Name: Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Leer een 3D-invasieassay voor borstkankercellen met behulp van een basementmembraanmatrix en fluorescentiemicroscopie. Deze methode bootst het in vivo milieu nauwkeuriger na dan traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd uitgevoerd met fondsen voor M.B. van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR) subsidie MOP 107972. M.B. is een ontvanger van een CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is een ontvanger van beurzen van de Translational Breast Cancer Research Unit en het CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is ontvanger van beurzen van de Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program en van het CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.

1. Driedimensionale Cultuur van borstkankercellen in Basement Membrane Matrix (De Verankering Techniek) <ol><li> Omgaan Matrigel basaal membraan matrix: Ontdooi op ijs overnacht bij 4 ° C. Basaalmembraan matrix vloeibaar is bij lage temperatuur, maar stolt op kamertemperatuur. Houd basale membraan matrix op ijs (figuren 1A-B). </li><li> Bedek de Confocale No.1 glazen bodem schaal met 50 gl basaalmembraan matrix door middel van verspreiding van de matrix met de punt van een Pipetman P-200 in een spiraalvormig patroon (figuur 1C). Wees voorzichtig bij het verspreiden van het basaal membraan matrix om de vorming van luchtbellen te voorkomen. Ook voorkomen dat de verspreiding van de matrix dicht bij de randen van de glazen bodem gerecht meniscus te voorkomen. Als onervaren handling basaal membraan matrix, dan voorgekoeld de schotel, P-200 Pipetman en pipetten kan op ijs (alternatief gedurende de nacht in een koelkast bij 4 ° C). Deze stap aanbiedingenextra tijd om het basaal membraan matrix uitspreiden voor het stollen. Zet de schaal (n) in een cel incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten aan de basale membraan matrix staat te stollen (figuur 1D). </li><li> Terwijl de matrix ondergaat stollen, trypsinize een 70-80% confluent 100-mm plaat van cellen. Wanneer de cellen eenmaal zijn begonnen tillen van de plaat, resuspendeer ze in 10 ml RPMI 1640 medium dat 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), de trypsine (figuur 1E) inactiveren. Daarna brengt de geresuspendeerde cellen in een 15 ml conische buis (figuur 1F). </li><li> Draai de cellen (aanwezig in conische buis) bij 100 xg gedurende 3 minuten in een specifieke celkweek centrifuge (fig. 1G-H). </li><li> Terwijl de cellen worden afgedraaid, aliquot 50 pi matrix in een 1 ml microcentrifugebuis (let op: wordt elke glazen bodem schaal toegewezen een microcentrifugebuisje, vandaar, indienhet experiment vereist 3 gerechten, dan volgt daaruit dat 3 microcentrifugebuizen nodig ook), en plaats de buis vervolgens op ijs (Figuur 1B). </li><li> Zuig het medium van de conische buis uit stap 1.4, terwijl het verlaten van de pellet ongestoord (Figuur 1I). Resuspendeer cellen (die zijn gecentrifugeerd) in 1 ml FBS aangevuld RPMI-medium (fig. 1J). </li><li> Zodra de cellen geteld met een hemocytometer (fig. 1K), of een cel deeltjesteller aliquot 2,5 x 10 4 cellen in de microcentrifugebuis en het af met geschikte media om totaal volume van 50 pl (Figuur 1L) te verkrijgen. </li><li> Meng de cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 pi (figuur 1 M). </li><li> Voorzichtig plaat 100 pl van de matrix: cel mengsel uit stap 1.8 op de solidified basaal membraan-matrix gecoate schaal van stap 1.2 (figuur 1 N). Hierdoor kunnen cellen worden ingebed in basaalmembraan matrix. </li><li> Breng de schaal (sen) in de celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) en laat de matrix: celmengsel stollen ten minste 30 minuten. </li><li> Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS aangevuld RPMI-media om de schaal (figuur 1O) en neem het gerecht terug de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment (Figuur 1P). </li><li> Opnieuw media elke dag gedurende 5 dagen (of per vereist voor een test, de duur van de test voor MDA-MB-231 cellen 5 dagen lang). </li><li> Met behulp van een lichtmicroscoop, neem differentieel interferentie contrast (DIC) beelden van de MDA-MB-231 kolonies gesuspendeerd in basaal membraan matrix (figuur 3A). Afbeelding 20 representatieve gebieden op 10X doel een keer per dagvoor vijf dagen naar kolonie morfogenese (figuur 3C) te bepalen. </li><li> Analyseer beelden blindelings naar cel kolonie gestraalde vorming (Figuur 3B) te bepalen. Een kolonie wordt geacht stellaatcellen als een of meer projecties van de bolvormige cellen worden waargenomen. Het percentage invasieve gestraalde kolonies te bepalen, verdeel het aantal gestraalde kolonies door het totaal aantal celkolonies per verworven imago, en dan het gemiddelde van de gestraalde kolonies percentages van de 20 beelden voor elke dag. </li></ol><img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1. Driedimensionale cultuur van MDA-MB-231 borstkankercellen in basaal membraan matrix (de inbedding techniek). AB) Een schematische weergave van de experimentele opstelling (uitgevoerd in de zuurkast). C) Het goed van de glazen bodem schaal gecoat50 ui basaalmembraan matrix. D) Schotel (sen) in een celkweek incubator (bij 37 ° C met 5% CO2) aan de matrix toe te stollen ten minste 30 minuten. E) F Cellen werden getrypsiniseerd. ) Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in een 15 ml conische buis. GH) cellen (aanwezig in conische buis) werden gecentrifugeerd bij 100 xg gedurende 3 minuten in een weefselkweek centrifuge. I) celpellet. J) cellen (die zijn gecentrifugeerd) werden geresuspendeerd in 1 ml FBS-medium aangevuld RPMI. K) cellen werden geteld met een hemocytometer. L) 2,5 x 10 4 cellen verdeeld in de microcentrifugebuis en afgewerkt met geschikte media om totaal volume van 50 ui te verkrijgen. M ) Meng cellen van stap 1.7 (25.000 cellen in 50 ul) met de matrix bevattende microcentrifugebuis van stap 1.5 in een 1:1 verhouding; uiteindelijke volume zal 100 μ.; L N) plaat voorzichtig 100 pi van de matrix: cel mengsel van stap 8 op de gestolde matrix-gecoate schaal van stap 1.2 O) Zodra de matrix: celmengsel is gestold, voeg 2 ml FBS-aangevuld RPMI media. de schotel. P) Plaats de schaal in de incubator waar deze wordt opgeslagen voor de rest van het experiment. 2. Onderzoek van morfogene Kenmerken van 3D Culturen met immunofluorescentie <ol><li> Stel een ijs lade koude fosfaat gebufferde oplossing (PBS), 20% aceton: 80% methanol (fixeeroplossing), en 3% runderserumalbumine (BSA; blokkerende oplossing) (Figuur 2A) voordat de schaal (es) uit de incubator. </li><li> Zet de schaal (sen) op het ijs lade en zuig media, vervolgens 3x wassen met 2 ml koude PBS (figuur 2B). </li><li> Zodra de laatste PBS was wordt opgezogen, voeg 2 ml 20% aceton: 80% methanol-oplossing in de schaal (es) (figuur 2C </strong&gt;) aan de cellen gedurende 20 minuten vast bij 4 ° C (op ijs of in de koelkast) (Figuur 2D). </li><li> Zodra de 20 min fixatie wordt beëindigd, brengt de schotels terug op kamertemperatuur zuig het fixeermiddel en vervolgens 3x wassen met PBS. Zodra de uiteindelijke PBS-wassing wordt afgezogen, 2 ml van 3% BSA om de schotel (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2E). </li><li> Gedurende de blokkeringsperiode verdunningen bereiden van primaire (laminine V 1:100) en secundaire antilichamen (op geschikte verdunning) opgelost in 3% runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer. Let op: 400-500 pi de &#39;BSA + primaire antilichaam-oplossing direct te worden toegevoegd aan de matrix: celmengsel. </li><li> Zodra de 30 min blokkering verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2F). Let geen PBS wast worden uitgevoerd na 30 min blocking periode. </li><li> Na voltooiing van stap 2.6, verwijder de &#39;BSA + primaire antilichaam&#39; oplossing, en was 3x met PBS. </li><li> Voeg het tweede antilichaam opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) direct op de matrix: celmengsel, omvatten de gerechten en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (Figuur 2G). </li><li> Haal de &#39;BSA + secundair antilichaam&#39; oplossing, en was 3x met PBS. </li><li> Voeg 2 ml van Hoechst 33258 (1:10.000), opgelost in PBS voor kernen kleuring, en incubeer gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie (of bedekken met een ondoorzichtige container photobleaching beperken) (figuur 2H). </li><li> Zodra de 5 min incubatie met Hoechst 33258t zijn verstreken, was het gerecht (es) 5x met PBS. </li><li> Voeg fixeermiddel direct op de matrix: celmengsel in de confocale schaal dek met glazen dekglaasje voorzichtig voorkomen induceren verstoringen van de integriteit van de kolonies in de basaalmembraan matrix: celmengsel (figuur 2I). </li><li> Laat de schaal (n) bij nacht drogen (of 24 uur) bij kamertemperatuur (figuur 2I). Eenmaal droog, kan de schotel (es) worden bewaard bij -20 ° C, maar het wordt ten zeerste aanbevolen dat zij zo snel mogelijk moet worden afgebeeld. </li><li> Acquire beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop met geschikte laser golflengten van antilichamen gebruikt (figuren 3D-E). </li></ol><img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51341/51341fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2. Onderzoek van 3D culturen met immunofluorescentie. . A) Een schema van de experimentele opstelling B) Schotel (es) geplaatst op het ijs dienblad en media opgezogen; Vervolgens werden de cellen driemaal gewassen met 2 ml koude PBS C) 2 ml 20% aceton:. 80% methanoloplossing toegevoegd in de schaal (sen) D) Bevestig de cellen.20 min bij 4 ° C (op ijs of in een koelkast). E) 2 ml 3% BSA toegevoegd aan de schaal (n) bij blok ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. F) Na de 30 min blokkeren verstreken, voeg de primaire antilichamen en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur G) Secundaire antilichamen opgelost in 3% BSA (op geschikte verdunning) werden direct toegevoegd aan de basale membraan matrix. celmengsel; . Vervolgens gerechten bedekt en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur H) 2 ml Hoechst (1:10.000, opgelost in PBS) toegevoegd aan de dishe (sen) en cellen geïncubeerd gedurende 5 minuten onder aluminiumfolie I) fixeermiddel rechtstreeks toegevoegd. op de matrix: cel mengsel in de confocale schotel en de schotel is bedekt met glas dekglaasje. Schotel (n) te drogen overnacht (of 24 uur) bij kamertemperatuur geroerd.

<ol><li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res. 752, 10-24 (2013).</li>
<li>Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+basement+membrane+cultures+to+model+oncogene-induced+changes+in+mammary+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).</li>
<li>Eccles, S. A., Welch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+recent+discoveries+and+novel+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies.</a> Lancet. 369, 1742-1757 (2007).</li>
<li>Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+invasion+by+tumour+cells%3A+a+focus+on+MT1-MMP+trafficking+to+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.</a> Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).</li>
<li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Profiling+of+Cellular+Invasion+in+3D+Cell+Culture+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+human+breast+epithelial+cells%3A+the+how+and+the+why%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why.</a> Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Debnath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+apoptosis+in+creating+and+maintaining+luminal+space+within+normal+and+oncogene-expressing+mammary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini.</a> Cell. 111, 29-40 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+culture+models+to+study+mechanisms+governing+apoptosis+in+normal+and+malignant+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).</li>
<li>Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+functionally+relevant+cell+culture+model+of+progressive+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).</li>
<li>Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+novel+3D+culture+model+to+elucidate+the+role+of+mesothelial+cells%2C+fibroblasts+and+extra-cellular+matrices+on+adhesion+and+invasion+of+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum.</a> Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+leukocytes+and+macrophages+of+various+phenotypes+have+distinct+abilities+to+form+podosomes+and+to+migrate+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments.</a> European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Impact+of+2D+and+3D+Fibroblast+Cultures+on+In+Vitro+Breast+Cancer+Models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models.</a> PLoS One. , (2013).</li>
<li>Li, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrestin%2FRal+signaling+regulates+lysophosphatidic+acid-mediated+migration+and+invasion+of+human+breast+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells.</a> Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).</li>
<li>Zajac, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR54+%28KISS1R%29+transactivates+EGFR+to+promote+breast+cancer+cell+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Underwood, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+of+MCF-10A+acini%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure of MCF-10A acini.</a> J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).</li>
<li>Lelievre, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+phenotype+depends+on+reciprocal+interactions+between+the+extracellular+matrix+and+the+structural+organization+of+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta4+integrin-dependent+formation+of+polarized+three-dimensional+architecture+confers+resistance+to+apoptosis+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium.</a> Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).</li>
<li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+Induces+Invasiveness+of+Estrogen+Receptor-Negative+Human+Mammary+Epithelial+and+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells.</a> Endocrinology. , 1999-2014 (2013).</li>
<li>Alemayehu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Arrestin2+regulates+lysophosphatidic+acid-induced+human+breast+tumor+cell+migration+and+invasion+via+Rap1+and+IQGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1.</a> PLoS One. , (2013).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

De ontwikkeling van 3D celkweektechnieken heeft onderzoekers toegestaan ​​om de transformatie van borst epitheelcellen bestuderen, zodat we de dramatische morfologische veranderingen zichtbaar. Naast het analyseren celinvasie, kan het een of multicellulaire sferoïden mammaire epitheliale worden om veranderingen in cellulaire adhesie, proliferatie, maat en basale-apicale polariteit beoordelen. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden waarbij de cellen bedekt met ECM 8, onze methode sluit de cellen in EC...

Migratie en invasie van individuele of collectieve cellen zijn twee kenmerken van kanker, en die nodig zijn voor de metastatische verspreiding van kankercellen 1-4. Het vermogen van kanker cellen om metastase te starten hangt af van hun vermogen om te migreren en binnen te dringen in het naburige weefsel met behulp invadopodia aan de basale membraan van de cellen af ​​te breken. Invadopodia zijn dynamisch actine-rijke matrixafbraak uitsteeksels die afbraak van de extracellulaire matrix mogelijk door het vrijkomen van matrix-afbrekende proteasen 5. Kankercel invasie omvat de afbraak van de matrix gevolgd door de migratie van kankercellen en dit gepaard met een reorganisatie van de driedimensionale (3D) matrix milieu 2. Zo te dringen door de matrix, een cel moet zijn vorm veranderen en interactie met de extracellulaire matrix (ECM) 2. Het onderhoud van het borstweefsel integriteit afhankelijk van strak controlled weefselarchitectuur aangezien cel-ECM en cel-cel adhesie verbindingen beïnvloeden genexpressie en verstoring van epitheliale polariteit kan leiden tot het ontstaan ​​van kanker 6-10. Echter, de meeste in vitro migratie en invasie assays zoals transwell kamer assays of wond krassen testen zijn tweedimensionale (2D) en bijgevolg deze verwaarlozing de wisselwerkingen tussen cellen en hun onmiddellijke omgeving 3,6,8,11-14. Aanzienlijke morfologische en functionele diversiteit, waaronder variaties in cellulaire morfologie, celdifferentiatie, cel-matrix adhesie en genexpressie patronen zijn ontdekt door het kweken van cellen in 3D culturen die vaak ontbreken in 2D-assays 2,6,8,11. Aldus gebruikt 3D assays aanzienlijk gunstig indient een fysiologische in vivo toestand, waardoor een betere vertaling baanbrekende bevindingen basisonderzoek naar de kliniek 6-10. Er moet echter worden opgemerktOndanks de vele voordelen die het gebruik van 3D culturen, dit model niet alle van de complexiteit van de in vivo tumormicromilieu dat verschillende celtypen omvat vangen. Het is echter mogelijk om stromale cellen nemen in de 3D-modellen (bijv. fibroblasten, leukocyten en macrofagen) het effect van tumor-stromale interacties over kanker celadhesie en invasie 15-17 bestuderen. Borst epitheliale cellen in kweek groeien het meest effectief wanneer ECM eiwitten zoals laminine en collageen aanwezig zijn. Met deze bekende, is een commercieel verkrijgbaar mengsel matrix afgeleid van Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muriene en staat bekend als Matrigel basaalmembraan matrix 2,8. Een aantal technieken zijn ingesteld om epitheelcellen 3D kolonies groeien basaalmembraan matrix 2,8. De 3D basale membraan matrix model effectief is voor het vaststellen van zowel maligne en niet-maligne borstcelgroei, lijkt op wat er gebeurt in de in vivo omgeving 18,19. MCF10A cellen niet-maligne mamma epitheelcellen. Wanneer gekweekt in basaalmembraan matrix deze cellen vertonen in vivo eigenschappen van normale borstcellen ondergaan gecontroleerde celproliferatie, polarisatie en apoptose het lumen ruimte 8,12,20 stellen. Ook het uiterlijk van celkernen van MCF10A cellen die acini in 3D culturen dichter op die van mammaire epitheelcellen in weefsel dan gekweekt in monolaag 21. Studies van Bissell en collega&#39;s waren de eerste om te tonen dat kwaadaardige borst cellen kunnen worden onderscheiden van niet-kwaadaardige borstcellen wanneer gekweekt in een laminine-rijke omgeving, aangezien de kwaadaardige cellen vertonen een zeer ongeorganiseerd fenotype, verhoogde proliferatie, verminderde cel- celadhesie, verhoogde expressie van mesenchymale markers en een toename van het aantal invasieve structuur gevormd 3,6,22. Afwijkingen van de cel milieu tumorvorming 20 beïnvloeden. De 3D kweekmethode kan worden gebruikt om effectief bestuderen communicatie die plaatsvindt tussen de tumorcellen en hun omgeving en bepalen hoe eiwitexpressie invloeden communicatie 14,20,21,23. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie voor MDA-MB-231 borstkankercellen groeien in 3D culturen invasiveness te analyseren, en om het verlies van epitheliale morfologie met een epitheliale marker laminin, een onderdeel van de cel basale membraan 18,19,24 bestuderen, 25. De voorschriften bieden de mogelijkheid om nauwkeurig en reproduceerbaar kwantificeren stervormige (invasieve) structuurvorming door een invasieve kankercel en niet beperkend voor de gemeenschappelijke borstkankercellijnen (zoals MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 of T47D ). Zo kan deze bepaling als platform voor het evalueren hoe eiwitexpressie in cellen of behandeling met pro-of anti-invasieve verbindingen regelen extracellulaire matrix degradatie, door een of meerdere cellen.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>VWR</td><td>CA10011-700</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>100-mm culture dish BD353003</td><td>VWR</td><td>CABD353003</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>15 ml Falcon tube</td><td>VWR</td><td>CA21008-918</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>1 ml filtered tips</td><td>VWR</td><td>10011-350</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>200 &#956;l filtered tips</td><td>VWR</td><td>22234-016</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>20 &#956;l filtered tips</td><td>VWR</td><td>22234-008</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td>Voorgekoeld voor gebruik</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>BioShop</td><td>ALB003.100</td><td>Gebruikt bij 3% voor IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;A11029</td><td>1:250 voor IF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp;A11011</td><td>1:1,200 voor IF</td></tr><tr><td>Anti-Beta-Catenin&nbsp;</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610153</td><td>Muis-monoklonaal; Gebruikt bij 1:100 voor IF</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td>Gebruikt bij 10% (v/v)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg&frasl;ml Solution in Water</td><td>Life Technologies</td><td>H3569</td><td>Gebruikt bij 0.1% (1:10.000 verdunning)</td></tr><tr><td>InVivo Analyzer Suite&nbsp;</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td>Gebruikt voor 3D-cultuurbeeldvorming (DIC-beelden bij 10X en 40X)</td></tr><tr><td>Kisspeptin-10 (KP-10)</td><td>EZ Biolabs</td><td>PT0512100601</td><td>Gebruikt bij 100 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Laminin&nbsp;</td><td>Cedarlane</td><td>AB19012(CH)</td><td>Konijn-polyklonaal volledige lengte mens; Gebruikt bij 1:100 voor IF</td></tr><tr><td>LSM-510 META laser scanning microscope&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Gebruikt bij 63X objectief; olie-immersielens</td></tr><tr><td>Matrigel phenol red free (BD356237)</td><td>VWR</td><td>CACB356237</td><td>&nbsp;Lot No.2180819; 10,4 mg/ml</td></tr><tr><td>Olympus IX-81 microscope&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>Gebruikt voor 3D-cultuurbeeldvorming (DIC-beelden bij 10X en 40X)</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Antibioticum (toegevoegd aan media; gebruikt bij 0,01%)</td></tr><tr><td>10 ml pipette</td><td>VWR</td><td>CA53300-523</td><td>Steriele, wegwerp</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium with Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>Gebruikt voor het kweken van MDA-MB-231-cellen</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td>Gebruikt om MDA-MB-231-cellen te trypsiniseren</td></tr><tr><td>MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)</td><td>Lonza</td><td>CC-3150</td><td>Gebruikt voor het kweken van MCF10A-cellen</td></tr></tbody></table>

kwantificering van de breast cancer cell invasiviteit met een drie-dimensionale (3d) model

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

Het is nu bekend dat de cellen en weefsels micro-omgeving zijn kritische toezichthouders beïnvloeden tumor initiatie en progressie. Bovendien heeft de extracellulaire matrix (ECM) is aangetoond dat een kritische regulator van celgedrag in cultuur en homeostase in vivo. De huidige benadering van het kweken van cellen op tweedimensionale (2D), kunststof oppervlakken leidt tot verstoring en verlies van complexe interacties tussen cellen en hun micromilieu. Door het gebruik van driedimensionale (3D) cultuur assays, worden de voorwaarden voor cel-interactie micro vastgesteld lijkt de in vivo micro-omgeving. Dit artikel geeft een gedetailleerde methodologie om borstkanker cellen groeien in een 3D basaal membraan eiwit matrix, tekenend is voor het potentieel van de 3D-cultuur in de beoordeling van de cel invasie in de omgeving. Daarnaast bespreken we hoe deze 3D assays hebben de potentie om het verlies van signalering Molec onderzochtules dat epitheliale morfologie reguleren door immuunkleuring procedures. Deze studies helpen belangrijke mechanistische informatie te verkrijgen in de processen reguleren invasie, vereist voor de verspreiding van borstkanker.

Een voorbeeld van de MDA-MB-231-cellen invasie in 3D matrix wordt getoond in figuur 3C. De cellen zijn ingebed in matrix (dag 1), en start de vorming invasief (stervormige) structuren op dag 3, en volledig binnendringen in de matrix tegen Dag 5 (figuur 3C). Het aantal gestraalde gevormde koloniën geteld, en uitgedrukt als een percentage van het totale aantal kolonies per schaal (invasieve en niet-invasief). Bovendien, aangezien de metingen dagelijks uitgevoerd gedurende vijf dagen, de m...

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Het algemene doel van de volgende procedure is om het invasieve vermogen van kankercellen te evalueren met behulp van een driedimensionale invasie-assay. Dit wordt bereikt door kankercellen eerst te kweken in een basaalmembraanmatrix. De cellulaire invasie van de matrix wordt vervolgens gedurende vijf of meer dagen waargenomen via lichtmicroscopie.In de laatste stap worden de cellen gelabeld met fluorescerende antilichamen voor de lokalisatie van de eiwitten van belang. Uiteindelijk kunnen de snelheid van de invasie van kankercellen en de resulterende veranderingen in eiwitexpressie worden geanalyseerd via immunofluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de Transwell-kamer-invasieassay, is dat de 3D major gel-invasieassay de in vivo-omgeving waarin kanker groeit beter nabootst.De implicatie van deze techniek is gericht op cancertherapie, waarbij nieuwe eiwitten kunnen worden geïdentificeerd die betrokken zijn bij kankerinvasie en metastase. Plaats vóór aanvang van de kweekprocedure de basement membrane matrix, een P 200 pipette en pipetpunten overnacht op ijs bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag de

quantification-breast-cancer-cell-invasiveness-using-three

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een test om kwantitatief te meten Transforming Growth Factor (TGF)-β-geïnduceerde invasie in 3-dimensionale collageen gels is beschreven. Deze test maakt gebruik van de MCF10A reeks van cel-lijnen, die verschillende stadia van de ontwikkeling van borstkanker te vertegenwoordigen. Deze methode kan worden vastgesteld om te worden gebruikt met andere cellijnen en kan worden gebruikt om andere potentiële activatoren of inhibitoren van een invasie te onderzoeken.

Sferoïde Assay voor TGF-β-geïnduceerde Invasion Measure

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

Deze video biedt een gedetailleerde methodologie om borstkankercellen te laten groeien in een 3D-keldermembraaneiwitmatrix, die het potentieel van 3D-cultuur illustreert bij de beoordeling van celinvasie in de omgeving.

3D-cultuur keldermembraantest: cultiveren van kankercellen op 3D-keldermembraaneiwitmatrix om celinvasie te bestuderen

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

We demonstreren een methode om 3D-surrogaten voor borstkanker te genereren, die kunnen worden gekweekt met behulp van een perfusiebioreactorsysteem om zuurstof en voedingsstoffen af te geven. Na de groei worden surrogaten gefixeerd en verwerkt tot paraffine voor evaluatie van parameters van belang. De evaluatie van één van deze parameters, celdichtheid, wordt uitgelegd.

Voorbereiding en analyse van<em&gt; In Vitro</em&gt; Three Dimensional mammacarcinoom Surrogates

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.

Time-Resolved Fluorescentie Beeldvorming en analyse van kankercelinvasie in het 3D Spheroid Model

Leer een 3D-invasieassay voor borstkankercellen met behulp van een basementmembraanmatrix en fluorescentiemicroscopie. Deze methode bootst het in vivo milieu nauwkeuriger na dan traditionele technieken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Meer video's verkennen