Name: Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer glycopeptide-capture voor celoppervlakproteomics om laag abundante membraaneiwitten te verrijken. Deze methode combineert oxidatie van glycanen, harsbinding en LC-MS-analyse voor identificatie en kwantificatie van glycoproteïnen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek is ondersteund door het opstarten fonds van Simon Fraser University.

1. Harvest Membranen <ol><li> Voeg hypotonische buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, pH 8,0) met proteaseremmer cocktail op een celpellet (~ 10 8 cellen) en incubeer gedurende 15-30 min. op ijs. Lyseren van de cellen door het monster door injectienaalden (5-10 passages) of homogeniseren van het monster door een Dounce homogenisator (15-30 slagen). Gebruik een hemocytometer en trypan blauw kleuring om de efficiëntie van lysis controleren. </li><li> Het verkrijgen van de microsomale fractie door een differentiële centrifugatie van het lysaat op 3000 gx 15 min en vervolgens bij 100.000 gx 2 uur. De eerste centrifugatie verkrijgt een pellet die de nucleaire fractie en de daaropvolgende centrifugatie van het supernatant genereert een tweede pellet, die de microsomale fractie die het plasmamembraan en membraangebonden organellen 8 bevat. De uiteindelijke supernatant is de cytosolische fractie. Bewaar de microsomale fracties in -80 ° C vriezer voor verdere analyszoals hieronder aangegeven. </li></ol> 2. Los, Denatureren en Digest membraaneiwitten <ol><li> Los de microsomale fractie van de denaturatie buffer (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8) en incubeer de oplossing bij 100 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Koel de oplossing verwarmd tot kamertemperatuur, voeg ultrazuivere ureum poeder in de oplossing van 8 M eindconcentratie en incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 30 minuten. </li><li> Voeg iodoacetamide voorraadoplossing van het monster naar 15 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing in het donker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de vrije thiolen alkyleren in het monster. Voeg DTT voorraadoplossing van het monster naar 10 mM eindconcentratie en incubeer de oplossing gedurende nog 10 minuten bij kamertemperatuur om het buitensporige joodacetamide blussen. </li><li> Verdun de verkregen oplossing 10x met 40 mM Tris-buffer bij pH 8 en vervolgens trypsine toe te voegen aan het monster bij een 01:20 verhouding van trypsin totale eiwit. Handhaaf de spijsvertering reactie in een 37 ° C oven gedurende de nacht te waarborgen van de reactie af. </li><li> Beëindig de spijsvertering door het aanzuren van het monster tot pH 1 met HCl, een aandoening die ook breekt het wasmiddel, dwz Rapigest. Degraderen de Rapigest bij 37 ° C gedurende 1 uur, en verwijder de ontwikkelde neerslaan door centrifugeren. </li><li> Reinig het supernatant dat monster peptiden bevat door een C-18 vaste-fase-extractie (SPE) cartridge en droog het verkregen monster door speedvac. </li><li> Voer een SDS-PAGE analyse van monsters voor en na trypsine digestie om de destructie efficiëntie bevestigen. </li></ol> 3. Glycopeptide Capture <ol><li> Los het gereinigde peptiden in de koppeling buffer (100 mM natriumacetaat, pH 5,5). Voeg natriumperjodaat in de peptide oplossing bij een eindconcentratie van 10 mM gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Hierdoor wordt de cis-diolgroepen in de glycanen te oxideren tot aldehyden, Die de glycanen te koppelen aan de hars door hydrazide chemie staan. Doof het buitensporige perjodaat met natriumsulfiet in een 20 mM eindconcentratie en pH 5 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Invoering-hydrazide gederivatiseerd hars in de peptide oplossing bij een verhouding van 1:4 (hars oplossing) te koppelen glycopeptiden aan het hars. Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 1-2 dagen met end-to-end rotatie voor complete koppeling. </li><li> Verwijder ongebonden peptiden door het wassen van de hars tweemaal met 1 ml van elk van de volgende: gedeïoniseerd water, 1,5 M NaCl, methanol en 80% acetonitril. Tenslotte was de hars 3x met 1 ml 100 mM NH 4 HCO 3 bij pH 8 bij de buffer van het uitwisselingssysteem 100 mM NH 4 HCO 3. <ol><li> Verzamel de bovenstaande vloeistof en wassen voor de analyse van ongebonden peptiden (optioneel). </li></ol></li><li> Laat de N-glycopeptiden van de hars door PNGase F per nacht incubatie bij 37 ° C met eenn end-to-end rotatie. Verzamel de vrijgegeven peptiden door centrifugeren en een 80% acetonitril wassen. Droog de verkregen oplossing in de speedvac van LC-MS analyse. </li></ol> 4. Verdere fractionering (optioneel) Verder te vereenvoudigen complexiteit monster, fractioneren de verkregen N-glycopeptiden. Bijvoorbeeld, los het gedroogde peptiden in 10 mM ammonium formate, pH 3 met 20% acetonitril en gebruik sterke kationenwisselaar (SCX) chromatografie om de peptiden fractioneren. Droog de ​​verkregen eluens en vervolgens analyseren van de verkregen peptide fracties door omgekeerde-fase LC-MS 8,17,18. Reinigen 5. Van de Uitgebracht N-glycopeptiden (optioneel) Als bezorgdheid rijzen potentiële vervuiling van de peptiden, los het gedroogde peptiden in 0,1% mierenzuur en gebruik een kolom MCX SPE verder reinigen peptiden voor omgekeerde fase LC-MS analyse. <strong&gt; Opmerking: Database zoeken parameters. Tijdens de selectieve splitsing van N-glycopeptiden uit het hars, PNGase F zet de N-glycaan asparagine gebonden aan een asparaginezuur. Daarom is er een 0,9840 Da massaverschuiving het vrijgemaakte N-glycopeptiden. Om deze peptiden nauwkeurig te identificeren, deze wijziging moet worden toegevoegd aan de zoekparameters alsmede gemeenschappelijke modificaties zoals de carbamidomethylation van cysteïne en oxidatie van methionine.

<ol><li>Cho, W., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+interactions+in+cell+signaling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biophysics+and+biomolecular+structure%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).</li>
<li>Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptor+signalling+in+the+cardiac+nuclear+membrane%3A+evidence+and+possible+roles+in+physiological+and+pathophysiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptor signalling in the cardiac nuclear membrane: evidence and possible roles in physiological and pathophysiological function.</a> The Journal of physiology. 590, 1313-1330 (2012).</li>
<li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+dissection+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biophysical dissection of membrane proteins.</a> Nature. 459, 344-346 (2009).</li>
<li>Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology.+%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology. </a> Nature reviews Molecular cell biology. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high-resolution+proteomics+for+data-driven+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology.</a> Annual review of biochemistry. 80, 273-299 (2011).</li>
<li>Lamond, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+cell+biology+through+proteomics+in+space+and+time+%28PROSPECTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advancing cell biology through proteomics in space and time (PROSPECTS).</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Savas, J. N., Stein, B. D., Wu, C. C., Yates 3rd, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+accelerates+membrane+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry accelerates membrane protein analysis.</a> Trends in biochemical sciences. 36, 388-396 (2011).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+glycopeptide+capture+approach+coupled+with+mass+spectrometry+for+comprehensive+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun glycopeptide capture approach coupled with mass spectrometry for comprehensive glycoproteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 141-149 (2007).</li>
<li>Lowe, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation%2C+immunity%2C+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation, immunity, and autoimmunity.</a> Cell. 104, 809-812 (2001).</li>
<li>Dodds, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+dissociation+of+glycosylated+peptide+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+spectrometry+reviews%22%5BJournal%5D)">Gas-phase dissociation of glycosylated peptide ions.</a> Mass spectrometry reviews. 31, 666-682 (2012).</li>
<li>Kaji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin+affinity+capture%2C+isotope-coded+tagging+and+mass+spectrometry+to+identify+N-linked+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lectin affinity capture, isotope-coded tagging and mass spectrometry to identify N-linked glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 21, 667-672 (2003).</li>
<li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry%2C+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat Biotechnol. 21, 660-666 (2003).</li>
<li>Hagglund, P., Bunkenborg, J., Elortza, F., Jensen, O. N., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+for+identification+of+N-glycosylated+proteins+and+unambiguous+assignment+of+their+glycosylation+sites+using+HILIC+enrichment+and+partial+deglycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">A new strategy for identification of N-glycosylated proteins and unambiguous assignment of their glycosylation sites using HILIC enrichment and partial deglycosylation.</a> J Proteome Res. 3, 556-566 (2004).</li>
<li>Bond, M. R., Kohler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+for+glycoprotein+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Chemical methods for glycoprotein discovery.</a> Current opinion in chemical biology. 11, 52-58 (2007).</li>
<li>Pasini, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+analysis+of+the+membrane+and+cytosolic+proteome+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In-depth analysis of the membrane and cytosolic proteome of red blood cells.</a> Blood. 108, 791-801 (2006).</li>
<li>Wollscheid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+identification+and+relative+quantification+of+N-linked+cell+surface+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric identification and relative quantification of N-linked cell surface glycoproteins.</a> Nat Biotechnol. 27, 378-386 (2009).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycoproteome+of+E14.Tg2a+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">N-Glycoproteome of E14.Tg2a mouse embryonic stem cells.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Hier introduceren we een glycopeptide-capture strategie voor het profileren van cel-oppervlakte-eiwitten. De werkwijze kan worden toegepast voor uitgescheiden eiwitten, zoals in bloed, en in andere lichaamsvloeistoffen of celkweek media. Het succes van de werkwijze berust op het volledige digestie van monsters; Daarom, een SDS-PAGE karakterisatie van de spijsvertering efficiëntie noodzakelijk, vooral voor de eerste keer analyse van een monster. Een volledige digestie kan een uitdaging voor m...

Celoppervlakte-eiwitten interageren met de omgeving en relais signalen van buiten naar de binnenkant van een cel. Aldus zijn deze eiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, spelen kritieke rollen in alle aspecten van cellulaire biologie en fysiologie variërend van proliferatie, groei, migratie, differentiatie veroudering enzovoort. Oppervlakte-eiwitten functioneren door interactie met andere cellen, eiwitten en kleine moleculen 1-3. Moleculaire karakterisering van cel-oppervlakte-eiwitten van groot belang, niet alleen voor biologen, maar ook voor farmaceutische bedrijven, aangezien meer dan 60% van geneesmiddelen gericht op het celoppervlak eiwitten 4. Tandem massaspectrometrie (MS), met zijn superieure gevoeligheid, nauwkeurigheid en doorvoer voor de identificatie van eiwitten en peptiden, is een krachtig hulpmiddel voor globale proteomics studies 5,6. Toch, oppervlakte-eiwitten vormen belangrijke uitdagingen voor MS-gebaseerde proteomics, alsde meeste oppervlakte-eiwitten bestaan ​​in kleine hoeveelheden en met zware modificaties. De membraanoverspannende gebieden van de oppervlakte-eiwitten hen hydrofoob te maken; dit is vooral het geval voor multipass transmembraaneiwitten. Het is dus moeilijk om membraaneiwitten in waterige oplossingen oplossen zonder de hulp van een detergens; echter het gebruik van reinigingsmiddelen onderdrukt het algemeen van de HPLC en MS 1,7,8 in proteïne-identificatie. Daarom membraaneiwitten zijn slecht gekenmerkt directe LC-MS gebaseerde proteomics. Glycosylatie is een van de belangrijkste en meest voorkomende post-translationele modificaties die in cel-oppervlakte-eiwitten 9. De enorme complexiteit en de heterogeniteit van glycanen belemmeren peptiden &#39;MS signaal 10. Niettemin hebben verscheidene proteomics methoden deze unieke modificatie gebruikt om oppervlakte-eiwitten te verrijken en de suiker-resten van eiwitten voorafgaand aan LC-MS analyse te verwijderen. Deze methodes onder-lectine gebaseerde affiniteit capture 11 en-hydrazide gebaseerde of boorzuur gebaseerde chemische capture 12 evenals hydrofiele chromatografie scheidingen 8,13. De verwijdering van glycanen transformeert membraaneiwitten om regelmatig eiwitten en vereenvoudigt de MS karakterisering drastisch. Omdat glycosylering vindt ook plaats in uitgescheiden eiwitten die een hoge oplosbaarheid in tegenstelling tot eiwitten membraan, zijn veel glycoproteoomanalyse werkwijzen geoptimaliseerd voor oplosbare eiwitten en gewoonlijk minder glycopeptide selectiviteit en gevoeligheid wanneer ingezet eiwitten 8,14 membraan hebben. Andere methoden bestaan ​​ook te verrijken met name cel-oppervlakte-eiwitten, zoals die met ultracentrifuge 15 en labeling strategieën 16. Een gedetailleerde vergelijking van onze werkwijze en andere bestaande methodes voor het karakteriseren membraaneiwitten werd uitgevoerd onlangs 17 en de resultaten gaven aan dat onze werkwijze evengoed presteren, zonietbeter dan alle vergeleken membraan proteomics methoden, maar met hogere eenvoud. Om u te helpen onderzoekers gebruiken deze methode, we detail hier een algemeen protocol. Deze methode integreert verschillende voordelen van het bestaande glycoproteoomanalyses strategieën en is speciaal ontworpen voor membraanglycoproteïnen, maar de methode werkt net zo goed voor uitgescheiden eiwitten. De kenmerken van deze methode zijn: 1) een volledige solubilisering van membraaneiwitten, 2) een verrijking van glycopeptiden plaats van glycoproteïnen aan de potentiële sterische hindering te verwijderen bij gebruik van een vast substraat vastleggen, 3) het gebruik van hydrazide chemie covalente bindingen te vormen tussen glycopeptiden en vastleggen substraat, zodat de gebonden glycopeptiden stringente wasbehandelingen voor hoge glycoselectivity kan tolereren, en 4) de mogelijkheid om de gehele vastlegprocedure voeren in een buis voor verminderd monster en verkorte procedure duur. Na de implementatie van deze methode om het bestuderen van een varischappij van biologische monsters zoals cellen en weefsels, observeerden we een hoge selectiviteit (&gt; 90%) aan glycoproteïnen 8,17,18.

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Natriumjodaat</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz hydrazide gel</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Worthington Biomedical</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 cartridge</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX cartridge</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfiet</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>Invertase</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-1 trypsine</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumine</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Conalbumine</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

glycopeptide capture voor celoppervlak proteomics

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Celoppervlakeiwitten, waaronder extracellulaire matrixeiwitten, aan alle belangrijke cellulaire processen en functies, zoals groei, differentiatie en proliferatie. Een uitvoerige karakterisatie van deze eiwitten biedt rijke informatie voor de ontdekking van biomarkers, celtype-identificatie, en drug-target selectie, evenals het helpen om ons begrip van cellulaire biologie en fysiologie te bevorderen. Oppervlakte-eiwitten, echter, vormen belangrijke analytische uitdagingen, vanwege hun inherent lage overvloed, hoge hydrofobiciteit, en zware post-translationele modificaties. Profiterend van de heersende glycosylering op oppervlakte-eiwitten, introduceren we hier een high-throughput glycopeptideresistente capture benadering die de voordelen van een aantal bestaande N-glycoproteoomanalyses middelen integreert. Onze methode kan de glycopeptides afgeleid van oppervlakte-eiwitten te verrijken en te verwijderen van hun glycanen voor facile proteomics via LC-MS. De opgeloste N-glycoproteome omvat de informatie eiwit identiteit en kwantiteit als hun sites van glycosylering. Deze methode is toegepast op een reeks studies in gebieden zoals kanker, stamcellen en druggiftigheid. De beperking van de werkwijze ligt in de geringe hoeveelheden oppervlakte-membraaneiwitten, zodat een relatief grote hoeveelheid monsters is vereist voor deze analyse werden studies gericht op cytosolische eiwitten.

Een representatief stroomschema van de experimentele procedure wordt samengevat in figuur 1. De etikettering en verdere fractionering stappen zijn optioneel en details zijn beschreven in een recente publicatie 18. Een andere optie is om de ongewijzigde peptiden, die niet reageren met de hars te analyseren. De voordelen van het analyseren van de ongewijzigde peptiden zijn de mogelijke identificatie van niet-geglycosyleerde peptiden en proteïnen, zoals Claudins in tight junctions; Een bijkomend...

Celoppervlakeiwitten biologisch belangrijke en sterk geglycosyleerd. We introduceren hier een glycopeptide-capture benadering oplosbaar te maken, te verrijken, en deglycosylate deze eiwitten voor facile LC-MS gebaseerde proteomics analyses.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Het algemene doel van deze procedure is het verrijken van celoppervlakte-membraaneiwitten met een lage abundantie. Dit wordt bereikt door eerst membraaneiwitten te denatureren en te verteren. De tweede stap is het oxideren van de glycanen en het vangen van de geglycosyleerde peptiden op een harsoppervlak.De niet-glycopeptiden worden vervolgens van de hars gewassen. De laatste stap is het vrijmaken van de N-gekoppelde glycopeptiden van de hars voor lc MS-analyse. Uiteindelijk kan de geïdentificeerde peptidevolgorde worden teruggekoppeld naar eiwitten voor identificatie- en quantificatiedoeleinden.Vandaag ga ik u demonstreren hoe de Geico peptide-capturaal werkt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals glycoproteïne-captuur, is dat het membraaneiwit eerst wordt afgebroken en de captuur van het glycopeptide in één vat kan worden uitgevoerd. De toepassing van deze techniek kan worden uitgebreid naar de ontdekking van ziektebiomarkers.Aangezien gator-eiwit kan worden afgescheiden in het bloed en andere lichaamsvloeistoffen, en het circulerende glycoproteïne in het bloed, dat specifiek is voor het pathologische proces, kan worden gebruikt a

glycopeptide-capture-for-cell-surface-proteomics

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lectine-geconjugeerde POROS kralen werden gebruikt voor HPLC. Glycopeptide normen dienden als positieve en negatieve controles. MARS-14 leeg is, werd trypsine-verteerd menselijk plasma gechromatografeerd en flow-through (FT) en gebonden fracties verzameld voor ESI-LC-MS/MS analyses. Glycopeptiden werden verrijkt in de gebonden fractie ten opzichte van FT.

Een Lectin HPLC-methode voor het selectief-geglycosyleerde Peptiden Enrich van complexe biologische monsters

De alomtegenwoordige tweede boodschapper c-di-GMP controleert de groei en het gedrag van veel bacteriën. We hebben een nieuwe Capture Compound Mass Spectrometry-gebaseerde technologie ontwikkeld om c-di-GMP-bindende eiwitten biochemisch te identificeren en te karakteriseren in vrijwel elke bacteriesoort.

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Hier beschrijven we protocollen bij zoogdiercellen door solid-state frezen verstoren bij een cryogene temperatuur, produceren een cel uittreksel uit de resulterende cel poeder, en te isoleren eiwitcomplexen van rente door affiniteitsinvangmiddel upon-antilichaam gekoppeld micron-schaal paramagnetische kralen.

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

We presenteren een methode voor de zuivering, detectie en identificatie van diGly peptiden die afkomstig zijn van ubiquitinated eiwitten uit complexe biologische monsters. De gepresenteerde methode is reproduceerbaar, robuust en presteert beter dan gepubliceerde methoden met betrekking tot het diepteniveau van de ubiquitinomenanalyse.

Detectie van eiwitubiquitinatiesites door peptideverrijking en massaspectrometrie

Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.

De toepassing van open zoekgebaseerde benaderingen voor de identificatie van Acinetobacter baumannii O-gebonden glycopeptiden

Posttranslationele modificaties (PTM's) veranderen eiwitstructuren en -functies. Methoden voor de gelijktijdige verrijking van meerdere PTM-typen kunnen de dekking in analyses maximaliseren. We presenteren een protocol met behulp van dual-functionele Ti(IV)-geïmmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografie gevolgd door massaspectrometrie voor de gelijktijdige verrijking en analyse van eiwit N-glycosylatie en fosforylering in pancreasweefsels.

Een spin-tipverrijkingsstrategie voor gelijktijdige analyse van N-glycopeptiden en fosfopeptiden uit menselijke pancreasweefsels

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van biomarkers met een lage abundantie uit gedroogde serummonsters, geïllustreerd met de biomarker progastrine-releasing peptide (ProGRP). Antilichaam-gecoate magnetische kralen worden gebruikt voor de selectieve reiniging en verrijking van een proteotypisch ProGRP-peptide. Het gevangen peptide wordt vervolgens geanalyseerd met vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Microsampling in gerichte massaspectrometrie-gebaseerde eiwitanalyse van eiwitten met een lage abundantie

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Leer glycopeptide-capture voor celoppervlakproteomics om laag abundante membraaneiwitten te verrijken. Deze methode combineert oxidatie van glycanen, harsbinding en LC-MS-analyse voor identificatie en kwantificatie van glycoproteïnen.

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Meer video's verkennen