Laser-induced Breakdown Spectroscopy: Een nieuwe aanpak voor de nanodeeltjes's Mapping en kwantificering in orgaanweefsel

Het algemene doel van deze procedure is om een eenvoudige en robuuste methode te bieden voor het in kaart brengen en kwantificeren van organische en anorganische elementen in biologisch weefsel met tafelinstrumentatie die volledig compatibel is met conventionele optische microscopie. Dit wordt bereikt door een laserpuls te focussen op het betreffende monster om de afbraak en vonkvorming van het materiaal te initiëren. Het plasma zendt straling uit die vervolgens door een spectrometer wordt geanalyseerd.

De tweede stap is het selecteren en identificeren van de spectraallijnen die overeenkomen met de elementen van belang en het scannen van het oppervlak van het monster. Voer vervolgens kalibratiemetingen uit om de elementconcentraties te kunnen bepalen. De laatste stap is het opstellen van de elementaire mapping van het monsterweefsel op basis van alle geregistreerde spectra, met gebruik van een relatieve intensiteit of een concentratieschaal.

Uiteindelijk wordt laser-geïnduceerde breedspectrumanalyse gebruikt om de weefseldistributie van diverse elementen aan te tonen zonder enige markering. In vergelijking met andere bestaande methoden, zoals micro-röntgenfluorescentie of massaspectrometrie-gebaseerde technieken, is laser-geïnduceerde breedspectrumanalyse (LIBS) eenvoudig te implementeren, werkt het bij atmosferische druk en is het compatibel met de meeste optische microscieepsystemen.

Bovendien maakt het mogelijk om een gevoeligheid op PPM-niveau te bereiken met een resolutie in micrometers. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een kernvraag in de nanotechnologie toegepast op biologische studies, zoals de distributie van nanodeeltjes die metallische elementen bevatten binnen een weefselmonster, zonder dat labeling van de nanodeeltjes noodzakelijk is. De techniek kan worden uitgebreid naar de pathologie vanwege de lage detectielimiet bij het detecteren van abnormale metallische elementen, zoals koper, ijzer en aluminium, die in verschillende organen van het lichaam kunnen voorkomen, in het bijzonder in de hersenen. Via deze methode kan inzicht worden verkregen in de detectie en identificatie van nanodeeltjes.

Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals de detectie van anorganische elementen in TCU of heterogene elementverdeling. Wetenschappers die dergelijke experimenten uitvoeren, zullen moeten optimaliseren met de acquisitie-instellingen om een maximaal signaal te verkrijgen zonder de monsters te veel te beschadigen. Begin het experiment door de objectglaasjes voor te bereiden die in dit protocol worden bestudeerd.

Verkrijg organen van tumordragende muizen, geïnjecteerd met een gadolinium-nanodeeltjesoplossing, om coupes te maken. Plaats plakjes van de organen met een dikte van 100 micrometer op een kwartsglasplaat of in een Petrischaal. Bewaar de coupes altijd bij -80 °C.

Bereid vervolgens de monsters voor de kalibratie voor. Label verschillende vials met de concentraties, beginnend bij nul nanomolair en eindigend bij vijf millimolair. Bereid voor elk vial 100 µL van een gadolinium-watermengsel met de juiste concentratie.

Zodra dit is voltooid, wordt een objectglas klaargemaakt. Pipetteer vijf µL uit het eerste vial en breng dit aan op het kwartsglas of de Petri-schaal. Zorg ervoor dat de druppel wordt geïdentificeerd voor later gebruik.

Beweeg drie millimeter langs de omtrek en breng vijf microliters van de volgende concentratie aan op het objectglas. Doe hetzelfde voor elk van de resterende oplossingen. Laat de inhoud van het objectglas 20 minuten drogen bij kamertemperatuur.

Deze opstelling maakt gebruik van een nanoseconde neodymium-aluminium-garnetlaser die een straal met een golflengte van 1064 nanometer produceert. Gebruik een deel van de straal om het spectrometersysteem te synchroniseren. Leid het andere deel via een computergestuurde attenuator om de laserpulsenergie gedurende het gehele experiment aan te passen en te stabiliseren.

Richt de bundel vervolgens op het monstergebied. Focus de bundel op de softwaregestuurde vertaaltafel. Hierop wordt de monsterhouder geplaatst, waarbij één CCD-camera wordt gebruikt om het oppervlak van de monsterhouder te monitoren.

Een andere om de plasmapluim te monitoren. Analyseer het licht van de monsterontleding in een turn turner spectrometer met een ICCD-camera die op -26 °C wordt gehouden. Start voor de meting met het stabiliseren van de laser en het koelen van de camera tot -26 °C.

10 minuten voor het experiment. Gebruik, zodra u klaar bent, de attenuator om de pulsenenergie vast te zetten op vijf millijoule. Haal vervolgens een objectglas op om te bestuderen en bereid u voor om dit op de objecttafel te plaatsen.

Bevestig het monster op de gemotoriseerde monsterhouder. Keer daarna terug naar de computer. Om het monster te positioneren, verplaatst u de tafel zodanig dat een deel van het monster zich in de laserstraal bevindt.

Stel de laserfocus in op ongeveer 100 µm onder het sampleoppervlak. Wanneer dit is gebeurd, vormt de laser kraters van 50 µm of minder. Gebruik de computer om de waarde van de ingangsspleet van de spectrometer in te stellen op 40 µm en de ICCD-parameters voor de mapping-meting.

Pas de positie van de houder aan om een specifiek gebied van het monster te targeten. Maak een panoramische afbeelding met een hoge resolutie van het monster met een breedbandige lichtbron. Gebruik vervolgens software en de vastgelegde afbeelding om het scangebied en de resolutie voor de LIBS te definiëren.

Hier is het raster 100 bij 100 met 100 micrometers tussen de punten. Start de geautomatiseerde acquisitie van de gegevens bij elk punt op het raster. Een spectrum wordt gemeten en naar een bestand opgeslagen.

Wanneer de metingen na ongeveer 30 minuten zijn voltooid, wordt er een tweede afbeelding van de monsterplak gemaakt, waarna alle spectra worden samengevoegd in één datafile voor later gebruik. Verwijder vervolgens de objectglasplaat met het monster en bereid de montage van de kalibratiemonsters voor. Bevestig de kwartsglasplaat met de kalibratiemonsters op de translatietafel terug bij de computer.

Plaats het centrum van het eerste kalibratiemonster in het laserpad. Handhaaf de experimentele parameters en registreer een spectrum. Doe hetzelfde voor elk van de monsters met verschillende gadoliniumconcentraties.

Dit zijn voorbeelden van single-shot spectra die zijn opgenomen in verschillende regio's van nierweefsel. Het blauwe spectrum is opgenomen in de centrale regio van de nier. Het rode spectrum komt overeen met het niermembraan en het groene spectrum is voor het perifere gebied.

De geïnjecteerde, op gadolinium gebaseerde nanodeeltjes bestaan uit een polyslaan-matrix met gadoliniumionen die door doca-liganden op hun oppervlakken zijn gechelateerd. In het spectrale bereik van 286 nanometer tot 320 nanometer kunnen gadolinium, calcium, ijzer, silicium en aluminium worden gedetecteerd. Let op hoe de intensiteiten variëren in de verschillende regio's van het monster, wat wijst op een grote heterogeniteit van deze elementconcentraties in het weefsel. De mapping van gadolinium, silicium en ijzer in een plakje muisnier werd uitgevoerd met behulp van libs-gegevens met een resolutie van ongeveer 100 micrometers.

De schaalintensiteit wordt uitgedrukt in een arbitraire eenheid. Dit is een afbeelding in natuurlijk licht. Ter vergelijking: soortgelijke resultaten werden behaald met tumorstalen.

Net als bij deze kaart van gadolinium en SQ 20 B tumorweefsel, is er een valse kleurscala over de afbeelding met natuurlijk licht gelegd. Voor dit experiment werden nanodeeltjes direct in de tumor toegediend. Na één uur werd de tumor verwijderd en klaargemaakt voor analyse.

Let op dat ongeveer de helft van het tumorvolume sommige deeltjes op masters bevat. Deze techniek kan in minder dan een uur worden uitgevoerd voor monsters van één vierkante centimeter met een resolutie van 100 micrometer, mits deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van lips is het belangrijk om te onthouden dat metingen worden verricht op basis van laser-geïnduceerd plasma en dat het cruciaal is om alle parameters tijdens het gehele experiment te controleren volgens de procedure.

Andere methoden kunnen worden uitgevoerd, zoals immunohistochemie op aangrenzende coupes, om verdere vragen te beantwoorden, zoals het type cel dat betrokken is bij het proces van belang na diens ontwikkeling. Deze techniek baande de weg voor onderzoekers op het gebied van nanotechnologie toegepast op biologie en geneeskunde om de distributie van verbindingen die metallische elementen bevatten in biologisch weefsel te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de lips-technieken worden gebruikt om meerdere elementen in biologische weefsels in kaart te brengen.