Juxtasomal biocytine Labeling om de structuur-functie relatie van de individuele corticale neuronen Studie
25 februari 2014
De structuur van neuronale netwerken begrijpen, functionele en morfologische karakterisering van individuele neuronen is een noodzaak. Hier tonen we juxtasomal biocytine etikettering, die elektrofysiologische opnames maakt in de extracellulaire configuratie, maar met behoud van de mogelijkheid om intracellulair het etiket van de neuron voor post hoc reconstructie van dendritische en axonale architectuur.
Het algemene doel van deze procedure is om celtype-specifieke actiepotentiaal-spiking in de sensorische cortex tijdens informatieverwerking te koppelen aan de morfologische identiteit van de geregistreerde neuronen. Dit wordt bereikt door de rat eerst chirurgisch voor te bereiden op juxtasomale registraties. Eenmaal voorbereid registreert een elektrode spontane en sensorisch opgewekte spiking-activiteit, waarna het geregistreerde neuron via stroom en injecties wordt geladen met biocidin.
Vervolgens wordt het brein verwerkt voor biotin-kleuring. Tot slot wordt het met biotin gevulde neuron digitaal gereconstrueerd op basis van opeenvolgende secties voor de classificatie van het celtype. Uiteindelijk maken juxtasomatische opnames van individuele neuronen het mogelijk om de sensorische verwerking en structurele informatie binnen het corticale netwerk te bestuderen.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de neurowetenschappen, zoals wat de rol is van individuele celtypen en lagen tijdens de sensorische verwerking. Over het algemeen hebben personen die deze methode nodig hebben moeite ermee, omdat het zeer eenvoudig is om neuronen te doden tijdens de vullingsprocedure. De kans op een succesvolle vulling met biocidin wordt vergroot door pipetten van optimale kwaliteit voor te bereiden; daarnaast is een getraind oog nodig om de nauwe bandstroominjecties te controleren.
Daarom is ervaring vereist om het succespercentage van het terugwinnen van goed gevulde neuronen te verhogen. Plaats voor aanvang een geanestheseerde Wistar-rat op een stereotaxisch frame dat is uitgerust met een warmtemat. Bevestig de diepte van de sedatie door de teenknijpreflex te testen.
Voer vervolgens een rectale sonde in om de juiste lichaamstemperatuur te handhaven. Fixeer de kop van het dier en verwijder het haar op de operatielocatie. Breng zalf aan in de ogen om uitdroging te voorkomen.
Wacht drie tot vijf minuten na het injecteren van lidocaïne op de operatieplaats en verwijder de huid die het oppervlak van de schedel bedekt. Verwijder vervolgens alle resterende weefsels en reinig de schedel grondig met 0,9% natriumchloride. Bepaal de coördinaten voor de primaire somatosensorische cortex op het linkerhemisfeer en markeer de locatie op de schedel met een chirurgische huidmarker.
Gebruik een tandartsboor om het bot uit het interessegebied weg te schrapen. Ga door met het schrapen van het bot tot het transparant wordt en de bloedvaten duidelijk zichtbaar zijn. Snijd vervolgens met een scalpel een klein venster in de dunne schedel.
Zorg ervoor dat de dura mater en de bloedvaten niet worden beschadigd. Markeer de randen van de craniotomie met een chirurgische huidmarker. Om de zichtbaarheid te verbeteren, brengt u een dunne laag secondelijm aan op de droge schedel, gevolgd door tandheelkundig cement om een bad te construeren.
Trim bij het sluiten van de craniotomie de snorharen aan de contralaterale zijde tot precies vijf millimeter om de zichtbaarheid te vergroten. Markeer de getrimde snorharen met zwarte mascara voordat u begint met de opnames; maak patchpipetten van borosilicaatglas. De ideale pipetmorfologie is een geleidelijke slanke taps toelopende vorm, een kleine conushoek en een binnendiameter van de tip van ongeveer één micron.
Vul de patchpipet met normale rad ringer, aangevuld met 2%biotine, en monteer de patchpipet op een pipethouder die is bevestigd aan een head stage en is verbonden met een micromanipulator. Om specifiek de D2-kolom van de rat S1 te targeten, stelt u de hoek van de電rodehouder in op 34 graden ten opzichte van het sagittale vlak. Positioneer vervolgens de patchpipet in de directe nabijheid van de craniotomie.
Vul het bad met 0,9% natriumchloride. Stel de versterker in op brugmodus en pas vierkantpulsen met positieve stroominjectie toe om de elektrodeweerstand te bepalen. De optimale elektrodeweerstand ligt tussen drie en vijf megaohm.
Stel een overdruk van 100 tot 150 millibar in en beweeg de patchpipet in stappen van één micron vooruit, terwijl een positieve stroom in de vorm van vierkantgolven wordt aangelegd. Bewaak de robuuste verandering in weerstand zodra contact met de dura mater is gemaakt. Stel op dit punt de coördinaten van de micromanipulator in op nul om nauwkeurige dieptemetingen mogelijk te maken.
Ga verder in stappen van één micron totdat de patchpipet de dura mater penetreert, wat wordt aangegeven door een plotselinge daling van de elektrodeweerstand. Verwijder de houdtruk van de pipet. Zoek vervolgens naar individuele units terwijl u verdergaat in stappen van één micron.
Monitor de elektrodeweerstand continu door aan/uit-pulsen van 200 milliseconden toe te passen; een toename in de elektrodeweerstand duidt doorgaans op de nabijheid van een enkel neuron. Beweeg de elektrode verder totdat positieve actiepotentiaal-golfvormen van ongeveer twee millivolt worden geregistreerd. Registreer optioneel de spontane spiking-activiteit en bepaal de door snorharen opgewekte spiking-activiteit door individuele snorharen gecontroleerd af te buigen met een piëzo-elektrisch apparaat om optimale omstandigheden voor juxtasomatische vulling te verkrijgen.
Schuif de elektrode verder tot de weerstand 25 tot 35 MΩ is en de spikes amplitudes van drie tot acht mV hebben om de juxtasomatische vulling te starten. Dien positieve vierkante stroompulsen toe, beginnend bij 1 nA.
Verhoog de stroom langzaam en geleidelijk in stappen van 0.1 nano amps, terwijl de AP-golfvorm en -frequentie worden gemonitord. Monitor de opening van het membraan als een duidelijke toename van de AP-frequentie tijdens de aan-fase van de blokkeringspuls; de spike-golfvorm tijdens het vullen vertoont een toegenomen breedte en een verminderde nagespannen hyperpolarisatie. Verhoog of verlaag de stroom tijdens het vullen om een stabiele biotine-infusie te handhaven; verminder of stop de stroompulsen bij een plotselinge toename van de AP-frequentie. Dit is om toxiciteit door een overmatige instroom van extracellulaire ionen, zoals natriumionen, te voorkomen.
Het is belangrijk op te merken dat elk neuron anders zal reageren op de vullingsprocedure. Daarom moeten de parameters voor de juxtasomatische labeling worden aangepast afhankelijk van de registratieconditie. Monitor het signaal nauwgezet nadat de stroominjectie is gestopt.
De spike-golfvorm na een vulsessie is gewoonlijk verbreed en vertoont een sterk verminderde nagesuperhyperpolarisatie; wacht tot het neuron is hersteld, wat duidelijk wordt wanneer de spike-golfvorm terugkeert naar zijn oorspronkelijke eigenschappen om mechanische stress voor de cel te verminderen. Trek de patchpipet stapsgewijs met één micron terug tot de spike-amplitude afneemt; wacht ten minste één uur zodat de biotine intracellulair kan diffunderen, terwijl de lichaamstemperatuur en ademhaling van het dier nauwlettend worden gemonitord. Ten slotte worden hersenmonsters verkregen en verwerkt om de kwaliteit van de juxtasomale labeling vast te stellen.
Deze afbeeldingen tonen juxtasomatisch gevulde neuronen in de primaire somatosensorische cortex. Dit tangentiaalse beeld van een pariëtaal neuron demonstreert het verschil in grootte tussen dendrieten en axonen. In deze digitale reconstructie van een juxtasomatisch gelabeld neuron wordt het projectiebeeld van het neuron getoond bij een hoge resolutie, maar lage vergroting, met een geautomatiseerde digitale reconstructie waarbij het axon in het blauw en de dendriet in het rood zijn weergegeven.
Hier is het kadergebied vergroot om de axonboutons over de gehele lengte van het axon te tonen. In deze laatste animatie illustreren we de reconstructiepijplijn voor één dikke, getuftte parametale neuron uit laag vijf van de primaire somatosensorische cortex van de rat. De pijplijn omvat de reconstructie van de dendritische en axonale morfologie bij een vergroting van 100 keer en de contouren van de barrels bij een vergroting van 4 keer.
Het resultaat is een volledige 3D-reconstructie, die vervolgens wordt geregistreerd aan een gestandaardiseerd referentiekader om kwantitatieve analyse van morfologische kenmerken uit te voeren. Zo maakt juxtasomale labeling in vivo een uitzonderlijke labelingskwaliteit mogelijk voor een betrouwbare reconstructie van de volledige 3D-morfologie. Hier hebben we de methode gedemonstreerd in met urethaan geanestheseerde dieren.
Jux Somal-opnames kunnen echter ook worden gebruikt bij wakker, met het hoofd gefixeerde dieren om de rol van individuele celtypen en lagen te bestuderen tijdens actieve exploratie van de omgeving. Na het bekijken van deze video zou u een beter inzicht moeten hebben in hoe Biocidin-labeling op individuele neuronen moet worden uitgevoerd voor identificatie na het experiment en morfologische reconstructie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op het koppelen van actiepotentiaalspikingen in de sensorische cortex aan de morfologische identiteit van neuronen. Door gebruik te maken van juxtasomale biocytine-labeling kunnen onderzoekers neuronale activiteit registreren en tegelijkertijd de neuronen labelen voor een gedetailleerde structurele analyse.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Elektrofysiologie
- Neuronale morfologie
Achtergrond
- Het begrijpen van neuronale netwerken vereist zowel functionele als morfologische karakterisering.
- Juxtasomale registraties maken de studie van de activiteit van individuele neuronen mogelijk.
- Biocytine-labeling maakt post hoc reconstructie van neuronale structuren mogelijk.
- Deze aanpak helpt bij het classificeren van celtypen op basis van hun morfologie en activiteit.
Doel van de studie
- Om sensorische verwerking te koppelen aan de structurele identiteit van neuronen.
- Om het begrip van corticale netwerken te vergroten door middel van individuele neuronanalyse.
- Om biocytine-labeling te benutten voor gedetailleerde morfologische studies.
Gebruikte methoden
- Chirurgische voorbereiding van ratten voor juxtasomale opnames.
- Elektrofysiologische opnames van spontane en sensorisch-evoqueerde spiking-activiteit.
- Biocytine-belading van opgenomen neuronen via stroominjecties.
- Verwerking van hersenweefsel voor biotinering en digitale reconstructie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle registratie van actiepotentialen gekoppeld aan morfologische gegevens.
- Gedetailleerde reconstructie van de neuronale architectuur op basis van biocytine-labeling.
- Inzichten in sensorische verwerkingsmechanismen binnen corticale netwerken.
- Classificatie van neuronen op basis van hun structurele en functionele eigenschappen.
Conclusies
- Juxtasomale opnames bieden een krachtige methode voor het bestuderen van individuele neuronen.
- Het koppelen van morfologie en functie vergroot het begrip van de neuronale rollen bij sensorische verwerking.
- Deze benadering kan worden toegepast om neuronale netwerken in verschillende contexten verder te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Het koppelen van neuronale activiteit aan structurele identiteit maakt mechanische risicoreductie bij targetvalidatie mogelijk door celtype-specifieke rollen in sensorische verwerkingscircuits te verduidelijken. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door kwantitatieve morfologische en functionele gegevens te leveren voor hypothesetests. Het pakt een cruciale uitdaging in de ontdekkingsfase aan: het ontrafelen van hoe individuele neuronale subtypen bijdragen aan informatieverwerking op netwerkniveau in ziektespecifieke systemen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door actiepotentiaal-spikingpatronen te koppelen aan neuronale morfologie tijdens sensorische verwerking.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door post hoc identificatie van geregistreerde neuronen voor celtypeclassificatie.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portefeuilletriage door structuur-functierelaties in corticale microcircuits te verduidelijken die relevant zijn voor neuropsychiatrische targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op standaardisatie van downstream assays door baseline morfologische en elektrofysiologische profielen vast te stellen.
- Operationele waarde: Verbetert de screeninggereedheid door reproduceerbare juxtasomale registratiecondities over verschillende gedragstoestanden heen.
- Herbruikbaarheid van het platform: Faciliteert schaalbare toepassing in wakkere, met het hoofd gefixeerde en vrij bewegende modellen voor longitudinale studies naar target-engagement.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt ziekterelateerde systeemcontinuïteit door reverse engineering van corticale netwerken mogelijk te maken, van functionele naar structurele gegevens.
- Operationele waarde: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere voortgang via kwantitatieve 3D morfologische reconstructie en gestandaardiseerde registratie van het referentiekader.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Versterkt de afstemming van translationele biomarkers door elektrofysiologische output te correleren met de anatomische architectuur in de sensorische cortex.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothese-testen van targets tot lead-identificatie, door mechanistische risicoreductie van neuronale targets in sensorische verwerkingspaden mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door sensorisch-evوkeerde spiking te correleren met dendritische en axonale morfologie.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via stabiele juxtasomale configuraties en kwantitatieve analyse van de spike-golfvorm tijdens vullingsprocedures.
- Analytica: Genereert meetbare resultaten, waaronder actiepotentiaalamplitude, frequentie en breedte voor comparatieve analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit via post hoc reconstructie, wat kwantitatieve analyse van de neuronale architectuur in gestandaardiseerde referentiekaders mogelijk maakt.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Functioneert als een herbruikbare capaciteit voor iteratieve targetvalidatie onder anesthetische, gesedeerde, wakkere en vrij bewegende condities.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid door mechanische risicoreductie van structuur-functierelaties in corticale neuronen.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via gecontroleerde parameters voor stroominjectie en protocollen voor pipetvoorbereiding.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het verminderen van biologische risico's in een laat stadium bij de ontwikkeling van neuropsychiatrische targets.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering door geïntegreerde functionele en morfologische datasets voor targetvalidatie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in elektrofysiologie, microchirurgie en morfologische reconstructie om smalbandige stroominjecties te beheren en neuronale toxiciteit te voorkomen.
- Afhankelijk van hoogwaardige patchpipetten met tipdiameters in het sub-micronbereik en stabiele badcondities voor juxtasomale afsluiting.
- Vereist standaardisatie tussen de elektrofysiologie- en histologieteams voor consistente biocytine-diffusie en kleuringsprotocollen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van vulparameters op basis van de variabiliteit in neuronale respons over verschillende registratiecondities en gedragsstaten.
- Praktische beperkingen omvatten risico's op mechanische stress tijdens het terugtrekken van de pipet en de noodzaak van herstelperioden na het vullen om de kwaliteit van de labeling te waarborgen.
