Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Het algemene doel van de volgende procedure is om de invasieve capaciteit van kankercellen te evalueren met behulp van een driedimensionale invasie-assay. Dit wordt bereikt door eerst kankercellen te kweken in een basement membraanmatrix. De cellulaire invasie van de matrix wordt vervolgens gedurende vijf of meer dagen waargenomen via lichtmicroscopie.

In de laatste stap worden de cellen gelabeld met fluorescerende antilichamen voor lokalisatie van de eiwitten van belang. Uiteindelijk kan de snelheid van kankercelinvasie en de resulterende veranderingen in eiwitexpressie worden geanalyseerd door immunofluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de Transwell-kamerinvasie-assay, is dat de 3D-major gel-invasie-assay beter de in-vivo omgeving nabootst waarin kanker zich ontwikkelt.

De implicatie van deze techniek is gericht op kankertherapie, waarbij nieuwe eiwitten kunnen worden geïdentificeerd in studie, die betrokken zijn bij kankerinvasie en metastase. Voordat u begint met de kweekprocedure, plaatst u de basement membraanmatrix met een P 200 pipet en pipettetips een nacht op ijs bij vier graden Celsius. De volgende dag gebruikt u de punt van de ijskoude 200 microliterpipet om 50 microliter van de matrix in een spiraalpatroon over de bodem van een confocale nummer een glazen bodemschaal te verspreiden.

Plaats vervolgens de schaal in een cellenkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende ten minste 30 minuten terwijl de matrix wordt gesolidificeerd. Probeer cellen, een 70 tot 80% confluente 100 millimeter plaat cellen zodra de cellen beginnen te loslaten. Deactiveer de trypsine met 10 milliliter medium en breng vervolgens de celsuspensie over in een 15 milliliter kegelvormige buis. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 100 Gs en vier graden Celsius terwijl de cellen naar beneden draaien.

Pipet 50 microliter matrix in één enkele milliliter microcentrifugebuis per schaal van basement membraanmatrix en plaats de buizen op ijs wanneer de cellen klaar zijn met draaien. Aaspirateer de supernatant zonder het pellet te verstoren en resuspendeer vervolgens. Suspensie de cellen in één milliliter media en tel ze vervolgens.

Breng 2,5 keer 10 tot de vierde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis en vul de celsuspensie aan met media tot een eindvolume van 50 microliter. Voeg vervolgens de 50 microliter ijskoude basement membraanmatrix toe aan de cellen in een een-op-een verhouding voor een eindvolume van 100 microliter. Plateer de matrix naar celmixtuur voorzichtig op de gesolidificeerde basement membraanmatrix en laat de cellen in de cellenkweekincubator ingebed raken in de matrix.

Na 30 minuten bedekt u de matrix met twee milliliter media en plaatst u de schaal terug in de incubator, waarbij het medium elke dag wordt ververst gedurende de duur van het experiment. Gebruik de 10 x objectief van een lichtmicroscoop eenmaal per dag gedurende de duur van het experiment om 20 differentiële interferentie te nemen. Contrastafbeeldingen van de kolonies gesuspendeerd in de basement membraanmatrix. Analyseer de beelden blind om de stellaire vorming van de celkolonie te bepalen.

Een kolonie wordt beschouwd als stellair als er een of meer uitsteeksels van het steroid van cellen worden waargenomen. Om de morfogene eigenschappen van de 3D-kolonies te onderzoeken, verwijdert u de cellen uit de incubator en plaatst u ze op een schaal met ijs. Aaspirateer het medium en was vervolgens de kolonie drie keer met twee milliliter koude PBS.

Na de laatste wassing, fixeert u de cellen in twee milliliter van een 20% aceton, 80% methanol oplossing gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius en brengt u de schalen vervolgens terug naar kamertemperatuur. Zodra de basement membraanmatrix op kamertemperatuur is, aspireert u het fixeermiddel en wast u de plaat drie keer met PBS zoals net is aangetoond. Na de laatste wassing, blokkeert u alle niet-specifieke binding op de cellen met twee milliliter 3% BSA gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.

Vervolgens incubeert u de cellen in de primaire antilichamen van belang, verdund in 3% BSA bij kamertemperatuur. Na een uur verwijdert u de primaire antilichaamoplossing na het wegspoelen van het ongebonden primaire antilichaam drie keer met PBS, voegt u het secundaire antilichaam opgelost in 3% BSA toe in de juiste verdunning en incubeert u de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Na het wegspoelen van het ongebonden secundaire antilichaam met PBS, kleurt u de kernen van de cellen in twee milliliter van hext 3, 3, 2, 5 8 in PBS gedurende vijf minuten in het donker.

Was vervolgens het ongebonden hext vijf keer van de cellen met PBS. Na de vijfde wassing, brengt u montagemedium direct aan op de matrix naar celmixtuur en bedekt u het montagemedium voorzichtig met een glazen dekglas om eventuele verstoringen van de integriteit van de basement membraanmatrix naar celmixtuur te voorkomen. Droog de schaal een nacht bij kamertemperatuur en verwerf vervolgens beelden met een fluorescerende microscoop bij de juiste lasergolflengten voor de antilichamen die in deze afbeeldingen worden gebruikt.

MDA MB 2 3 1 cellen die een 3D-matrix binnendringen, worden geïllustreerd. De cellen die op dag één in de matrix worden ingebed, begonnen op dag drie invasieve stellaire structuren te vormen. Op dag vijf kon een volledige invasie van de matrix worden waargenomen.

Het aantal stellaire kolonies dat werd gevormd, werd vervolgens geteld en uitgedrukt als een percentage van het totale aantal invasieve en niet-invasieve kolonies per schaal. Bovendien, aangezien de metingen gedurende vijf dagen dagelijks werden voltooid, kon de invasiesnelheid ook worden geëvalueerd in deze immunofluorescentiebeelden. Representatieve invasieve stellaire kolonies van MDA MB 2 3 1 cellen die een verlies van membraanintegriteit en diffuse lokalisatie van het basement membraaneiwit laminine vijf vertonen, worden in scherp contrast getoond met wat wordt waargenomen in de MDA MB 2 31 borstkankercellen.