige tau-pathologie werden eveneens bekeken vanuit het menselijke monster. SCI twee werd onafhankelijk bekeken, evenals S SI drie en sci vijf voor elke D. De hoge spotresolutie maakte de uitlijning eenvoudig.Kwalitatieve mini-2D-analyse werd gebruikt om posttranslationele modificaties te onderzoeken; een geligamenteerd alpha-synucleïne in vetweefsel vertoonde een normaal profiel, maar werd ook aangetroffen als een dimeer, gemarkeerd met een asterisk. Pijlen geven aan waar alpha-synucleïne werd aangetroffen. Ubiquitineerd amyloid-precursorproteïne werd eveneens geanalyseerd via mini-2D.Sporadische AD werd vergeleken met familiale AD. Bij familiale AD zijn de concentraties van bèta-amyloïde 1-42 en ISO-varianten lager, omdat liga-vormen werden aangetroffen bij 8 kilodalton. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het proteoom bestudeerd kan worden om complexe monsters te vergelijken door eiwitexpressiemodificaties te meten.

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De identificatie van moleculen en routes die synaptische plasticiteit en geheugen beheersen, is nog steeds een grote uitdaging in de neurowetenschappen. Hier wordt een workflow beschreven die zich richt op de relatieve kwantificering van synaptische eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij de moleculaire reorganisatie van synapsen tijdens het leren en het consolideren van geheugen in een auditief leerparadijm.

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Hier presenteren we een twee-dimensionale gelelektroforese (2DE) dat is gekoppeld aan massaspectrometrie (MS) te scheiden en te identificeren menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom, waarin een goede en reproduceerbare 2DE patroon. Veel eiwitten worden bij elke 2DE plek waargenomen bij het analyseren van complexe kanker Proteoom met het gebruik van hoog-gevoeligheids MS.

Twee-dimensionale gelelektroforese gekoppeld aan massaspectrometrie methoden voor een analyse van menselijke hypofyse adenoom weefsel Proteoom

Hier beschrijven we een kwantitatieve benadering bij de vaststelling van de verdeling van een synaptic eiwit ten opzichte van een marker eiwit met immunofluorescentie kleuring, confocal microscopie en computer-gebaseerde analyse.

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Deze methode beschrijft een robuuste en reproduceerbare aanpak voor het vergelijken van eiwitniveaus in verschillende weefsels en bij verschillende ontwikkelings timepoints met behulp van een kwantitatieve westelijke bevlekkende standaardbenadering.

Robuuste vergelijking van eiwitniveaus over weefsels en in de gehele ontwikkeling met behulp van gestandaardiseerde kwantitatieve westelijke bevlekken

Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.

Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten

Het protocol is bedoeld om het gebruik van een triple quadrupole mass spectrometer voor Multiple Reaction Monitoring (MRM) van eiwitten uit klinische monsters in te voeren. We hebben een systematische workflow voorzien, van monstervoorbereiding tot gegevensanalyse voor klinische monsters met alle nodige voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen.

Kwantitatieve Proteomics Workflow met behulp van multiple reaction monitoring gebaseerde detectie van eiwitten uit menselijk hersenweefsel

Deze biochemische zuiveringsmethode met op massaspectrometrie gebaseerde proteomische analyse vergemakkelijkt de robuuste karakterisering van amyloïde fibrilkernen, wat de identificatie van doelen voor het voorkomen van de ziekte van Alzheimer kan versnellen.

Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

In dit artikel onderzoeken we de effecten van Theta-Burst TMS stimulatie op de corticale plasticiteit bij personen die lijden aan fragiele-X-syndroom en mensen in het autistisch spectrum.

TMS: Met behulp van de Theta-Burst protocol bij Mechasnism van plasticiteit Ontdek bij mensen met fragiele X syndroom en autisme

Leer een betrouwbaar protocol voor eiwitextractie uit menselijk en muizenhersenweefsel voor proteomics-analyse. Deze methode combineert 2D-DIGE en mini 2DE immunoblotting voor identificatie van post-translatiemodificaties.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting (Video) | JoVE Journal

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Meer video's verkennen