Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor In Toto Beeldvorming van C. elegans Ontwikkeling
5 mei 2014
Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.
Het algemene doel van deze procedure is om de ontwikkeling van C Allergan te beeldvormen met behulp van fluorescentie light sheet microscopie. Dit wordt bereikt door eerst de op een rechtopstaande microscoop en een kleine set optomechanische elementen gebaseerde lichtbladmicroscoop in te stellen om een lichtblad te genereren. De tweede stap van de procedure is het monteren van het embryo.
De laatste stappen zijn het aanpassen van het lichtblad op het embryo en het opnemen van de ontwikkeling. De resultaten kunnen de dynamica van fluorescentie gelabelde eiwitten tijdens de ontwikkeling van CL egan laten zien via de analyse van 3D en time lapse video's. De belangrijkste voordelen van lightsheet microscopie ten opzichte van andere bestaande methoden, zoals confocale microscopie, is dat het snellere beeldvorming met lagere fototoxiciteit mogelijk maakt.
Ten derde kan deze methode inzicht geven in de ontwikkeling van afdichtingen. Het kan ook worden toegepast op andere systemen zoals roil of zebravis. Het demonstreren van de procedure zal duidelijk zijn.
Shales, een ingenieur uit mijn laboratorium en Pauline Linac, een ingenieur uit het laboratorium van van. Deze sectie beschrijft de montage van de opstelling en deze kan voor alle experimenten geassembleerd blijven. Zodra de lasers, filters, telescoop en periscoop allemaal op de optische tafel zijn geplaatst, bevestigt u de cilindrische lens om het lichtblad te genereren.
Een andere lens wordt aangepast voor focus. Het brandpunt van het verlichtingsobjectief moet samenvallen met het objectiefbrandpunt van het detectieobjectief. Projecteer nu de straal op de muur of het scherm en beweeg het verlichtingsobjectief langs de straelas tot de contouren van de projectie scherp zijn.
Voeg een quad line emissiefilter en E-M-C-C-D camera toe aan de microscoopopstelling. Bevestig de tweede handmatige translatie-fase loodrecht op de eerste. Schroef de assemblage op de bestaande microscoopfase.
Na het verwijderen van het gemonteerde cilindrische lensverlichtingsobjectief, plaatst u de assemblage op de microscoop en plaatst u het verlichtingssetje weer op de fasen. Bevestig de qve-houder op de loodrechte kruising van de verlichtingsweg en de detectieweg. Controleer nu het lichtblad.
Vul een glazen vet met fluoresceïne oplossing en plaats het in de houder op de fasen. Het lichtblad moet zichtbaar zijn. Het moet horizontaal en gecentreerd zijn ten opzichte van het detectieobjectief.
Verwijder vervolgens het cilindrische lens. Optimaliseer het lichtblad met 3D translatie van het verlichtingsobjectief en verwerf een afbeelding om de dikte van het lichtblad te meten. Dit is afhankelijk van de diafragma van het objectief.
Zorg er vervolgens voor dat de cilindrische lens wordt vervangen. Snijd eerst een stuk van één millimeter dik glas, 10 millimeter bij 20 millimeter. Gebruik een diamant markeerstift.
Voeg vervolgens 20 microliter poly L lysine toe aan één kant en juxtaposeer het, eenmaal droog, aan een tweede dia. In een vaste positie, voeg een druppel 5% agar toe en maak het glad met het gewicht van een derde dia die bovenop staat. Nadat de agar droog is, verwijdert u de derde dia en snijdt u de agar pad drie millimeter van de rand van de twee resterende dia's over de dia zonder poly L lysine.
Verwijder vervolgens de vaste dia, waardoor een overhang van agar overblijft. Bekleed de agar met 20 microliter poly L lysine en laat het drogen. Plaats nu GR wormen in een horlogeglas gevuld met M negen medium onder een dissectiemicroscoop.
Snij de wormen met een scalpel op niveau met de vulva, waardoor de eieren worden vrijgegeven. Identificeer vervolgens de embryo's die zich in het stadium van belang bevinden en verzamel ze met een micro capillaire pijp. Breng de embryo's over naar de agar overhang van de voorbereide dia net naast de rand van de dia, niet op de rand van de agar.
Aligneer vervolgens de embryo's met een micro capillaire pijp terwijl u de vloeistof verwijdert. Door aspiratie zullen de embryo's zich aan de polyol lysine hechten. Het is erg belangrijk om de embryo's goed te positioneren om een goede opname te verkrijgen en dit vereist een capillaire met de juiste opening.
Als het te klein is, zal het moeilijk zijn om de embryo's los te maken. Als het te groot is, zal het moeilijk zijn om de gelekte stroom goed te controleren en om de embryo's uit te lijnen. Bedek de dia met M negen medium in een petrischaal en bevestig met behulp van vergroting dat de embryo's nog steeds aan de agar zijn bevestigd. Bevestig vervolgens de voorbereide dia met embryo's aan de monsterhouder die in een vet past.
De houder is een in-house gemaakte constructie die is ontworpen om in een vet te passen. Bevestig vervolgens het vet aan een Pizo elektrische fase en lokaliseer onder helderveldverlichting een embryo. Start nu het softwarepakket dat de akoestische optisch afstembare besturing aanstuurt.
Filter de camera en de fase. Deze software is in-house geschreven, maar micromanager freeware kan ook worden gebruikt. Selecteer eerst de laserlijn.
Pas vervolgens de fase langs de x-as aan tot het lichtblad het helderst is. Pas vervolgens de andere twee dimensies, Y en Z aan tot het signaal-ruisverhouding het beste is. Dit moet mogelijk voor elke embryo worden herhaald.
Dit is de sleutel tot het optimaliseren van de signaal-ratio om een goede opname te verkrijgen door het vertalen van de vrije fase, ondersteuning van de en eliminatie objectief wanneer ik alleen de relatie wil verkrijgen om een simultaan simulering van het embryo en de beste contrast te verkrijgen. Verwerf nu time lapse beelden, stel de laserkracht, belichting, tijdversterking en beeldinterval in op basis van het fluorescentieniveau van het embryo en de snelheid van het geanalyseerde biologische proces. Voor Zack.
Afbeeldingen stellen de afstand tussen de plakjes en hun start- en eindposities in c elgan in die een histone GFP-construct tot expressie brengt. Time-lapse beelden van twee uur werden gemaakt met 20 plakjes die elke 37 seconden werden genomen. Celdelingen waren duidelijk zichtbaar in een stam die tubuline fuseerde met GFP en zijn steen fuseerde met m kers. Opnames werden gedurende 16 minuten elke 105 second
Overzicht
Dit protocol beschrijft de opstelling van een light sheet microscoop en de implementatie ervan voor in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's. De methode zorgt voor snellere beeldvorming met lagere fototoxiciteit in vergelijking met confocale microscopie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Microscopie
Achtergrond
- Light sheet microscopie biedt een unieke benadering voor het beeldvormen van biologische monsters.
- Deze techniek is bijzonder nuttig voor het observeren van levende embryo's.
- Het minimaliseert fotoschade terwijl het snelle beeldvorming mogelijk maakt.
- Toepassingen breiden zich uit tot verschillende modelorganismen buiten C. elegans.
Doel van het onderzoek
- Om de ontwikkeling van C. elegans embryo's te visualiseren met behulp van fluorescentie light sheet microscopie.
- Om de dynamica van fluorescentie gelabelde eiwitten tijdens de ontwikkeling te analyseren.
- Om de voordelen van light sheet microscopie ten opzichte van traditionele methoden te demonstreren.
Gebruikte methoden
- Opstelling van een light sheet microscoop met optomechanische elementen.
- Monteren van embryo's op voorbereide dia's met agar pads.
- Optimalisatie van de light sheet uitlijning voor beeldvorming.
- Time-lapse beeldvorming van embryo's om ontwikkelingsprocessen vast te leggen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van celdelingen en eiwitdynamica in C. elegans embryo's.
- 3D weergaven van mitotische spoelen en chromosomen werden verkregen.
- De mogelijkheid werd aangetoond om snel bewegende eiwitten te volgen.
- Er werden inzichten verkregen in de ontwikkelingsprocessen van het organisme.
Conclusies
- Light sheet microscopie is een krachtig hulpmiddel voor in vivo beeldvorming.
- Deze methode verbetert het begrip van embryonale ontwikkeling.
- Het kan worden aangepast voor gebruik met andere modelorganismen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Light sheet microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of whole-organism development, supporting target validation in early discovery by providing quantitative, dynamic phenotypic data. This approach reduces biological uncertainty in preclinical models by allowing longitudinal tracking of cellular processes and protein dynamics in live systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by delivering reproducible, scalable imaging outputs compatible with high-content screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through subcellular-resolution visualization of protein dynamics and cell divisions in developing embryos.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, quantitative readouts of developmental phenotypes under low-phototoxic conditions.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating longitudinal, multi-parameter datasets that correlate molecular perturbations with developmental outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, 3D time-lapse imaging with subcellular resolution, enabling reliable compound effect assessment in whole-organism contexts.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through precise light sheet alignment and stabilization, minimizing variability in longitudinal imaging sessions.
- Scalability: Compatible with multi-well observation chambers and automated stage control, supporting medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling consistent phenotypic assessment across model systems using standardized imaging protocols.
- Mechanistic De-risking: Allows direct observation of target engagement effects on developmental processes, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions based on developmental toxicity and phenotypic normalization metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead optimization, offering a non-destructive, quantitative imaging modality for phenotypic screening and mechanistic studies in whole-organism models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time tracking of fluorescently labeled proteins and cellular structures during embryogenesis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, light sheet characterization, and embryo mounting protocols that ensure imaging consistency.
- Analytics: Generates quantitative 3D and time-lapse readouts (e.g., mitotic spindle dynamics, protein trafficking) that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing disease-relevant phenotypic readouts in C. elegans, a validated model for conserved developmental pathways.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, left-assembled system on an optical table, enabling repeated use across projects with minimal recalibration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, longitudinal observation of protein dynamics and cellular behavior.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via standardized opto-mechanical alignment, slide preparation, and embryo mounting procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of developmental toxicity, reducing late-stage attrition due to unidentified biological risks.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative, imaging-based phenotypic scores that inform advancement decisions across target classes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical alignment, fluorescence microscopy, and sample preparation for live imaging.
- Needs stable optical table, laser sources, objectives, translation stages, and EM-CCD or sCMOS camera for detection.
- Demands cross-team standardization of slide preparation, embryo staging, and imaging parameters to ensure reproducibility across users and sites.
- Adaptation considerations include embryo size, optical clearing, and mounting medium compatibility when extending to other model systems (e.g., zebrafish, Drosophila).
- Practical limitations include embryo immobilization efficiency and light sheet uniformity over large fields of view, which may require optimization for longer imaging sessions.
