Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor

Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling van C Allergan te beelden met fluorescentie-light sheet-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de light sheet-microscoop op te stellen, die bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een kleine set optomechanische elementen om een light sheet te genereren. De tweede stap van de procedure is het monteren van het embryo.

De laatste stappen zijn het afstellen van het lichtvel op het embryo en het vastleggen van de ontwikkeling ervan. De resultaten kunnen de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten tijdens de ontwikkeling van C. elegans tonen via de analyse van 3D- en time-lapsevideo's. De belangrijkste voordelen van light-sheetmicroscopie ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals confocale microscopie, zijn dat het snellere beeldvorming mogelijk maakt met een lagere fototoxiciteit.

Ten derde kan deze methode inzicht bieden in de ontwikkeling van zeehonden. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals muizen of zebravisjes. De demonstratie van de procedure zal duidelijk zijn.

Shales, een ingenieur uit mijn laboratorium, en Pauline Linac, een ingenieur uit het laboratorium van van. Deze sectie beschrijft de assemblage van de opstelling, en deze kan voor alle experimenten geassembleerd blijven. Zodra de lasers, filters, telescoop en periscoop allemaal op de optische tafel zijn geplaatst, bevestigt u de cilindrische lens om het lichtveld te genereren.

Een andere lens wordt op focus ingesteld. Het brandpunt van het belichtingsdoelstuk moet samenvallen met het object-brandpunt van het detectiedoelstuk. Projecteer nu de straal op de muur of het scherm en verplaats het belichtingsdoelstuk langs de straalas totdat de contouren van de projectie scherp zijn.

Voeg een quad-lijn emissiefilter en een E-M-C-C-D camera toe aan de microscoopopstelling. Bevestig de tweede handmatige translatietrap loodrecht op de eerste. Schroef de assemblage vast aan de bestaande microscooptafel.

Nadat het gestelde cilindrische lens-verlichtingsobjectief is verwijderd, plaatst u de assemblage op de microscoop en zet u de verlichtingsset terug op de tafels. Bevestig de qve-houder op het loodrechte kruispunt van het verlichtingspad en het detectiepad. Controleer nu het lichtveldpaneel.

Vul een glazen cuvet met fluoresceïne-oplossing en plaats deze in de houder op de tafel. Het lichtvel moet zichtbaar zijn. Het moet horizontaal staan en gecentreerd zijn ten opzichte van de detectie-objectieflens.

Verwijder vervolgens de cilindrische lens. Optimaliseer het lichtvel door 3D-translatie van het illuminatie-objectief en neem een afbeelding op om de dikte van het lichtvel te meten. Dit is afhankelijk van de apertuur van de objectieflens.

Vervang vervolgens de cilindrische lens. Snijd eerst een stuk glas van één millimeter dik, met afmetingen van 10 millimeter bij 20 millimeter. Gebruik hiervoor een diamantstift.

Voeg vervolgens 20 µL poly-L-lysine toe aan één zijde en plaats deze, zodra het droog is, naast een tweede objectglas. Voeg in een vaste positie een druppel 5% agar toe en strijk deze glad met het gewicht van een derde objectglas dat erbovenop wordt geplaatst. Nadat de agar is opgedroogd, wordt het derde objectglas verwijderd en wordt het agarpad drie millimeter vanaf de rand van de twee overgebleven objectglazen doorgesneden, boven het objectglas zonder poly-L-lysine.

Verwijder vervolgens het gefixeerde preparaat, waarbij een overschot agar overblijft. Bedek de agar met 20 µL poly-L-lysine en laat dit drogen. Plaats nu GR-wormen in een horlogeglas gevuld met M9-medium onder een dissectiemicroscoop.

Snijd de wormen met een scalpel ter hoogte van de vulva om zo de eieren vrij te maken. Identificeer vervolgens de embryo's in het stadium van interesse en verzamel deze met een microcapillaire pipet. Breng de embryo's over naar de agar-overhang van de voorbereide objectglas, net naast de rand van het objectglas en niet op de rand van de agar.

Lijn vervolgens de embryo's uit met een microcapillaire pipet terwijl de vloeistof wordt verwijderd. Door aspiratie zullen de embryo's aan het polyol-lysine hechten. Het is zeer belangrijk om de embryo's goed te positioneren om een goede opname te verkrijgen, en dit vereist een capillair met de juiste opening.

Als deze te klein is, zullen de embryo's moeilijk vrij te maken zijn. Als deze te groot is, is het lastig om de lekstroom nauwkeurig te beheersen en de embryo's uit te lijnen. Bedek het objectglas met M nine medium in een petrischaal en bevestig onder vergroting dat de embryo's nog aan de agar vastzitten. Bevestig nu het geprepareerde objectglas met embryo's aan de monsterhouder die in een vete past.

De houder is een in-house vervaardigd hulpmiddel dat is ontworpen om op een vete te passen. Bevestig vervolgens de vete aan een piëzo-elektrische tafel en lokaliseer onder brightfield-verlichting een embryo. Start nu het softwarepakket op dat de akoestisch optische tunable filter aanstuurt.

Filter de camera en de tafel. Deze software is intern ontwikkeld, maar de freeware MicroManager kan ook worden gebruikt. Selecteer eerst de laserlijn.

Stel vervolgens de tafel langs de x-as af totdat het lichtveldsignaal op zijn sterkst is. Stel daarna de andere twee dimensies, Y en Z, af totdat de signaal-ruisverhouding optimaal is. Dit moet mogelijk voor elk embryo worden herhaald.

Dit is essentieel om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren voor een goede opname door de vrije fase te vertalen, de ondersteuning en het elimineren van het doelwit wanneer ik enkel de relatie gebruik om een nauwkeurige simulatie van het embryo en het beste contrast te verkrijgen. Neem nu time-lapsebeelden op waarbij de lasersterkte, de belichtingstijd, de gain en het beeldinterval worden ingesteld op basis van het fluorescentieniveau van het embryo en de snelheid van het geanalyseerde biologische proces. Voor Zack.

Bij de beeldvorming werden de afstand tussen de coupes en hun start- en eindposities ingesteld in c elgan die een histon-GFP-construct tot expressie bracht. Er werd een time-lapse-opname van twee uur gemaakt met stacks van 20 coupes, elke 37 seconden vastgelegd. Celdelingen waren duidelijk zichtbaar in een stam die tubuline gefuseerd aan GFP en histon gefuseerd aan m cherry tot expressie bracht. De opnames werden gedurende 16 minuten elke 105 seconden gemaakt.

3D-renderings worden getoond op drie tijdstippen. De mitotische spoelen en gecondenseerde chromosomen zijn duidelijk zichtbaar en gemakkelijk te volgen gedurende de celdelingen. In een derde stam werd APO lipoprotein vit twee gefuseerd met GFP afgebeeld, met mCherry-labeling van het celmembraan.

Gedurende 13 minuten werden elke 27 seconden 10 slice stacks opgenomen. Snelbewegende lipoproteïnedeeltjes waren eenvoudig te volgen. Hier maken we gebruik van de light sheet die met complexere methoden is gegenereerd.

De light sheet kan worden geïmplementeerd om de ruimtelijke resolutie verder te verbeteren.