Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Het algemene doel van de volgende procedure is om het invasieve vermogen van kankercellen te evalueren met behulp van een driedimensionale invasie-assay. Dit wordt bereikt door kankercellen eerst te kweken in een basaalmembraanmatrix. De cellulaire invasie van de matrix wordt vervolgens gedurende vijf of meer dagen waargenomen via lichtmicroscopie.

In de laatste stap worden de cellen gelabeld met fluorescerende antilichamen voor de lokalisatie van de eiwitten van belang. Uiteindelijk kunnen de snelheid van de invasie van kankercellen en de resulterende veranderingen in eiwitexpressie worden geanalyseerd via immunofluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande technieken, zoals de Transwell-kamer-invasieassay, is dat de 3D major gel-invasieassay de in vivo-omgeving waarin kanker groeit beter nabootst.

De implicatie van deze techniek is gericht op cancertherapie, waarbij nieuwe eiwitten kunnen worden geïdentificeerd die betrokken zijn bij kankerinvasie en metastase. Plaats vóór aanvang van de kweekprocedure de basement membrane matrix, een P 200 pipette en pipetpunten overnacht op ijs bij vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag de tip van de ijskoude 200 µL pipette om 50 µL van de matrix in een spiraalvormig patroon over de bodem van een confocale number one glazen bodemschaal te verspreiden.

Plaats de schaal vervolgens in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten terwijl de matrix stolt. Trypsiniseer een 100 mm plaat met cellen die voor 70 tot 80% confluent zijn, zodra de cellen zijn begonnen los te laten. Inactiveer de trypsine met 10 mL medium en breng de celsuspensie vervolgens over in een conische buis van 15 mL. Centrifugeer de cellen gedurende drie minuten bij 100 ×g en 4 °C terwijl de cellen neerslaan.

Verdeel aliquots van 50 µL matrix over één 1 mL microcentrifugebuis per schaal met basaalmembraanmatrix, en plaats de buisjes op ijs zodra de cellen zijn gecentrifugeerd. Aspireer het supernatant zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de cellen vervolgens in 1 mL medium, waarna ze geteld kunnen worden.

Breng 2,5 × 10⁴ cellen over naar een nieuwe microcentrifugebuis en vul de celsuspensie aan met medium tot een eindvolume van 50 µL. Voeg vervolgens 50 µL ijskoud basaalmembraanmatrix toe aan de cellen in een verhouding van één-op-één voor een eindvolume van 100 µL. Plaats het mengsel van matrix en cellen voorzichtig op de gestolde basaalmembraanmatrix en laat de cellen in de celkweekincubator in de matrix inkapselen.

Dek de matrix na 30 minuten af met twee milliliters medium en plaats de schaal terug in de incubator; vervang het medium dagelijks gedurende de looptijd van het experiment. Gebruik dagelijks gedurende het experiment het 10 x objectief van een lichtmicroscoop om 20 differentieel-interferentiecontrastbeelden te maken van de kolonies die gesuspendeerd zijn in de basale membraanmatrix. Analyseer de beelden geblindeerd om de stervormige formatie van de celkolonies te bepalen.

Een kolonie wordt als stervormig beschouwd als er één of meer uitstulpingen van cellen vanuit de kern worden waargenomen. Om de morfogene kenmerken van de 3D-koloniën te onderzoeken, worden de cellen uit de incubator gehaald en op een plateau met ijs geplaatst. Aspireer het medium en was de kolonie vervolgens drie keer met twee milliliters koud PBS.

Fixeer na de laatste wasbeurt de cellen gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius in twee milliliters van een oplossing van 20% acetone en 80% methanol, en laat de schaaltjes vervolgens terugkomen naar kamertemperatuur. Zodra de basale membraanmatrix op kamertemperatuur is, wordt het fixatief afgezogen en wordt de plaat drie keer gewassen met PBS, zoals zojuist is gedemonstreerd. Blokkeer na de laatste wasbeurt elke aspecifieke binding op de cellen met twee milliliters 3% BSA gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur.

Incubeer de cellen vervolgens met de gewenste primaire antilichamen, verdund in 3%BSA bij kamertemperatuur. Verwijder na een uur de primaire antilichaamoplossing door het ongebonden primaire antilichaam drie keer met PBS weg te wassen; voeg vervolgens het secundaire antilichaam toe, opgelost in 3%BSA in de juiste verdunning, en incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Nadat het ongebonden secundaire antilichaam met PBS is weggewassen, worden de celkernen gedurende vijf minuten in het donker gekleurd in twee milliliter hext 3, 3, 2, 5 8 in PBS.

Was vervolgens het ongebonden hext vijf keer met PBS van de cellen af. Voeg na de vijfde wasbeurt direct montage medium toe aan het mengsel van basaalmembraanmatrix en cellen en dek het montage medium voorzichtig af met een glasdekglaasje om verstoringen van de integriteit van het mengsel van basaalmembraanmatrix en cellen te voorkomen. Laat het schaaltje een nacht drogen bij kamertemperatuur en leg vervolgens beelden vast met een fluorescentiemicroscoop bij de juiste lasergolflengten voor de antilichamen die in deze beelden zijn gebruikt.

MDA MB 2 3 1-cellen die een 3D-matrix binnendringen, worden hier geïllustreerd. De cellen werden op dag één in de matrix ingebed en begonnen tegen dag drie invasieve stervormige structuren te vormen. Tegen dag vijf kon een volledige invasie van de matrix worden waargenomen.

Het aantal gevormde stervormige kolonies werd vervolgens geteld en uitgedrukt als een percentage van het totale aantal invasieve en niet-invasieve kolonies per schaaltje. Daarnaast kon, aangezien de metingen dagelijks gedurende vijf dagen werden uitgevoerd, de invasiesnelheid ook worden geëvalueerd in deze immunofluorescente beelden. Representatieve invasieve stervormige kolonies van MDA MB 2 3 1-cellen, die een verlies van membraanintegriteit en diffuse lokalisatie van het basaalmembraaneiwit laminine vijf vertonen, worden getoond in schril contrast met wat wordt waargenomen in de MDA MB 2 31-borstkankercellen.

Laminine vijf was gelokaliseerd in een intacte basaalmembraanlaag die de basale zijde van de onbehandelde non-maligne MCF 10 A-cellen omsloot. Na deze procedure kan co-cultuur met stromale cellen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of kankercellen communiceren met stromale cellen in de micro-omgeving na de ontwikkeling daarvan. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het vakgebied oncologie om kankerinvasie en migratie te bestuderen, beide processen die vereist zijn voor de metastatische verspreiding van kankercellen.