Name: Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in Pseudomonas aeruginosa Het gebruik van mini- Himar1 Mariner transposon-gemedieerde mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Ontdek mini-Himar1 transposon-gemedieerde mutagenese voor identificatie van nieuwe alginatregulatoren in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Deze methode genereert een mutantenbibliotheek voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) en NIH P20RR016477 en P20GM103434 aan de West Virginia IDeA Network for Biomedical Research Excellence. Wij danken Vonya M. Eisinger voor de technische ondersteuning bij dit werk.

1. Voorbereiding van Bacteriestammen en biparental Vervoeging <ol><li> Inoculeren E. coli SM10/λpir/pFAC in 5 ml Luria Broth (LB), aangevuld met 15 ug / ml gentamycine en in een incubator schudden overnacht bij 37 ° C. </li><li> Inoculeren P. aeruginosa stam PAO1 in 5 ml LB, en plaats in een incubator schudden gedurende de nacht bij 42 ° C. </li><li> Meet OD 600 overnachtende culturen en meng gelijke hoeveelheden PAO1 en E. coli PFAC zodat het uiteindelijke volume van 1-1,4 ml. </li><li> Centrifugeer mengsel bij 6000 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Ondertussen drogen LB-platen om de vervoeging: laat platen geopend in de broedstoof bij 37 ° C gedurende 10-15 minuten. </li><li> Verwijder alle 50 pl supernatant van celmengsel. </li><li> Resuspendeer de celpellet in de resterende 50 pl supernatant en pipet op een droge LB plaat in een compact druppel. </li><li> Plaats voorzichtig de plaat in een zuurkast te drogen (IMPORTANT Opmerking: Laat cellen verspreid over de plaat, dit zal aanzienlijk de efficiëntie van de vervoeging verlagen). </li><li> Nadat de druppel droog is, keren de LB plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 4-6 uur. </li><li> Terwijl de cel mengsel te incuberen, bereiden groot (OD 150 x 15 mm) PIA platen met 300 ug / ml gentamycine. Verwijder voor gebruik eventuele resterende vocht door in een incubator bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten. </li><li> Na de incubatie van de cel mengsel voltooid, verzamel de cellen met een steriele entoog en in een microcentrifugebuis met 1 ml LB en vortex of pipet, grondig te mengen. </li><li> Spreid de cellen gelijkmatig op de grote PIA platen bevatten 300 ug / ml gentamycine. (BELANGRIJK: Voor deze stap is het best om grotere hoeveelheden van de cel mengsel toevoegen aan platen te scheiden (bijv. Plaat 1: 10 pl, Plaat 2: 50 ui, Plate 3: 100 ul, Plaat 4: 500 ul, enz.) . </li><li> Incubeer overnacht bij 37° C. </li></ol> 2. Detectie en isolatie van Mucoïde Kolonies <ol><li> Verwijder platen uit incubator en onderzoeken voor slijmerige kolonies. </li><li> Isoleer een slijmerige kolonie en strook voor isolatie op kleine bordjes (100 OD x 10 mm) met PIA en 300 ug / ml gentamycine. </li><li> Incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Herhaal stap 2.2 op de vorige overnacht cultuur. </li><li> Herhaal stap 2.2-2.4 twee keer de stabiliteit van de slijmerige isolaat te bepalen. </li><li> Na de laatste stap isolaat, enten 4,5 ml LB met een mucoïde kolonie en incubeer in shaker overnacht bij 37 ° C. </li><li> De volgende dag, label 3 microcentrifugebuizen voor elke slijmerige mutant. </li><li> Bereid twee 1,25 ml porties van overnacht cultuur in 2 buizen voor genomische DNA-extractie en identificatie van de transposoninsertie website (zie Protocol nr. 3). </li><li> Daarnaast archiveren elk slijmerige mutant door pipetteren 1 ml overnacht cultuur in een appropriately-gemerkte cryovial die een gelijk volume 10% magere melk. Bewaren bij -86 ° C. </li></ol> 3. gDNA restrictiedigestie en eileiders <ol><li> Uittreksel gDNA van mucoïde mutant met elke voorkeurswerkwijze (bijv.. Fenol-chloroform, spinkolom, enz.). </li><li> Bepaal de concentratie van de gDNA, verteren totaal 2 ug met 1 pl van het restrictie-endonuclease SalI, 0,5 ul runderserumalbumine, 5 gl enzym SalI buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM Dithiothrietol (DTT), pH 7,9 bij kamertemperatuur), en het geschikte volume van dH 2 O tot een totaal volume van 50 pl te bereiken. </li><li> Verteren DNA overnacht bij 37 ° C. (Belangrijk:. Afhankelijk van de efficiëntie van het restrictie-enzym, kan het noodzakelijk zijn een extra 1 ui aan de digest en incubeer overnacht bij 37 ° C gedurende 1-2 uur Dit komt bovenop de nacht digest.) </li><li> Zuiver het DIGEsted DNA met elke voorkeurswerkwijze (bijv. agarose gel zuivering rotatie kolommen) en elueer met 25 ul buffer. </li><li> Ligeren van de gedigereerde DNA door het mengen 11 pl gezuiverd DNA met een gewenste concentratie van ~ 10-20 ng / ul, 1,5 ui ligatiebuffer (330 mM Tris-acetaat pH 7,5, 660 mM kaliumacetaat, 100 mM magnesiumacetaat, 5 mM DTT), 1,5 gl 100 mM ATP en 1 pi DNA ligase. </li><li> Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geroerd en vervolgens inactivatie van het enzym door incubatie gedurende 15 minuten bij 70 ° C. (Opmerking: het incuberen van het mengsel bij kamertemperatuur gedurende langer kan het succes van de ligatie verhogen). </li></ol> 4. Omgekeerde PCR (iPCR) en Sequence Analysis <ol><li> Voer iPCR op ligatieproduct met de volgende voorwaartse en achterwaartse primers en thermocycling voorwaarden: -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA -Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA Thermocycler Condities: 1. 94 ° C gedurende 1 minuut. 2. 94 ° C gedurende 1 minuut. 3. 58 ° C gedurende 2 minuten. 4. 72 ° C gedurende 2 minuten. 5. 72 ° C gedurende 8 minuten. 6. 10 ° C te houden. Herhaal de stappen 2-4 voor 34 cycli. (NB: Amplified iPCR producten kunnen bij 4 ° C worden bewaard) </li><li> Voer agarosegelelektroforese succesvolle amplificatie iPCR bevestigen. </li><li> Voer sequencing op het iPCR product met de Gm3OUT en Gm5OUT primers. Het inbrengen site en de oriëntatie van himar1 in kaart gebracht. </li></ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
<li>Franklin, M. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+analysis+and+cellular+localization+of+the+AlgI%2C+AlgJ%2C+and+AlgF+proteins+required+for+O+acetylation+of+alginate+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).</li>
<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
<li>Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis%3A+role+of+mucC+in+the+regulation+of+alginate+production+and+stress+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity.</a> Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).</li>
<li>Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+locus+determining+the+mucoid+status+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+AlgU+shows+sequence+similarities+with+a+Bacillus+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor.</a> J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+the+Crc+regulon+identifies+genus-wide+and+species-specific+targets+of+catabolite+repression+control+in+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria.</a> BMC Microbiol. 10, 300 (2010).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).</li>
<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

De auteur Hongwei D. Yu is de Chief Science Officer en medeoprichter van Progenesis Technologies, LLC.

Het is belangrijk op te merken dat deze methode kan worden gebruikt in andere Pseudomonas species met deze aanpassingen: incuberen P. fluorescens en P. putida bij 30 ° C en P. stutzeri bij 42 ° C; P. stuzeri worden gekweekt op LB-platen gesupplementeerd met 150 ug / ml gentamycine, in stap 1.11, blz. stutzeri cellen worden overgebracht in 500 ui LB plaats van 1 ml. Daarnaast zijn er twee belangrijke stappen voor dit protocol. Ten eerste moet de ontvangende stam gekwe...

Het vermogen van de opportunistische, Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa te alginaat overproductie is een belangrijke factor in het vermogen om een biofilm stellen. De overproductie van alginaat is een fenotype vaak aangeduid als mucoidy. De isolatie van slijmerige kolonies van de sputa van personen die lijden aan cystische fibrosis (CF) is een indicatie van een chronische infectie, en is rechtstreeks verbonden met een algemene daling van de gezondheid van de patiënt 1. Momenteel wordt ervan uitgegaan dat de verordening en de productie van alginaat in P. aeruginosa treedt vooral op bij twee operons. De eerste is het alginaat biosynthetische operon, die 12 genen bevat (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - Algx - algL - Algi - algJ - algF - Alga) dat verantwoordelijk is voor de synthese en de uitvoer van het alginaat polymeer over zijn het periplasma aan het extracellulaire environment 2-5. De tweede operon is een cluster van genen te beginnen met de alternatieve sigma factor algU / T en verder met muca, mucB en mucD. AlgU / T is een positieve regulator, terwijl mucAB-D worden geclassificeerd als negatieve regulatoren van alginaat productie 6-8. Bovendien, transcriptiefactoren, zoals ALGB, AlgQ, ALGr en RpoN, alsmede post-transcriptionele en post-translationele modificatie van katabolische repressie controle kinaseactiviteit (KinB) en intramembrane proteolyse, zijn ook getoond betrokken te zijn bij alginaat regelgeving 9-14. De mini-himar1 transposon vector bekend als PFAC werd oorspronkelijk opgericht in Dr Mekalanos &#39;laboratorium aan de Harvard Medical School 15. De PFAC plasmide bestaat uit een transposon geflankeerd door twee omgekeerde herhalingen van 27 bp en een weerstand tegen gentamycine cassette in het midden (aacC1: 534 bp), een gen coderend voor het hyperactive mariner transposase 16, en een gen dat codeert voor β-lactamase (bla) (figuur 1). Sequentie-informatie voor de transposon van PFAC is verkrijgbaar bij de GenBank: DQ366300 13. In PFAC er een meervoudige kloneringsplaats (MCS) dat de aacC1 gen dat wordt gebruikt voor de identificatie van chromosomale insertieplaats middels omgekeerde PCR. Een groot voordeel met behulp van de mini-himar1 transposon is geen specifieke gastheer factoren zijn nodig voor de omzetting (mutagenese). Daarnaast is er een grote dichtheid aan de TA dinucleotide insertieplaatsen gevonden in het genoom van P. aeruginosa. Bijvoorbeeld, TA dinucleotide insertieplaatsen optreedt 94.404 en 100.229 keer in de PAO1 (6.264.404 bps, GenBank NC_002516.2) en PA14 (6.537.648 bps; GenBank toegangsnummer NC_008463) genomen, respectievelijk. Vanwege de overvloed van TA dinucleotide in het genoom, mini-himar1 </em&gt; Transposon kan hoge dichtheid en willekeurige mutagenese, die bijzonder geschikt voor de analyse van virulentie genen en genen die sterk gereguleerd veroorzaken. Theoretisch kan de mini-himar1 transposon te voegen in elke niet-essentieel gen in het genoom van P. aeruginosa. Dit levert ongeveer 18 TA insertieplaatsen per open reading frame in de PAO1 genoom. Hier, een protocol beschrijven we het gebruik van mini-himar1-transposon mutagenese om nieuwe regulatoren van mucoidy in P. identificeren aeruginosa. Meer specifiek, we biparentally geconjugeerd de PFAC vector die een mini-himar1 transposon van E. coli SM10/λpir in de nonmucoid prototrofe stam PAO1. Nadat de transposon is geïntegreerd in het genoom, de ontvangende stam wordt gekweekt op Pseudomonas isolatie agar (PIA) die triclosan die de groei van E. remt coli. Zo een bibliotheek van mutanten van <em&gt; P. aeruginosa kan de groei geselecteerd op PIA plaat aangevuld met gentamycine en de aanwezigheid van de mucoïde fenotype. Let op, een echte transposon-gemedieerde versus een integratie mutant zal een gentamycine resistent en carbenicilline-gevoelige fenotype hebben. In deze studie werden ongeveer 80.000 insertiemutanten van PAO1 geïsoleerd door middel van vier afzonderlijke vervoegingen. We vervolgens gescreend op mucoïde isolaten, en bepaalde de plaats van invoeging door restrictie-enzym digestie, ligatie en omgekeerde PCR. We voerden Southern blot analyse met behulp van weerstand tegen gentamycine cassette als een probe voor het aantal insertie per genoom bekijken. We hebben vastgesteld dat meer dan 90% van mutanten verkregen per conjugatie met dit protocol had slechts een enkele kopie van het himar1 in het genoom en de weergegeven gentamycine resistente en carbenicilline-gevoelige fenotype. Een totaal van 32 mucoïd isolaten werden geïdentificeerd, 22 van hen werden toegewezen aan verschillende loci van de P. aeruginosa PAO1chromosoom. Dit tarief van inbrengen biedt voldoende dekking om verschillende nieuwe regulatoren van alginaat overproductie identificeren.

<table><tbody><tr><td>Luria Broth</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Pseudomonas isolatie-agar</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Kleine platen (100 O.D. x 10 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Grote platen (150 O.D. x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop schudkweekincubator</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>schudden bij 200 rpm</td></tr><tr><td>Incubatorkast</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrofotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>of voorkeursmethode/leverancier</td></tr><tr><td>Wegwaarneembare inoculatiesluizen</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microcentrifugebuisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml cryogeen vials</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>15 ml buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>DNeasy Blood and Tissue (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>of voorkeursmethode/leverancier</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit (250)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>of voorkeursmethode/leverancier</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>of voorkeursmethode/leverancier</td></tr><tr><td>FastLink II DNA Ligation Kit</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Accu block Digital Dry Bath&nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Sal1, restrictie-endonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler, Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>via Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Gentamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml cryogeen vials</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>via Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat productie in<em&gt; pseudomonas aeruginosa</em&gt; het gebruik van mini-<em&gt; himar1</em&gt; mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve, milieu-bacterie met veelzijdige metabolische mogelijkheden. P. aeruginosa is een opportunistische bacteriële pathogenen die chronische longinfecties bij patiënten met cystische fibrose (CF) stelt. De overproductie van een capsulair polysaccharide genoemd alginaat, ook wel mucoidy, bevordert de vorming van slijmerige biofilms die resistenter dan plankton cellen antibiotische chemotherapie en het afweersysteem zijn. Bovendien, de conversie van de nonmucoid tot mucoïde fenotype is een klinische merker voor het ontstaan ​​van chronische infectie bij CF. Alginaat overproductie door P. aeruginosa is een endergonic proces dat zwaar belast cellulaire energie. Daarom wordt alginaat productie sterk gereguleerd in P. aeruginosa. Om beter te begrijpen alginaat regelgeving, een protocol beschrijven we het gebruik van de mini-himar1 transposon mutagenese voor de identificatie van nieuwe alginaat regulators in een prototype stam PAO1. De procedure bestaat uit twee fasen. Eerst hebben we overgedragen de mini-himar1 transposon (PFAC) van gastheer E. coli SM10/λpir in ontvangende P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugatie een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek, die werden geselecteerd op Pseudomonas isolatie agarplaten aangevuld met gentamycine maken. Ten tweede hebben we afgeschermd en geïsoleerd van de slijmerige kolonies op de plaats van inbrengen in kaart door middel van omgekeerde PCR met behulp van DNA-primers naar buiten wijzende uit de gentamycine cassette en DNA-sequencing. Met behulp van dit protocol, hebben we twee nieuwe alginaat regulatoren, MUCE (PA4033) en kinB (PA5484), in stam PAO1 met een wild-type muca codeert voor het anti-sigmafactor muca voor de master alginaat regulator AlgU geïdentificeerd (ALGT, σ 22) . Deze hoog-mutagenese protocol kan worden aangepast voor het identificeren van andere virulentie genen veroorzaken veranderingen in colony morfologie.

Zoals weergegeven in figuur 1, de mini-transposon himar1 mariner vector, PFAC bevat twee 27 bp omgekeerde herhalingen met TA insertieplaatsen flankeren de aacC1 gentamycineresistentiegen cassette, met σ 70-afhankelijke promoter, en een meervoudige kloneringsplaats (MCS). Bovendien, de PFAC vector bevat genen die voor de zeer actieve himar1 transposase, β-lactamase (bla) en de tra overdracht operon. De TA insteekopeningen zorgen voor een efficiënte ...

Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van nieuwe genen die geassocieerd zijn met de productie van het exopolysaccharide alginaat in Pseudomonas aerogen met behulp van mini-Hamar-1 transposon-gemedieerde mutagenese. Dit wordt bereikt door eerst twee aparte overnight-culturen te kweken van de donorstam, E. coli Lambda P die het PAC-plasmide draagt, en de recipientcellen Pseudomonas aerogen, PAO1. Vervolgens wordt het PAC-plasmide geconjugeerd door E. coli Lambda P samen te kweken met Pseudomonas aerogen.PAO1- en trans-conjugaten worden geselecteerd op pseudomonas-isolatieagar, waarna mucoïde kolonies worden geïdentificeerd en geïsoleerd op PIA-platen. Vervolgens worden de locatie en oriëntatie van het mini-Tn5-transposon op de insertieplaats binnen het genoom van Pseudomonas aeruginosa PAO1 bepaald. Uiteindelijk wordt door middel van mini-Tn5-gemedieerde mutagenese vastgesteld en gekarakteriseerd welke genen geassocieerd zijn met de productie van alginaat in Pseudomonas aeruginosa.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de microbiologie en bacteriële genetica, zoals het identificeren van genetische loci die betrokken zijn bij de regulatie van verschillende cellulaire functies; ter demonstratie wordt de procedure uitgevoerd meters. Een promovendus uit mijn laboratorium, De mini he R one Mariner transposon vector P fac bevat 2 27 basepaar geïnverteerde herhalingen met TA-insertieplaatsen die de A CC one gentamycine-resistentiecassette flankeren, met een Sigma 70-afhankelijke promotor stroomopwaarts van een multiple cloning site. De PFAC-vector bevat daarnaast genen die coderen voor de zeer actieve he R one transposase, bèta-lactamase en de TRA-transferoperon.De TA-insertieplaatsen maken een efficiënte integratie in het genoom van pseudomonas aerogen-stammen mogelijk. Nauwkeurigheid bij het identificeren en selecteren van OID-mutanten is van cruciaal belang voor het algemene succes bij het bepalen van genloci die betrokken zijn bij de alginaatregulatie. Om bacteriële stammen voor te bereiden, begint u met het inoculeren van e coli SM 10 Lambda peer P fac in vijf milliliter lb, aangevuld met 15 µg/mL Gentamycine, en plaatst u deze gedurende de nacht bij 37 °C in een schudincubator op dezelfde dag.Inoculeer stam PO1 van Pseudomonas aeruginosa in 5 mL LB en plaats deze overnacht in een schudincubator bij 42 °C. Meet de volgende dag de OD 600 van de overnight-culturen en meng gelijke hoeveelheden PAO1 en E. coli P fac, zodanig dat het eindvolume tussen 1 mL en 1,4 mL ligt. Centrifugeer het mengsel bij 6 000 ×g gedurende vijf minuten.Droog ondertussen de LB-platen voor conjugatie door ze 10 tot 15 minuten open te laten staan in een incubator bij 37 °C. Verwijder al het supernatant van het celmengsel, behalve 50 µL. Resuspendeer vervolgens.Suspendeer de celpellet in de resterende 50 µL supernatant en pipetteer deze op een droge LB-plaat. Plaats de plaat met de compacte druppel voorzichtig in een zuurkast om te laten drogen. Zorg ervoor dat de cellen zich niet over de plaat verspreiden.Dit zal de efficiëntie van de conjugatie aanzienlijk verminderen. Zodra de druppel droog is, wordt de LB-plaat omgekeerd en vier tot zes uur geïncubeerd bij 37 °C terwijl het celmengsel wordt geïncubeerd. Bereid Pseudomonas isolation agar (PIA)-platen voor met 300 µg/mL gentamicine.Gebruik na de incubatie een steriele inoculatielus om deze enkele druppel cellen op te vangen in een microcentrifugebuis met één milliliter LB; meng grondig met een vortexmixer of pipet voordat de cellen gelijkmatig over de grote PIA-platen worden uitgestreken. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C. Haal de platen uit de incubator en inspecteer deze op OID-kolonies.Isoleer een enkele moid-kolonie en strijk deze uit voor isolatie op kleine platen met PIA en 300 micrograms per milliliter Gentamycin. Isoleer de volgende dag een enkele moid-kolonie en herhaal het uitstrijken. Herhaal de isolatie van enkele kolonies nog twee keer om de stabiliteit van het moid-isolaat na de initiële isolatie te bepalen.Inoculeer 4,5 milliliters LB met een enkele OID-kolonie en incubeer dit gedurende de nacht in een schudincubator bij 37 degrees Celsius. Label de volgende dag drie microcentrifugebuisjes voor elke OID-mutant. Bereid twee aliquoten van 1,25 milliliter van de overnight-cultuur voor genomische DNA-extractie en identificatie van de transposon-insertieplaats.Archiveer daarnaast elke OID-mutant door één milliliter van de overnight-cultuur te pipetteren in een适当 gelabelde cryovial die een gelijk volume 10% skim milk bevat. Bewaar bij -86 °C. Na het extraheren van het gDNA uit de MOID-mutant.Digesteer, met een naar keuze methode en na bepaling van de concentratie, in totaal 2 µg DNA met 1 µL van het restrictie-endonuclease S one in een totaalvolume van 50 µL gedurende de nacht bij 37 °C. Nadat het gedigesteerde DNA met een naar keuze methode is gezuiverd tot een totaalvolume van 25 µL, wordt een ligatiereactie voorbereid met ongeveer 11 µL DNA, waarna het mengsel gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur wordt geïncubeerd. Inactiveer dit vervolgens 15 minuten bij 70 °C en voer IPCR uit op het ligatieproduct met behulp van de volgende forward- en reverse-primers en thermocycling-condities.Verifieer vervolgens de amplificatie op een AROS-gel voordat de GM three out- en GM five out-primers worden gebruikt om de reactie te sequensen. Voorbeelden van MOID- en niet-MOID-isolaten worden in deze figuur getoond. Op basis van het in deze video gedemonstreerde protocol zou elke conjugatie een bank van ongeveer 20.000 mutanten over 15 tot 20 grote platen moeten opleveren vanwege de overproductie van alginaat.De moid-kolonie moet helder of wit van kleur zijn en een romig of slijmerig uiterlijk hebben. Als de mutagenese en DNA-amplificatie succesvol zijn, moet er een enkel amplicon van de juiste grootte aanwezig zijn, zoals geïllustreerd in deze figuur. Er is een afwezigheid van IPCR-amplicon in PAO één.We detecten echter een enkel amplicon van ongeveer 1, 400 baseparen in PA, O one VE two, en ongeveer 1000 baseparen in PA O one VE 13. De grootte van deze amplicons komt overeen met de insertie van het HE R one mariner transposon in de promoterregio van PA 4 0 3 3 in PA oh one VE two, en intern in PA 5 4 84 in PA oh one VE 13. PA oh one genomisch DNA dat restrictiedigestie en ligatie heeft ondergaan, kan als negatieve controle worden gebruikt.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in drie of vier dagen worden uitgevoerd, mits dit correct gebeurt. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de bacteriële stammen bij de juiste temperatuur te incuberen voorafgaand aan de bio-ouderlijke conjugatie.

identification-novel-genes-associated-with-alginate-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.

Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Dit is een aangepaste methode voor het identificeren van kandidaat-insectenkolonisatiefactoren in een Burkholderia gunstige symbiont. De kevergastheer is geïnfecteerd met een willekeurige mutantenbibliotheek gegenereerd via transposonmutagenese en de complexiteit van de bibliotheek na kolonisatie wordt vergeleken met een controle die in vitrois gekweekt.

Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

Ontdek mini-Himar1 transposon-gemedieerde mutagenese voor identificatie van nieuwe alginatregulatoren in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Deze methode genereert een mutantenbibliotheek voor microbiologisch onderzoek.

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in Pseudomonas aeruginosa Het gebruik van mini- Himar1 Mariner transposon-gemedieerde mutagenese (Video) | JoVE Journal

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in

Meer video's verkennen