Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Het algemene doel van deze procedure is het verrijken van celoppervlakte-membraaneiwitten met een lage abundantie. Dit wordt bereikt door eerst membraaneiwitten te denatureren en te verteren. De tweede stap is het oxideren van de glycanen en het vangen van de geglycosyleerde peptiden op een harsoppervlak.

De niet-glycopeptiden worden vervolgens van de hars gewassen. De laatste stap is het vrijmaken van de N-gekoppelde glycopeptiden van de hars voor lc MS-analyse. Uiteindelijk kan de geïdentificeerde peptidevolgorde worden teruggekoppeld naar eiwitten voor identificatie- en quantificatiedoeleinden.

Vandaag ga ik u demonstreren hoe de Geico peptide-capturaal werkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals glycoproteïne-captuur, is dat het membraaneiwit eerst wordt afgebroken en de captuur van het glycopeptide in één vat kan worden uitgevoerd. De toepassing van deze techniek kan worden uitgebreid naar de ontdekking van ziektebiomarkers.

Aangezien gator-eiwit kan worden afgescheiden in het bloed en andere lichaamsvloeistoffen, en het circulerende glycoproteïne in het bloed, dat specifiek is voor het pathologische proces, kan worden gebruikt als prognostische en diagnostische biomarkers. Bereid eerst vier milliliter hypotone buffer met een protease-inhibitorcocktail in een verhouding van 1:100. Voeg één milliliter hypotone buffer toe aan een celpellet met ongeveer 10⁸ cellen en incubeer het mengsel 15 tot 30 minuten op ijs. Breng de cellen over naar een flacon van twee milliliter en lyseer de cellen door het monster vijf tot 10 keer door een injectienaald te drukken.

Gebruik vervolgens een hemocytometer en trypanblauwkleuring. Om de efficiëntie van de lysis te controleren, mengt u de 1 mL lysaat met 3 mL van de resterende hypotone buffer. Centrifugeer de buis bij 3000 ×g bij 4 °C gedurende 15 minuten.

Breng het supernatant over naar een ultracentrifugebuis en bewaar het pellet in een vriezer van -80 °C. Centrifugeer de ultracentrifugebuis bij 100,000 ×g bij 4 °C gedurende twee uur. Los vervolgens de microsomale fractie op in 200 µL denaturatiebuffer en kook de oplossing daarna 10 minuten lang bij 100 °C.

Nadat de verhitte oplossing is afgekoeld tot kamertemperatuur, voegt u ultra-zuiver ureumpoeder toe om een uiteindelijke concentratie van 8 M te verkrijgen en incubeert u het monster 30 minuten bij 37 °C. Voeg na incubatie een 500 mM iotoacetamide-stamoplossing toe aan het monster om een uiteindelijke concentratie van 15 mM te verkrijgen.

Incubeer de oplossing vervolgens 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur om de vrije thiolen in het monster te alkyleren. Voeg daarna een DTT-stamlopossing van 1 M toe aan het monster om een eindconcentratie van 10 millimolar te verkrijgen en incubeer de oplossing nogmaals 10 minuten bij kamertemperatuur. Om het overmaat aan iodoacetamide te quenchen, wordt de verkregen oplossing 10 keer verdund met 40 millimolar trisbuffer bij pH 8, waarna trypsine aan het monster wordt toegevoegd in een verhouding van 1:20 trypsine ten opzichte van de totale eiwithoeveelheid.

Bepaal de hoeveelheid totaal eiwit met behulp van de Bradford-assay. Laat de digestiereactie gedurende de nacht in een oven bij 37 °C staan om te waarborgen dat de reactie volledig is voltooid. Beëindig de digestie vervolgens door de monsteroplossing te verzuren tot pH 1 met 10 mM zoutzuur, een conditie die tevens de rapidest degradeert.

Het detergent degradeert vervolgens het snelst bij 37 °C gedurende één uur in een incubator. Verwijder na incubatie het gevormde precipitaat door middel van centrifugatie. Reinig het supernatant dat de monsterpeptiden bevat met een C 18 solid phase extraction-cartridge en droog het verkregen monster met een speed vac.

Voer een SDS-PAGE-analyse uit van de monsters voor en na de tripsine-digestie om de efficiëntie van de digestie te bevestigen. Los op dit punt de gezuiverde peptiden op in 200 µL koppelingsbuffer. Voeg vervolgens natriumpyruvaat toe aan de peptideoplossing om een uiteindelijke concentratie van 10 mM te verkrijgen.

Incubeer het monster 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Wanneer de incubatie is voltooid, wordt het overmaat aan prate geneutraliseerd met natriumsulfiet tot een uiteindelijke concentratie van 20 millimolar en een pH van vijf. Na incubatie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur worden 200 microliters van de vooraf geëquilibreerde hydrocyte-derivaatharsoplossing en koppelingsbuffer aan de peptide-oplossing toegevoegd. Incubeer de reactie bij 37 degrees Celsius gedurende één tot twee dagen met end-to-end rotatie voor volledige koppeling. Verwijder na voltooiing de ongebonden peptiden door de hars tweemaal te wassen met één milliliter gedeïoniseerd water, één milliliter 1,5 molar natriumchloride, één milliliter methanol en één milliliter 80% aceto nitrile.

Verzamel vervolgens het supernatant en de wasfracties voor de analyse van de ongebonden peptiden. Bewaar de monsters in een vriezer op -80 °C tot aan de analyse. Was de hars vervolgens drie keer met 1 mL 100 mM ammoniumbicarbonaat bij pH 8.

Voeg ten slotte 300 µL ammoniumbicarbonaat toe aan het monsterbuisje om de N-glycopeptiden van de hars te laten lossen. Voeg PNGase F toe en incubeer het monster bij 37 °C met een end-to-end rotatie.

Verzamel vervolgens de vrijgekomen peptiden door centrifugatie en was de hars daarna met één milliliter 80% acetonitril. Voeg het wassel samen met de eerder verzamelde fracties. Droog tot slot de verkregen oplossing in de speed VAC voor lc MS-analyse.

Een atypisch glycopeptidespectrum, opgenomen na de verrijkingsmethode, wordt hier getoond in het verkregen glycopeptide. Het n-glycaan werd verwijderd en het gekoppelde glycaan werd door P-N-G-A-F omgezet in een aspartaatresidu. Daarom kan het spectrum eenvoudig worden doorzocht met elke proteomische zoekmachine tegen gangbare eiwitsequentiedatabanken.

Atypische lc MS. Het resultaat van de gevangen n-glycopeptiden wordt hier getoond, waarbij meer dan 100 glycoproteïnen kunnen worden geïdentificeerd uit één enkele lc MS-run van een microsomale cellenfractie. De verrijkingsselectiviteit voor zowel glycoproteïnen als glycopeptiden is over het algemeen meer dan 90%. Een succesvolle analyse kan een verrijkingsselectiviteit van 95% hebben door gebruik te maken van een SCX-kolom en een stapsgewijze gradiënt voor verdere fractionering. De monsters voorafgaand aan de LCMS-analyse zullen gewoonlijk het aantal geïdentificeerde glycoproteïnen verdubbelen.

Soms, wanneer de hoeveelheid verkregen glycopeptiden laag is, kunnen onzuiverheden die uit de vials zijn geaccumuleerd in het uiteindelijke monster worden waargenomen. Deze contaminanten kunnen worden verwijderd met een MCX-kolom. Ik hoop dat u na het bekijken van deze video een goed inzicht heeft gekregen in hoe onze methoden voor het opvangen van glycopeptiden kunnen worden gebruikt om zelf-service membraaneiwitten te bestuderen.

Tijdens het uitvoeren van dit protocol is het ook belangrijk om per stap monsters apart te zetten voor probleemoplossing. Het volume van het reagens kan bovendien worden geoptimaliseerd voor uw specifieke onderzoek.