Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Het algemene doel van deze procedure is om weinig voorkomende celoppervlak membraaneiwitten te verrijken. Dit wordt bereikt door eerst de membraaneiwitten te denatureren en te verteren. De tweede stap is om de glycanen te oxideren en de geglycoseerde peptiden op een harsoppervlak te vangen.

De niet-glycopeptiden worden vervolgens van de hars afgewassen. De laatste stap is het vrijgeven van de N-gekoppelde glycopeptiden van de hars voor lc MS-analyse. Uiteindelijk kan de geïdentificeerde peptidesequentie worden teruggevoerd naar eiwitten voor identificatie en kwantificering.

Vandaag ga ik u laten zien hoe de Geico peptide-vangst ral werkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek overdose, ex existent ones, zoals glycoproteïnevangst, is dat het membraaneiwit eerst wordt verteerd en het vangen van het glycopeptide kan in één vat worden uitgevoerd. De toepassing van deze techniek kan worden uitgebreid tot de ontdekking van de ziekte-biomarker.

Aangezien gator-eiwit kan worden afgescheiden in het bloed en andere lichaamsvloeistoffen en de circulerende glycoproteïnen in het bloed, die specifiek zijn voor het pathologische proces, kunnen worden gebruikt als prognose- en diagnosebiomarkers. Bereid eerst vier milliliter hypotone buffer met een protease-remmercocktail van één tot 100. Voeg een milliliter hypotone buffer toe aan een celluair pellet met ongeveer 10 tot de achtste cellen en incubeer het mengsel gedurende 15 tot 30 minuten op ijs, breng de cellen over in een tweeduizend milliliter vial en lyseer de cellen door het monster vijf tot 10 keer door een spuitnaald te laten passeren.

Gebruik vervolgens een hemo cytometer en trian blauw kleuring. Om de efficiëntie van de lysis te controleren, combineer de een milliliter lysate met drie milliliter resterende hypotone buffer. Draai de buis 15 minuten bij 3000 keer G bij vier graden Celsius.

Breng de super supernatant over in een ultracentrifugebuis en bewaar de pellet in een negatieve 80 graden Celsius vriezer. Draai de ultracentrifugebuis twee uur bij 100.000 keer G bij vier graden Celsius. Los vervolgens de microsomale fractie op in 200 microliter denaturatiebuffer en kook de oplossing gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius.

Nadat de verwarmde oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u ultrahoge zuiverheids ureipoeder toe om een ​​eindconcentratie van acht molar te verkrijgen en incubeert u het monster gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg na de incubatie 500 millimolar toe. I oto Acetamide stockoplossing toe aan het monster om een ​​eindconcentratie van 15 millimolar te geven.

Bewaar vervolgens de oplossing gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur om de vrije thiolen in het monster te alkyleren. Voeg vervolgens een molaire DTT stockoplossing toe aan het monster om een ​​eindconcentratie van 10 millimolar te geven en incubeer de oplossing nog eens 10 minuten bij kamertemperatuur. Om de overmatige I oto Acetamide te dempen, verdunt u de verkregen oplossing 10 keer met 40 millimolair tris-buffer bij PH acht en voegt u vervolgens trypsine toe aan het monster in een verhouding van één tot 20 van trypsine tot totale eiwithoeveelheid.

Verkrijg de hoeveelheid totaal eiwit met behulp van de Bradford-test. Houd de verteringsreactie een nacht in een 37 graden Celsius oven om ervoor te zorgen dat de reactie is voltooid. Wanneer u klaar bent, beëindig de vertering door de monstersoplossing aan te zuur tot pH een met 10 millimolair zoutzuur, een voorwaarde die ook de rapidest degradeert.

De detergent degradeert vervolgens de rapidest bij 37 graden Celsius gedurende één uur in een incubator. Na incubatie verwijdert u de ontwikkelde neerslag door centrifugatie. Reinig de SUP natin die de monsterpeptiden bevat met een C 18 vaste fase-extractiecartridge en droog het verkregen monster door speed vac.

Voer een SDS-pagina-analyse uit van monsters voor en na trips en vertering om de verteringsefficiëntie te bevestigen. Los op dit punt de gereinigde peptiden op in 200 microliter koppelingsbuffer. Nadat natriumpuriate is toegevoegd aan de peptideoplossing om een ​​eindconcentratie van 10 millimolar te geven.

Bewaar het monster gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur Wanneer de incubatie voltooid is, dempt u de overmatige prate met natriumsulfiet om een ​​eindconcentratie van 20 millimolar en een pH van vijf te geven na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 200 microliter hydrocyte-afgeleide harsoplossing toe, voorgeëquilibreerd en koppelingsbuffer in de peptideoplossing. Bewaar de reactie bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee dagen met end-to-end rotatie voor volledige koppeling. Wanneer u klaar bent, verwijdert u de ongebonden peptiden door de hars twee keer te wassen met een milliliter gedeïoniseerd water, een milliliter 1,5 molair natriumchloride, een milliliter methanol en een milliliter 80% acetonitril.

Verzamel vervolgens het supernatant en de wasbeurten voor de analyse van ongebonden peptiden. Bewaar de monsters in een min 80 graden Celsius vriezer tot analyse. Was vervolgens de hars drie keer met een milliliter 100 millimolair ammoniumbicarbonaat bij pH acht.

Voeg tenslotte 300 microliter ammoniumbicarbonaat toe aan het monstervial. Om de N-glycopeptiden van de hars te ontbinden. Voeg PNG ACE F toe en incubeer het monster bij 37 graden Celsius met een end-to-end rotatie.

Verzamel vervolgens de vrijgekomen peptiden door centrifugatie en was vervolgens de hars met een milliliter 80% acetylnitrile. Combineer de was met de eerder verzamelde. Droog ten slotte de verkregen oplossing in de speed VAC voor lc MS-analyse.

Een atypisch glycopeptidespectrum dat na de verrijkingsmethode is genomen, wordt hier weergegeven in het verkregen glycopeptide. Het n-glycaan werd verwijderd en het glycaan dat eraan gehecht was, werd omgezet in een aspartinezuur door P-N-G-A-F. Daarom kan het spectrum gemakkelijk worden doorzocht door elke proteomische zoekmachine tegen gangbare eiwitsequentiedatabases.

Atypisch lc MS. Result