Name: Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor In Toto Beeldvorming van C. elegans Ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer de opzet van een lichtveldmicroscoop voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's. Deze methode maakt snellere opnames met lagere fototoxiciteit mogelijk dan confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken alle leden van de Lenne en Bertrand laboratoria, met name Olivier Blanc voor software ontwikkeling en Jeremie Capoulade voor discussie. We danken ook de PICsL-IBDM imaging faciliteit, in het bijzonder Claude Moretti en Brice Detailleur voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van ATIP CNRS (naar P.-FL en VB), de Labex INFORM subsidie ​​(naar P.-FL en VB) en een subsidie ​​van Sanofi-Aventis (VB). Wij erkennen France-BioImaging infrastructuur ondersteund door de Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-InSb-04-01, roepen &quot;Investissements d&#39;Avenir&quot;).

1. Instellen van de Light Sheet en de detectie Pad Figuur 1 geeft een algemene regeling van de optische opstelling. <ol><li> Plaats en bevestig de microscoop en de lasers op de optische tafel. </li><li> Combineer laser 488 nm, 561 nm en 405 nm met de bijbehorende dichroitische spiegels. Na de dichroïsche spiegels, de lasers moet nauwkeurig samen uitgelijnd. NB: De keuze van de laser-golflengten, dichroïsche spiegels en optische filters wordt bepaald door de absorptiespectra van de specifieke fluorescerende labels gebruikt in de experimenten. </li><li> Plaats de akoestisch-optische afstembare filter (AOTF). Gebruik de test plaat die door de leverancier aan de frequentie en de kracht van de AOTF passen. Wanneer goed uitgelijnd, wordt ongeveer 90% van het laservermogen op maximaal tuning uitgezonden gemeten door een PowerMeter. Merk op dat sommige lasers kan volledig worden geregeld door software die de AOTF overbodig kunnen maken. </li><li> Plaats en bevestigde telescoop. Merk op dat de telescoop bestaat uit twee lenzen die de bundel breiden tot een breedte gelijk aan of groter dan de diameter van de achterkant van het belichtingsstelsel objectieflens. De lens met de kleinste brandpuntsafstand moet eerst komen. </li><li> Plaats, het richten en bevestig de periscoop te brengen boven de optische weg dichter bij de achterkant opening van de cilindrische lens. Merk op dat de twee spiegels van de periscoop zodanig dat de lange as tot op de helling van de spiegel, teneinde de volledig geëxpandeerde bundel tijdens zijn gemonteerd. </li><li> Plaats de cilindrische lens naast de uitgang periscoop. Merk op dat de cilindrische lens focusseert de bundel in een richting en laat het gecollimeerd in de andere richting, waardoor een lichte folievormingswerkwijze. </li><li> Heroriëntatie van het resulterende licht blad met behulp van de verlichting objectief. Merk op dat het beeld brandpunt van de verlichting doel moet samenvallen met het voorwerp brandpunt van de objectieve detectie. Projecteer de balkop een scherm (bijvoorbeeld een wand) op grote afstand. Beweeg de verlichting doel langs de belichtingsbundel as te verkrijgen op het scherm scherpe contouren van het licht vel. </li><li> Plaats de quad lijn (405/488/561/638) emissie-filter in de plaats gereserveerd in de microscoop (kubus). </li><li> Plaats de EMCCD camera op de microscoop uitgang. </li><li> Bevestig de eerste handmatige vertaling etappe op de microscoop podium door middel van schroeven in gaten geboord in de microscoop podium. Merk op dat de rand van de translatietrap moet worden geplaatst op ongeveer 2 cm van het midden van de microscoop podium, zodat de cuvet wordt gecentreerd onder de detectiegrens objectieflens. </li><li> Bevestig de tweede handmatige vertaling etappe op de eerste. De richtingen van de twee fasen loodrecht (X en Y vertalingen) te zijn. </li><li> Bevestig de Z piëzo-elektrische fase aan de bovenkant van de twee vorige fasen. Merk op dat een gemotoriseerde fase kan worden gebruikt in plaats van de piëzo-elektrische fase. </li><li> Bevestig de cuvet Holder (zie figuur 2) aan de bovenzijde van de fasen. De cuvette wordt dus geplaatst op het snijpunt van het belichtingsstelsel pad en het detectiepad, die loodrecht op elkaar staan. </li></ol> 2. Controle van de Light Sheet <ol><li> Vul een glas cuvet met fluorescerende oplossing, en plaats het op de monsterhouder op het snijpunt van de twee optische paden. Het licht plaat is dus zichtbaar. Het heeft horizontaal zijn en symmetrisch / gecentreerd ten opzichte van de detectie objectieflens. </li><li> Verwijder de cilindrische lens en het verwerven van een afbeelding om de dikte van de plaat licht te meten. Merk op dat de dikte van de lichtwaaier afhankelijk van de numerieke apertuur (NA) van het belichtingsstelsel objectieflens (ongeveer 3-4 urn voor NA = 0,3). Merk op dat voor een gegeven lens, kan de dikte van de licht-plaat worden verhoogd door de grootte van de bundel via de achterkant opening met een spleet. Merk op dat fluorescerende microbolletjes kunnen worden gebruikt om de as te metenial en laterale resolutie van de microscoop. </li><li> Plaats de cilindrische lens terug voordat het experiment. </li></ol> 3. De montage van C. elegans embryo De volgende stappen zijn afgebeeld in figuur 3. <ol><li> Gebruik een diamant-markering pen om een ​​stuk van een glasplaatje van 10 x 20 x 1 mm snijden. </li><li> Bereid 5% bacto-agar in water, koken en te onderhouden in een verwarmingsblok bij 60 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van poly-L-lysine aan een zijde van het losse stuk dia laten drogen. </li><li> Plaats een microscoop dia op de bank en zet het vast. </li><li> Naast elkaar de gesneden stuk van dia met de vaste glijbaan en voeg een druppel gesmolten agar op de bovenkant. Knijp de agar met een andere schone microscoopdia een dunne agarkussen verkrijgen. </li><li> Laat de agar pad te drogen voordat u de bovenste schuif. </li><li> Snijd de agar pad op de zijde van het vaste slede om een ​​overmaat van ongeveer 3 mm o verlatenf agar en verwijder voorzichtig de vaste glijbaan. </li><li> Voeg 50 ul van poly-L-lysine op de agar en laat het drogen. </li><li> Zet gravid wormen in M9 medium in een horlogeglas. </li><li> Snijd de wormen op het niveau van de vulva met een scalpel om de embryo&#39;s vrij. </li><li> Onder een binoculair identificeren embryo&#39;s in het stadium plaats en verzamelen met een microcapillaire pipet. </li><li> Plaats de embryo&#39;s van de kant van de agar bekleed met poly-L-lysine die uitsteekt uit de losse stuk dia. Plaats de embryo&#39;s net naast de rand van de dia. Laat de embryo&#39;s niet te plaatsen op de grens van de agar, omdat ze niet stabiel genoeg zal zijn. Verwijder voorzichtig de vloeistof, zodat de embryo&#39;s blijft plakken op de poly-L-lysine laag. </li><li> Snel uitlijnen van de embryo&#39;s om uitdroging te voorkomen. </li><li> Leg de gesneden dia in een plastic petrischaal en voeg zachtjes M9 medium om de dia te dekken. </li><li> Controleer onder een binoculaire dat de eieren nog steeds vast aan de agar. </li&gt; </ol> 4. Registratie van C. elegans Ontwikkeling <ol><li> Bevestig de vorige voorbereiding (cut glijbaan, agar plus embryo&#39;s) in het monster houder en plaats het in een cuvet. Figuur 4 beschrijft de zelfgemaakte houder en Figuur 5 toont een mening van de cuvet in observatie context. </li><li> Bevestig de cuvette op de piëzo-elektrische podium. </li><li> Identificeer de positie van de embryo&#39;s met helderveld. </li><li> Start de zelfgemaakte software regelen van de AOTF, de camera en de piëzo-elektrische podium. Merk op dat een vrije software, zoals micromanager, kunnen ook worden gebruikt. </li><li> Selecteer de laser lijn en vermogen (AOTF). </li><li> Pas de positie van het licht plaat met behulp van de 3 richtingen stadium ondersteuning van de cilindrische lens en de verlichting lens. Beweeg de fase langs de laterale richting (X) de helderste signaal te verkrijgen. Pas dan is de Z-positie van de licht opgenomen, en de longitudinale positie (Y) om e te verkrijgene beste signaal-ruisverhouding. Merk op dat de positie van de lichtwaaier aandacht moet worden aangepast van een embryo naar elkaar verschillen gezien weglengte corrigeren. </li><li> Om time-lapse beelden verwerven, selecteer de belichtingstijd, winnen, tijd tussen twee beelden, evenals het aantal beelden te verkrijgen, en het laservermogen. Voor 2 kleuren overname, selecteert u een tweede laserlijn. Twee kleuren beelden worden na elkaar verworven. </li><li> Om az stack te verwerven, de afstand tussen de twee plakken, en de begin-en eindpositie van de piëzo-elektrische kiezen ook. </li></ol>

<ol><li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li>
<li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet-based+fluorescence+microscopy%3A+more+dimensions%2C+more+photons%2C+and+less+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22HFSP+J%22%5BJournal%5D)">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li>
<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li>
<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li>
<li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li>
<li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li>
<li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li>
<li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+%28mSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige setup van licht blad microscopie voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo&#39;s. De optische elementen noodzakelijk maken en lijn het licht daarin opgenomen lasers, straalexpander collimatie en focusseerlenzen kan gemakkelijk worden gemonteerd op een optische bank. In combinatie met een rechtopstaande microscoop voor de detectie pad en de camera, biedt dit een eenvoudige oplossing voor het inrichten van een lichtwaaier microscoop. Deze geometrie maakt het monster omgeving eenvoudig. De levende monster wordt geplaatst in een glazen cuvet, die wordt gehouden, gepositioneerd en bewogen door een kleine set van mechanische onderdelen. Zoals sheet verlichting microscopie is een breed veld techniek met het snijden vermogen, wordt slechts een enkele as gemotoriseerd verkeer nodig voor 3D-beeldvorming. Dit beperkt de vereiste synchronisatie een enkel aftastorgaan en faciliteert softwareontwikkeling. Vergeleken met ISPIM 6 onze rechtop geometry maakt het gebruik van hoge NA objectieflens voor detectie. Vergeleken met SPIM opstellingen met objectieven in het horizontale vlak de montage van het monster en de beeldvorming van een reeks embryo gemakkelijker. Totaal de uitvoering van deze techniek is eenvoudig en kan worden bereikt met weinig ervaring in de optica. Dit is een goedkoper alternatief voor confocale microscopen met de voordelen van een hogere snelheid en verminderde fototoxiciteit maar nadeel van een lagere axiale resolutie. We ontwikkelden ook een gemakkelijke en reproduceerbare manier te monteren C. elegans embryo in vivo beeldvorming met behulp van dit systeem. De montageprocedure is snel (15 minuten) en is geschikt voor dagelijks experimenten. Voor C. elegans beeldvorming, de voordelen van deze eenvoudige opstelling ten minste twee vouwen: (i) in zijn geheel beeldvorming mogelijk zonder rotatie en dus 3D reconstructie is eenvoudig; (Ii) sample montage is eenvoudig en meerdere embryo&#39;s kunnen opeenvolgend worden afgebeeldop dezelfde dia. We toonden voorbeelden van time-lapse filmpjes met voldoende temporele resolutie te celdelingen en veranderingen cel vorm waarnemen. De kracht van het licht vel microscopie aan C. studeren elegans ontwikkeling is onlangs ook geïllustreerd door anderen 6, 7, 8. Daarom zal deze techniek zeer nuttig zijn voor de morfogenese en patroonvorming van de C. bestuderen elegans embryo. Dit systeem kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere modelorganismen analyseren? Het is belangrijk te erkennen dat de toepassing van plaatstaal verlichting microscopie voor kleine en transparante organismen zoals C. elegans is minder streng dan voor grotere organismen zoals Drosophila embryo&#39;s. In toto beeldvorming van Drosophila vereist normaal rotatie en multi-view reconstructies 9, 10. excitatie van twee kanten met collineair excitatie objectief lenzen mogen ook verlaagde de schaduw effecten veroorzaakt door de attenuation van het licht 11. Toch wordt de setup hier gepresenteerde steeds aangepast aan het ene kant van de Drosophila embryo&#39;s, met lage bleken en lage photoxicity. Deze opstelling kan ook nuttig zijn om de afbeelding kleine en transparante embryo&#39;s zoals zakpijpen of zebravis zijn.

De vorming en de vorming van een organisme omvat cel bewegingen, veranderingen cel vorm, celdeling en celdifferentiatie. Inzicht in de progressie en de coördinatie van deze processen vereisen een snelle imaging-tools met drie-dimensies vermogen en subcellulaire resolutie. Onder de technieken met deze in vivo imaging-mogelijkheden, licht blad verlichting microscopie ook wel single / selectieve vliegtuig verlichting microscopie heeft het unieke voordeel van het produceren van low-fototoxische effecten en lage-fotobleking 1,2. In sheet verlichting microscopie wordt het monster verlicht van opzij door een lichtbron blad dat de optische sectie uitvoert. De verlichting pad en de detectie pad loodrecht op elkaar en de lichtwaaier is uitgelijnd om samen te vallen met het doel brandvlak van de detectie objectieflens. Het monster wordt geplaatst op het snijpunt van de twee paden, eennd kan langs de detectie as worden verplaatst naar 3D-beelden mogelijk te maken. Slechts het vlak van belang wordt verlicht en alle punten van dit vlak worden gedetecteerd op hetzelfde moment. Dit verhoogt de opnamesnelheid en vermindert fotobleken en fototoxiciteit in vergelijking met confocale microscopie 3. Praktisch, blad verlichting microscopie is eenvoudig te installeren en align: voor twee dimensionale beeldvorming, geen scannen is noodzakelijk noch voor de detectie deel, noch voor de verlichting deel; als een wide-field techniek met het snijden vermogen, kunnen driedimensionale beelden worden verkregen door een enkele as beweging van het podium met het monster. Hier presenteren we het opzetten van een eenvoudige lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in toto beeldvorming van C. elegans embryo&#39;s. C. elegans embryo&#39;s zijn zeer geschikt om te leven in vivo imaGing door hun transparantie, invariante afstamming en stereotiepe cel positioneert 4,5. De ontwikkelde lichtwaaier installatie is gebaseerd op een standaard microscoop rechtop voor detectie. De hieronder gepresenteerde protocol beschrijft hoe te bouwen en af ​​te stemmen de excitatie module / pad, testen en karakteriseren van de lichte plaat en monteer het monster voor 3D-beeldvorming. Het geeft ook voorbeelden van time-lapse filmpjes verworven met de opstelling die op verschillende stammen die fluorescente markers.

<table><tbody><tr><td>SPIM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Detectie</td></tr><tr><td>rechtopstaand microscoop</td><td>ZEISS</td><td>Axiophot 1</td><td></td></tr><tr><td>100x W objectief (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&nbsp;</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD achterverlicht</td><td>ANDOR</td><td>DU-885K-CS0-#VP</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Verlichting</td></tr><tr><td>LASER 488 nm / 60 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 405 nm / 120 mW</td><td>TOPTICA</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr><tr><td>LASER 561 nm / 500 mW</td><td>COBOLT</td><td>JIVE 500</td><td>&nbsp;voor time lapse beeldvorming, 50 of 100mW is voldoende</td></tr><tr><td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td><td>AHF</td><td>F57-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 405</td><td>AHF</td><td>F38-405</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic 488</td><td>SEMROCK</td><td>Di01-R488</td><td></td></tr><tr><td>AOTF</td><td>AA</td><td>AOTFnC-400.650-TN</td><td></td></tr><tr><td>spiegel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lens 50 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescoop 5X</td></tr><tr><td>lens 200 mm</td><td>THORLABS</td><td></td><td>telescoop 5X</td></tr><tr><td>periscoop</td><td>THORLABS</td><td>RS99/M</td><td></td></tr><tr><td>cilindrische lens f=100mm</td><td>THORLABS</td><td>ACY254-100-A</td><td></td></tr><tr><td>10X NA 0,3</td><td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>xyz stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sample</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>5% in water</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine oplossing&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>KAPILLAREN GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td><td>Havard Appartus</td><td>30-0019</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratiebuis (mondpipet)</td><td>Dutsher</td><td>55005</td><td></td></tr><tr><td>M9 medium:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (3g/L)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (6g/L)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (5g/L)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (1 mM eindconcentratie)</td><td>Elke leverancier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cuvettehouder</td><td>ZELFGEMAAKT</td><td></td><td>gemaakt door Brice Detailleur&nbsp;</td></tr><tr><td>sample houder</td><td>ZELFGEMAAKT</td><td></td><td>gemaakt door Claude Moretti&nbsp;</td></tr><tr><td>x stage</td><td>NEWPORT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dekglas 50x20x1 mm</td><td>MARIENFELD</td><td></td><td>snijden dan in 10x20x1mm</td></tr><tr><td>piëzo elektrische stage met versterker/controller</td><td>PI</td><td>P-622.ZCD / E-625.CR</td><td></td></tr><tr><td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td><td>HELLMA</td><td>704.002-OG.40 mm- 10mm hoog</td><td></td></tr><tr><td>Diamantpunt Glas Markering Potlood</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>C++ (Qt) zelfgemaakte software</td><td></td><td></td><td>ontwikkeld door Olivier Blanc en Claire Chard&egrave;s, op aanvraag beschikbaar. Alternatieve oplossingen: micromanager of labview&nbsp;</td></tr></tbody></table>

het opzetten van een eenvoudige light sheet microscope voor<em&gt; in toto</em&gt; beeldvorming van<em&gt; c. elegans</em&gt; ontwikkeling

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Snelle en lage fototoxiciteit beeldvormende technieken voorwaarde voor de ontwikkeling van organismen in toto bestuderen. Licht vel gebaseerd microscopie vermindert fotoblekingsreactie en fototoxische effecten in vergelijking met confocale microscopie, terwijl het verstrekken van 3D-beelden met subcellulaire resolutie. Hier presenteren we de opstart van een lichtwaaier gebaseerd microscoop, die bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een kleine set van opto-mechanische elementen voor het genereren van de lichtwaaier. Het protocol beschrijft hoe te bouwen, lijnt de microscoop en karakteriseren het licht vel. Bovendien beschrijft hoe de methode te implementeren in toto beeldvorming van C. elegans embryo&#39;s met behulp van een eenvoudige observatie kamer. De methode maakt het vastleggen van 3D-twee-kleuren time-lapse filmpjes meer dan enkele uren van ontwikkeling. Dit zou het volgen van celvorm, celdelingen en gemerkte eiwitten gedurende lange tijd te verlichten.

Drie 3D time-lapse opname experimenten uit drie verschillende C. elegans stammen illustreren de aard van de gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van het licht vel microscoop setup hierboven beschreven. Checkten we dat onder deze omstandigheden ontwikkelt het embryo zich op normale snelheid en overleven de beeldvorming, in overeenstemming met eerdere rapporten waaruit blijkt dat SPIM beeldvorming leidt slechts lage fototoxiciteit niveaus in C. elegans embryo 6,7. De eerste stam drukt een histon gefuseerd met GFP (zuIs178; stIs10024). De opname werd uitgevoerd gedurende 2 uur met een stapel 20 segmenten (afstand tussen plakken 1 um) die elke 37 sec. Figuur 6 toont een vlak van de stapel op verschillende tijdstippen. Beide interfase kernen (pijl) en gecondenseerde mitotische chromatine (pijlpunt) zijn duidelijk zichtbaar. De tweede stam drukt een tubuline gefuseerd met GFP (ruIs57) en een histongefuseerd met mCherry (itIs37; stIs10226). De opname werd uitgevoerd gedurende 16 min met een stapel 20 segmenten (afstand tussen plakken 1 um) die elk 105 sec. Figuur 7 illustreert verschillende vlakken van de stapel en verschillende tijdstippen. De bijbehorende film 1 toont 3D-reconstructies op 3 opeenvolgende tijdstippen. Tijdens divisie, de mitotische spindel (groen) en gecondenseerde chromosomen (rood) zijn duidelijk zichtbaar waardoor het volgen van de celdeling oriëntaties tijdens de ontwikkeling. De derde stam drukt de apolipoproteïne VIT-2 gefuseerd met GFP (pwIs23) en een membraan gebonden mCherry (ltIs44). De opname werd uitgevoerd gedurende 25 min met een stapel van 10 schijven (afstand tussen plakken 1 um) die elke 30 sec. Figuur 8 illustreert verschillende vlakken van de stapel en verschillende tijdstippen. De snelle bewegingen van de dooier lipoproteïne deeltjes (groen) in de cellen kan gemakkelijkgevolgd. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Figuur 1: SPIM optische opstelling bestaat uit de verlichting en detectie-eenheden, voor-en onderkant uitzicht. In de verlichtingseenheid de lasers gecombineerd door de dichroïsche spiegels alstublieft de AOTF, die de kracht van elke laser onafhankelijk bestuurt. Vervolgens wordt de telescoop neemt de grootte van de bundel van 4-voudige en periscoop brengt het aan de hoogte van de microscoop. De cilindrische lens vormt het licht blad, dat wordt geheroriënteerd door de verlichting doelstelling. De detectie-eenheid is geïntegreerd in verticale microscoop en wordt hoofdzakelijk samengesteld door de detectie lens, het filter, de buis lens en EMCCD. Het monster wordt geplaatst op de kruising tussen de verlichting en detectie paden. Piëzoëlektrische fase kan verticaal (Z) verplaatsingen van het monstervoor 3D-acquisitie. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Figuur 2:. Cuvethouder De houder bestaat uit 3 aluminium platen en is geschroefd op de piëzo-elektrische podium. De glazen kuvet wordt gehouden door een veer (in rood). <img alt="Figuur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Figuur 3: Montage protocol van C. elegans embryo&#39;s voor SPIM experimenten. Een gesneden stuk glas is bekleed met poly-L-lysine. Een kussen van agar wordt op het beklede oppervlak. Poly-L-lysine wordt vervolgens toegevoegd aan de agar pad. Tenslotte C. elegans embryo&#39;s worden aangepast aan de poly-L-lysine gecoate agarkussen. Figuur 4: Voorbeeld houder. De houder past bij de inwendige afmetingen van het glas cuvet. Twee veren (in rood) houden het glaasje (beschreven in figuur 3). Deze houder wordt vervolgens in het glas cuvet. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Figuur 5:... Monsterhouder de waarneming context Embryo&#39;s worden geïmmobiliseerd op het glaasje volgens het protocol samengevat in Figuur 3 De slede wordt gehouden door de monsterhouder in figuur 4 beschreven De monsterhouder in het glas cuvet geplaatst, gehouden door de in figuur 2 beschreven houder. Het licht blad horizontale en illuminates de embryo&#39;s van de zijkant. De detectie objectieflens verticaal, boven het monster. <img alt="Figuur 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Figuur 6: De opname van een C. elegans embryo uitdrukking brengen van een histon :: GFP fusie Single vliegtuig beelden van een transgene embryo uitdrukking brengen van een histon :: GFP fusie (zuIs178; stIs10024) op verschillende tijdstippen Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse-opname:.. stapels gemaakt van 20 plakken ( afstand tussen plakjes 1 micrometer); belichtingstijd per plakje: 30 ms; tijdsinterval tussen de stapels: 37 sec; totale acquisitie tijd: 2 uur. Arrow: interfase kern, pijlpunt: gecondenseerd mitotische chromatine. Op t = 0 min het embryo is de 2-cel stadium en op t = 120 min de embryo bevat ongeveer 70 cellen zoals verwacht onder normale ontwikkeling enpeed (Alleen de cellen die in een enkel vlak zijn zichtbaar in de foto&#39;s en niet alle cellen van het embryo). De kracht van verlichting was 30 μW bij 488 nm (gemeten bij de uitgang van de verlichting doel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a> <img alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Figuur 7: Opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een Tubuline :: GFP fusie en een histon :: mCherry fusie. Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een Tubuline :: GFP fusie (ruIs57) en een histon :: mCherry fusie (itIs37; stIs10226). Opnameomstandigheden: verwerving van een stapel van 20 schijfjes (afstand tussen plakjes 1um) iedere 105 seconden; totale acquisitie tijd: 16 min; belichtingstijd: 200 msec voor elk kanaal. Panel een toont 10 plakjes van dezelfde stapel. Paneel B toont dezelfde plak elke 210 sec. De kracht van verlichting was 30 μW en 300 μW, voor 488 en 561 nm lasers, respectievelijk (gemeten bij de uitgang van de doelstelling verlichting). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Figuur 8: De opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een VIT-2 :: GFP fusie en een membraan-gerichte mCherry. Beelden gewonnen uit een 3D time-lapse opname van een C. elegans embryo uitdrukken van een VIT-2 :: GFP-fusie (PWIS23) en een membraan gerichte mCherry (ltIs44). Opnameomstandigheden: verwerving van een stapel van 10 schijven (afstand tussen plakjes 1 micrometer) om de 30 seconden; totale acquisitie tijd: 25 min; belichtingstijd per kanaal: 200 msec. Paneel een toont de 5 eerste plakjes van dezelfde stapel. Paneel B toont dezelfde slice elke 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo&#39;s.

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor<em&gt; In Toto</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt; Ontwikkeling

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling van C Allergan te beelden met fluorescentie-light sheet-microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de light sheet-microscoop op te stellen, die bestaat uit een rechtopstaande microscoop en een kleine set optomechanische elementen om een light sheet te genereren. De tweede stap van de procedure is het monteren van het embryo.De laatste stappen zijn het afstellen van het lichtvel op het embryo en het vastleggen van de ontwikkeling ervan. De resultaten kunnen de dynamiek van fluorescent gelabelde eiwitten tijdens de ontwikkeling van C. elegans tonen via de analyse van 3D- en time-lapsevideo's. De belangrijkste voordelen van light-sheetmicroscopie ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals confocale microscopie, zijn dat het snellere beeldvorming mogelijk maakt met een lagere fototoxiciteit.Ten derde kan deze methode inzicht bieden in de ontwikkeling van zeehonden. Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals muizen of zebravisjes. De demonstratie van de procedure zal duidelijk zijn.Shales, een ingenieur uit mijn laboratorium, en Pauline Linac, een ingenieur uit het laboratorium van van. Deze sectie beschrijft de assemblage van de opstelling, en deze kan voor alle experimenten geassembleerd blijven. Zodra de lasers, filters, telescoop en periscoop allemaal op de optische tafel zijn geplaatst, bevestigt u de cilindrische lens om het lichtveld te genereren.Een andere lens wordt op focus ingesteld. Het brandpunt van het belichtingsdoelstuk moet samenvallen met het object-brandpunt van het detectiedoelstuk. Projecteer nu de straal op de muur of het scherm en verplaats het belichtingsdoelstuk langs de straalas totdat de contouren van de projectie scherp zijn.Voeg een quad-lijn emissiefilter en een E-M-C-C-D camera toe aan de microscoopopstelling. Bevestig de tweede handmatige translatietrap loodrecht op de eerste. Schroef de assemblage vast aan de bestaande microscooptafel.Nadat het gestelde cilindrische lens-verlichtingsobjectief is verwijderd, plaatst u de assemblage op de microscoop en zet u de verlichtingsset terug op de tafels. Bevestig de qve-houder op het loodrechte kruispunt van het verlichtingspad en het detectiepad. Controleer nu het lichtveldpaneel.Vul een glazen cuvet met fluoresceïne-oplossing en plaats deze in de houder op de tafel. Het lichtvel moet zichtbaar zijn. Het moet horizontaal staan en gecentreerd zijn ten opzichte van de detectie-objectieflens.Verwijder vervolgens de cilindrische lens. Optimaliseer het lichtvel door 3D-translatie van het illuminatie-objectief en neem een afbeelding op om de dikte van het lichtvel te meten. Dit is afhankelijk van de apertuur van de objectieflens.Vervang vervolgens de cilindrische lens. Snijd eerst een stuk glas van één millimeter dik, met afmetingen van 10 millimeter bij 20 millimeter. Gebruik hiervoor een diamantstift.Voeg vervolgens 20 µL poly-L-lysine toe aan één zijde en plaats deze, zodra het droog is, naast een tweede objectglas. Voeg in een vaste positie een druppel 5% agar toe en strijk deze glad met het gewicht van een derde objectglas dat erbovenop wordt geplaatst. Nadat de agar is opgedroogd, wordt het derde objectglas verwijderd en wordt het agarpad drie millimeter vanaf de rand van de twee overgebleven objectglazen doorgesneden, boven het objectglas zonder poly-L-lysine.Verwijder vervolgens het gefixeerde preparaat, waarbij een overschot agar overblijft. Bedek de agar met 20 µL poly-L-lysine en laat dit drogen. Plaats nu GR-wormen in een horlogeglas gevuld met M9-medium onder een dissectiemicroscoop.Snijd de wormen met een scalpel ter hoogte van de vulva om zo de eieren vrij te maken. Identificeer vervolgens de embryo's in het stadium van interesse en verzamel deze met een microcapillaire pipet. Breng de embryo's over naar de agar-overhang van de voorbereide objectglas, net naast de rand van het objectglas en niet op de rand van de agar.Lijn vervolgens de embryo's uit met een microcapillaire pipet terwijl de vloeistof wordt verwijderd. Door aspiratie zullen de embryo's aan het polyol-lysine hechten. Het is zeer belangrijk om de embryo's goed te positioneren om een goede opname te verkrijgen, en dit vereist een capillair met de juiste opening.Als deze te klein is, zullen de embryo's moeilijk vrij te maken zijn. Als deze te groot is, is het lastig om de lekstroom nauwkeurig te beheersen en de embryo's uit te lijnen. Bedek het objectglas met M nine medium in een petrischaal en bevestig onder vergroting dat de embryo's nog aan de agar vastzitten. Bevestig nu het geprepareerde objectglas met embryo's aan de monsterhouder die in een vete past.De houder is een in-house vervaardigd hulpmiddel dat is ontworpen om op een vete te passen. Bevestig vervolgens de vete aan een piëzo-elektrische tafel en lokaliseer onder brightfield-verlichting een embryo. Start nu het softwarepakket op dat de akoestisch optische tunable filter aanstuurt.Filter de camera en de tafel. Deze software is intern ontwikkeld, maar de freeware MicroManager kan ook worden gebruikt. Selecteer eerst de laserlijn.Stel vervolgens de tafel langs de x-as af totdat het lichtveldsignaal op zijn sterkst is. Stel daarna de andere twee dimensies, Y en Z, af totdat de signaal-ruisverhouding optimaal is. Dit moet mogelijk voor elk embryo worden herhaald.Dit is essentieel om de signaal-ruisverhouding te optimaliseren voor een goede opname door de vrije fase te vertalen, de ondersteuning en het elimineren van het doelwit wanneer ik enkel de relatie gebruik om een nauwkeurige simulatie van het embryo en het beste contrast te verkrijgen. Neem nu time-lapsebeelden op waarbij de lasersterkte, de belichtingstijd, de gain en het beeldinterval worden ingesteld op basis van het fluorescentieniveau van het embryo en de snelheid van het geanalyseerde biologische proces. Voor Zack.Bij de beeldvorming werden de afstand tussen de coupes en hun start- en eindposities ingesteld in c elgan die een histon-GFP-construct tot expressie bracht. Er werd een time-lapse-opname van twee uur gemaakt met stacks van 20 coupes, elke 37 seconden vastgelegd. Celdelingen waren duidelijk zichtbaar in een stam die tubuline gefuseerd aan GFP en histon gefuseerd aan m cherry tot expressie bracht. De opnames werden gedurende 16 minuten elke 105 seconden gemaakt.3D-renderings worden getoond op drie tijdstippen. De mitotische spoelen en gecondenseerde chromosomen zijn duidelijk zichtbaar en gemakkelijk te volgen gedurende de celdelingen. In een derde stam werd APO lipoprotein vit twee gefuseerd met GFP afgebeeld, met mCherry-labeling van het celmembraan.Gedurende 13 minuten werden elke 27 seconden 10 slice stacks opgenomen. Snelbewegende lipoproteïnedeeltjes waren eenvoudig te volgen. Hier maken we gebruik van de light sheet die met complexere methoden is gegenereerd.De light sheet kan worden geïmplementeerd om de ruimtelijke resolutie verder te verbeteren.

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Imaging C. elegans Embryo&#39;s met behulp van een epifluorescerende Microscoop en Open Source Software

Dit artikel beschrijft een techniek voor de visualisatie van de vroege gebeurtenissen van embryogenese in de...

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

De transparante C. elegans darm kan dienen als een"in-vivo weefsel kamer" voor de studie van apicobasal membraan en lumen biogenese de eencellige en subcellular niveau tijdens meercellige tubulogenesis. Dit protocol beschrijft hoe te combineren met het standaard labeling, verlies-van-functie genetische/RNAi en microscopische benaderingen te ontleden van deze processen op een moleculair niveau.

C. elegans darm als een Model voor intercellulaire Lumen genuitdrukking en In Vivo gepolariseerde biogenese van eencellige niveau: Labeling door antilichaam kleuring, RNAi verlies-van-functie analyse en beeldvorming

Hier presenteren we een combinatie benadering met behulp van hoge-resolutie microscopie, computationele tools, en single-cell etikettering in levende C. de embryo's van de neurologische om de enige cel dynamiek te begrijpen.

Isotrope licht-vel microscopie en geautomatiseerde Cell Lineage analyses catalogus Caenorhabditis embryogenese met subcellulaire resolutie

Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo's in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.

Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren

Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en monteren van Caenorhabditis elegans-embryo's , het registreren van de ontwikkeling onder een 4D-microscoop en het traceren van de cellijn.

4D-microscopie: Caenorhabditis elegans embryonale ontwikkeling ontrafelen met behulp van Nomarski-microscopie

Een protocol voor het in beeld brengen van de dynamische microtubuli in vivo met behulp van fluorescerend gelabeld Eindbindend eiwit is gepresenteerd. We beschreven de methoden om de dynamische microtubuli in het posterieure laterale microtubuli (PLM) neuron van C. elegans te labelen,in beeld te geven en te analyseren .

In vivo Beoordeling van microtubule dynamica en oriëntatie in Caenorhabditis elegans neuronen

Superresolutiemicroscopie kan een gedetailleerd inzicht geven in de organisatie van componenten binnen het synaptonemale complex bij meiose. Hier demonstreren we een protocol om individuele eiwitten van het Caenorhabditis elegans synaptonemale complex op te lossen.

Superresolutiemicroscopie van het synaptonemale complex binnen de Caenorhabditis elegans kiembaan

We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.

Epon Post Inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie

Leer de opzet van een lichtveldmicroscoop voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's. Deze methode maakt snellere opnames met lagere fototoxiciteit mogelijk dan confocale microscopie.

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor

Meer video's verkennen