Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics
27 mei 2014
Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.
Het algemene doel van deze procedure is om metabolisch profilering in gekweekte cellen te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst polaire metabolieten uit cellen te extraheren. De tweede stap is om de celextracten in water te reconstitueren en de monsters over te brengen naar LC-vijvers.
Vervolgens worden de monsters in het LC QE MS-instrument geïnjecteerd, dat is gekalibreerd en de ruwe gegevens worden in de laatste stap in de computer geregistreerd. Metabolietpieken worden uit de ruwe gegevens geëxtraheerd met behulp van commerciële software, en onbekende pieken worden doorzocht in een database met hoge resolutie massa. Hoewel deze master inzicht kan geven in relatieve metabolietniveaus in SARS, kan deze ook worden toegepast op andere systemen zoals serum of weefsels.
Bereid eerst 500 milliliters mobiele fase A voor, die 20 millimolair ammoniumacetaat is, en 15 millimolair ammoniumhydroxide in 3% acetonitril en water. Na het losjes afdichten van de fles, soniceer de oplossing in een waterbad sonicator gedurende 10 minuten zonder te verwarmen. Hierna lost u vijf milligram van zowel natriumfluoroacetaat als zuur op in vijf milliliter water om een uiteindelijke concentratie van één milligram per milliliter te maken.
Los vervolgens diazinon op in methanol om een uiteindelijke concentratie van 10 microgram per milliliter te maken. Om één milliliter negatief lage massa kalibratie-oplossing te bereiden, meng 960 microliters van thermo negatief kalibratie-oplossing met 20 microliters van de natriumfluoroacetaat en homovanillinzuur-oplossing. Om één milliliter positieve lage massa kalibratie-oplossing te maken, meng 990 microliters van thermo positieve kalibratie-oplossing en 10 microliters van de diazinon-oplossing.
Na het uitvoeren van een standaard massa kalibratie in positieve modus, pas de scanbereik aan tot 60 tot 900 massa-ladingsverhouding in het instrumentbedieningspaneel en pas een bron botsing geïnduceerde dissociatie van 25 elektronvolt toe. Voer aangepaste kalibratie-ionen in en start de aangepaste kalibratie op de afstemmingspagina zodra de ionenbron stabiel is. Schakel de polariteit naar negatieve modus nadat u een standaard massa kalibratie in negatieve modus hebt uitgevoerd, pas het scanbereik aan tot 60 tot 900 massa-ladingsverhouding in het instrumentbedieningspaneel en pas een bron botsing geïnduceerde dissociatie van 35 elektronvolt toe.
Voer aangepaste kalibratie-ionen in en start de aangepaste kalibratie zodra de ionenbron stabiel is. In de afstemmingspagina, rust de QE MS-instrument uit met de verwarmde elektrospray-ionisatie of HESI-sonde door deze op niveau C te bevestigen en vervolgens aan te sluiten op de stikstofgasinlaten, verdamperkabel en spanningskabels. In de computerafstemmingspagina, stel de relevante afstemmingsparameters voor de sonde in.
Stel de capillaire temperatuur in op 320 graden Celsius en de S-lens op 55. Bouw vervolgens in het methodeprogramma een volledige scanmethode op met behulp van de volgende waarden. Stel de chromatografiemethode in door de lineaire gradiëntinformatie in te voeren.
Gebruik een amid-kolom voor verbindingsscheiding bij kamertemperatuur. Bereid op dit moment een extractieoplossing voor door handmatig 40 milliliter methanol en 10 milliliter water in een 50 milliliter te mengen.Twee. Wanneer eerder gekweekte colonkanker H CT acht cellen 80% confluency bereiken.
Aspiseer snel het medium en plaats de zesputjesplaat op droog ijs. Voeg vervolgens onmiddellijk één milliliter extractieoplossing toe aan elk putje en breng de plaat over naar een vriezer van negatief 80 graden Celsius. Nadat u de plaat uit de vriezer hebt gehaald, plaats deze 15 minuten later op droog ijs en schraap de cellen in het oplosmiddel.
Breng de oplossing van elk putje over naar drie 1,7 milliliter einorbuizen en centrifugeer de monsters met een snelheid van 20.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Na centrifugatie brengt u de supernatant over naar twee nieuwe einorbuizen. Droog vervolgens de monsters in een snelvacuüm.
Zodra de monsters droog zijn, bewaar ze dan in de vriezer van negatief 80 graden Celsius. Nadat u de monsters uit de vriezer heeft gehaald voor analyse, laat ze dan op ijstemperatuur komen. Voeg vervolgens 20 microliters ijskoud water toe en vortex de monsters om metabolieten op te lossen.
Centrifugeer vervolgens de monsters bij 20.000 keer G bij vier graden Celsius. Draag de SUPERNAT over naar LC-vijvers en injecteer vijf microliters van de monsters in het LC QES-instrument voor analyse. Zodra de kalibratie correct is uitgevoerd op het QE MS-instrument, brengt u de LC-kolom vijf minuten in evenwicht met 85% van mobiele fase B bij een stroomsnelheid van 0,15 milliliter per minuut.
Stel vervolgens de monstersequens in willekeurige volgorde in om de schommelingen die door de LCMS zijn geïntroduceerd over elke monster te verdelen en een nauwkeurigere vergelijking tussen verschillende monsters te garanderen. Voeg na elke zes monsters een spoelrun toe, gevolgd door een blanco monster om de systeem achtergrond en carry-over niveaus te beoordelen. Bewaar de sequentie en start de sequentie uitvoering.
Zodra de LC-kolom stabiele druk vertoont dicht bij 400 PSI, controleert u na de eerste twee monsters van de sequentie de pieken in deze chromatogrammen op onbekende metabolieten om ervoor te zorgen dat de monstersequens soepel verloopt. Nadat alle monsters in de sequentie zijn voltooid, voert u gegevensanalyse uit op een aparte computer. Kies de methode van piekalignering en frame-extractie voor kleine moleculen op commercieel verkrijgbare software.
Laad vervolgens de LC MS-ruwe gegevens en groepeer ze op basis van monstersoorten. Kies monsters in het midden van de uitvoeringssequentie als chromatografiereferentiemonster voor piekalignering en kies een groep als de verhoudingsgroep of de volledige veranderingsberekening. Upload vervolgens een frame-zaad, inclusief bekende metabolieten voor de doelgerichte metabolietenanalyse met verzamelde gegevens en het bijbehorende frame-zaad.
Kies vervolgens volledige spectrascan in positieve of negatieve modus en sla dit gegevensverwerkingsbestand op in dezelfde map als de ruwe ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor metabolietprofilering in gekweekte cellen, gericht op de extractie en analyse van polaire metabolieten. De methode gebruikt vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoogwaardige massaspectrometrie om hoge gevoeligheid en nauwkeurigheid te bereiken.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Metabolomics
- Celbiologie
- Analytische Chemie
Achtergrond
- Metabolietprofilering is cruciaal voor het begrijpen van metabolisme in verschillende biologische contexten.
- Hoogwaardige massaspectrometrie maakt gedetailleerde analyse van metabolische samenstellingen mogelijk.
- Polaire metabolieten spelen een belangrijke rol in cellulaire functies en ziektemechanismen.
- Dit protocol kan worden aangepast voor verschillende biologische materialen, inclusief serum en weefsels.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het extraheren en analyseren van polaire metabolieten uit gekweekte cellen.
- Om inzichten te bieden in relatieve metabolietniveaus in verschillende biologische systemen.
- Om het begrip van metabolische veranderingen in gezondheid en ziekte te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Extractie van polaire metabolieten uit gekweekte cellen.
- Reconstitutie van extracten in water voor analyse.
- Injectie van monsters in een gekalibreerd vloeistofchromatografie massaspectrometrie (LC-MS) systeem.
- Gegevensanalyse met behulp van commerciële software om metabolieten te identificeren en te kwantificeren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en analyse van polaire metabolieten uit gekweekte cellen.
- Identificatie van metabolietpieken die overeenkomen met bekende verbindingen.
- Toepassing van de methode op andere biologische systemen toonde veelzijdigheid.
- Inzichten verkregen in metabolische profielen relevant voor gezondheid en ziekte.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuust raamwerk voor metabolietprofilering in onderzoek.
- Hoogwaardige massaspectrometrie is effectief voor gedetailleerde metabolische analyse.
- Deze methode kan verdere studies naar metabolische veranderingen in verschillende contexten faciliteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables sensitive, large-scale quantitative metabolomics for polar metabolites without derivatization, addressing key limitations in current platforms such as low detection limits and slow scan speeds. By coupling amide-based hydrophilic chromatography with Q-Exactive MS capable of positive/negative ion switching, it supports robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features. The method enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking by providing reproducible, quantitative metabolic profiles from cultured cells, with direct applicability to serum and tissue samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through comprehensive polar metabolite profiling in disease-relevant cellular systems.
- Operational Value: Supports biological de-risking by quantifying pathway-specific metabolites (e.g., glycolysis, TCA cycle, nucleotide synthesis) to validate target engagement.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking metabolic perturbations to mechanism of action and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline metabolic states and detecting off-target effects.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through rigorous mass calibration (<5 ppm error) and CV-based filtering (20% cutoff) for reliable metabolite quantification.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via automated sample sequencing with wash/run blanks to minimize carryover and ensure cross-run comparability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports seamless transition from discovery to preclinical validation by enabling consistent metabolite profiling across cultured cells, serum, and tissues.
- Biomarker Alignment: Detects endogenous metabolites (e.g., glutathione, proline, methyl glyoxal) that serve as translational biomarkers for pathway activity and drug response.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative metabolic readouts to inform go/no-go decisions based on on-target pathway modulation and absence of toxic signatures.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early biology through lead identification to preclinical studies, enabling metabolic phenotyping at each stage to de-risk targets and mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying changes in central carbon metabolism and redox metabolites upon perturbation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs (peak areas) for compound library screening and SAR analysis.
- Analytics: Generates high-resolution, accurate mass data (<5 ppm error) enabling confident metabolite identification and quantification across positive and negative ionization modes.
- Translational Research: Ensures continuity by applying the same extraction and detection protocol to serum and tissue samples, preserving metabolic fidelity.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable metabolomics platform reusable across projects and therapeutic areas with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through comprehensive polar metabolite coverage.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability via automated LC-MS workflows and software-based peak alignment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage attrition by identifying off-target metabolic effects early.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization through quantitative metabolic signatures linked to mechanism and safety.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metabolomics sample preparation, LC-MS operation, and data analysis using commercial software for peak extraction and database matching.
- Dependence on high-resolution MS (Q-Exactive or equivalent) with HESI source, nitrogen gas supply, and temperature-controlled centrifugation and vacuum drying equipment.
- Necessitates cross-team standardization of extraction solvents, cell harvesting timing (80% confluence), and cold methanol quenching to ensure reproducibility.
- Adaptation across model systems requires validation of metabolite recovery and matrix effects, particularly for serum and tissue lysates.
- Practical limitations include ion suppression at high cell densities (>1×10⁷ cells) and the need for manual peak inspection to filter noise-level components in untargeted analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Preparation of LC-MS Reagents and Establishment of a Chromatography Method and Instrument Operating Proedures
6:11
Setup of the Sample Sequence
4:17
Preparation of Metabolite Samples
7:07
Analysis of LC-MS Data
13:47
Conclusion
9:51
Results: Evaluation of Instrument Accuracy, Sensitivity, and Untargeted Metabolomics Based on Current LC-QE-MS Platform
