Name: Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Leer hoe u GABA_A-receptor oppervlaktelokalisatie en endocytose meet in hippocampale neuronen met behulp van fluorescent gelabelde α-bungarotoxin. Deze methode ondersteunt onderzoek naar synaptische functie en plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ondersteuning werd verleend door startup-fondsen van de biologie afdeling Farmacologie en Chemical aan de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. Erkenning van Jacob lab-leden die naar de homevideo bijgedragen: Nicholas Graff.

Alle protocollen die hieronder worden beschreven zijn in overeenstemming met de IACUC en IRB institutionele review boards van de Universiteit van Pittsburgh School of Medicine. 1. Voorbereiding van de hippocampus neuronale kweken in weefselkweek kap Opmerking: Gebruik steriele techniek en reagentia hele protocol 1. <ol><li> Bereid poly-D-lysine (0,1 mg / ml in H2O) gecoate dekglaasjes als substraat voor de neuronale kweek. <ol><li> Plaats 4-5 ronde dekglaasjes in elk 3,5 cm weefselkweek schotel. </li><li> Spot 70 ul poly-D-lysine op elke 12 mm dekglaasje. Opmerking: voor live-imaging, een glazen bodem 3,5-cm weefselkweek schotel kan worden gebruikt (ter plaatse 200 ul poly-D-lysine op ingebedde 14 mm glas dekglaasje). </li><li> Laat de bereide gerechten in de weefselkweek kap O / N. Poly-D-lysine verdamping te minimaliseren en oppervlakken steriel in de weefselkweek kap, sluiten de schuifraam en zet ee blower O / N. Opmerking: UV lampen worden niet gebruikt tijdens de O / N incubatie. </li><li> De volgende ochtend, de afwas 3x met 2 ml H 2 O. </li><li> Na het verwijderen van de laatste H 2 O wassen, voeg 2 ml van media om elke 3,5 cm schotel en laat gerechten incubator totdat klaar om de neuronen plaat in stap 1.4. </li></ol></li><li> Hippocampale neuronen worden bereid uit embryonale dag 18-19 (E18-19) ratten (gemodificeerd van Goslin 22). </li><li> Transfecteren net losgemaakte neuronen op de dag van het kweken met 1-4 ug maxiprepped construct DNA. Opmerking: typisch 3 ug DNA getransfecteerd in 1-2.000.000 neuronen, met een levensvatbaarheid van 50% en een transfectie-efficiëntie van 60% (bijv. ab 2 miljoen neuronen: ((2 x 10 6 neuronen x 0,5) 0,6) bepaalt ca. 1.000.000 neuronen;.. 600.000 daarvan zijn getransfecteerd 1 Verschillende hoeveelheden construct DNA getransfecteerd kunnen worden bij het ​​oplossen van mogelijke problemen vanoverexpressie, gevolgd door passende karakterisering van construct lokalisatie en functie. </li><li> Plate de getransfecteerde neuronen op de poly-D-lysine-gecoate dekglaasjes bij een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 200.000 neuronen per 3,5 cm schotel. Opmerking: voor een glazen bodem schaal, bord 40.000-50.000 neuronen op de 14 mm glasoppervlak. </li><li> Vervang de media 4-24 uur na bereiding van neuronale culturen, laat dan neuronen te ontwikkelen in de couveuse tot 14-17 dagen in vitro (DIV) of gewenst stadium. </li></ol> 2. Endocytose Assay LET OP: Let op α-bungarotoxin en afval en behandeling tubocurarine: <ol><li> Afhandeling van alle peptide neurotoxins wordt aanbevolen in de richtlijnen van Biosafety Level-2 (BL-2) onderzoeksprotocollen. Alle juiste persoonlijke beschermende kleding gedragen worden. Gevriesdroogd toxine poeders moet bereid worden volgens de instructies van de fabrikant. Toxine afval Should worden afgevoerd in overeenstemming met de Environmental Health and Safety richtlijnen van de betreffende instelling. </li><li> Om potentiële peptide aggregaten die tijdens de opslag kunnen gevormd hebben, α-bungarotoxine monsters worden kort vóór gebruik gecentrifugeerd en het supernatant worden gebruikt voor het experiment. </li><li> α-bungarotoxine (SW) voorraden worden opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van 1 mg / ml in steriel H2O en opgeslagen in 10 pi aliquots bij -20 ° C. Fluorescent gekoppeld Bgt voorraden worden gebruikt op 3 pg / ml. Tubocurarine wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 150 uM. </li></ol><ol><li> Stel bench top kachel blok naar 16 ° C in een koude kamer met dunne aluminium of roestvrij stalen plaat bovenop. Alternatief, indien beschikbaar, een tafelmodel koel / verwarmingsinrichting kan worden gebruikt voor elke stap vereist 16 ° C. </li><li> Cool extracellulaire Hepes-gebufferde zoutoplossing (HBS bevat in mM: 135 NaCl, 4,7 KCl, 10 HEPES, 11 glucose, 1,2 MgCl2 en 2,5CaCl2, pH 7,4) tot 16 ° C in een waterbad. </li><li> Transfer neuron gerechten om aluminium plaat bij 16 ° C en koel gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder media (houden geconditioneerde media en reserve in incubator voor stap 2.8, endocytose assay tijdstippen) en te vervangen door 1 ml van 16 ° C HBS + tubocurarine (150 uM) gedurende 2 minuten. </li><li> Verwijder HBS + tubocurarine gelabelde afvalbak en vervangen door 1 ml 16 ° C HBS + tubocurarine (150 pM) + α-bungarotoxine Alexa 594 [3 ug / ml], incuberen bij 16 ° C gedurende 15 minuten. </li><li> Verwijder HBS + tubocurarine + α-bungarotoxin Alexa 594 tot afvalcontainer geëtiketteerd en afwassen 3x met 2 ml van 16 ° C HBS (de wasbeurten kan via aspiratie worden opgevangen in een vacuüm kolf met 50 ml van 50% bleekwater). </li><li> Voor live-imaging tijdreeksen experimenten volgende receptor endocytose met behulp van een glazen bodem 3,5 cm cultuur schotel, stappen 2,1-2,6 uitvoeren, dan schotel transfer naar verwarmde podium(Peltier-apparaat) op de microscoop, en beginnen beeldvorming met een confocale of TIRF microscoop setup. </li><li> Transfer T = 0 tijdstip dekglaasjes in een schaal van RT 4% paraformaldehyde / 4% sucrose gedurende 20 minuten, verder te gaan met andere dekglaasjes naar stap 2.9. </li><li> Voor andere tijdstippen, vervang HBS met airconditioning in evenwicht 37 ° C media (gereserveerd in stap 2.4) en terug te keren naar incubator voor endocytose bij 37 ° C. Opmerking: gesuggereerd extra tijd punten van T = 15, 30, en 60. </li><li> Op tijdstippen nodig, neem gerechten uit incubator was snel tweemaal met 2 ml DPBS RT (DPBS zonder calcium, magnesium) bevestig in 4% paraformaldehyde / 4% sucrose gedurende 20 minuten. </li><li> Na 20 min fixatie, verwijderen 4% paraformaldehyde / 4% sucrose afvalverpakking afwassen tweemaal met 2 ml RT DPBS. </li><li> Incubeer dekglaasjes bij KT gedurende 10 min in immunofluorescentie blokkeeroplossing (blokkeeroplossing = 5% paardenserum, 0,5% BSA in DPBS) bevattende 0,2% Triton X-100 aan doorlaatbaarheidize de neuronen en staat anti-GFP immunokleuring van intracellulaire receptor zwembad en / of de etikettering van andere eiwitten van belang. </li><li> Verwijder blok + 0,2% Triton X-100 en incubeer dekglaasjes in immunofluorescentie blok oplossing zonder Triton X-100 gedurende 20-30 minuten. </li><li> Voer primaire antilichaam incubaties van dekglaasjes in blok enkele uren bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Opmerking: incubatie van dekglaasjes met primaire bij 4 ° CO / N routinematig levert betere resultaten immunofluorescentie. </li><li> Wassen coverslips 3x met DPBS (5 min voor elke wasstap). </li><li> Incubeer dekglaasjes met secundaire antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Wassen coverslips 3x met DPBS (5 min voor elke wasstap). </li><li> Mount dekglaasjes, hanteren elk dekglaasje individueel: verwijder de overtollige vloeistof uit de achterkant van dekglaasje met lab weefsel, keer dan dekglaasje op 4 pl montage medium op een glasplaatje. </li><li> Toestaan ​​dia drogen bij kamertemperatuur afgedekt gedurende 30 minuten dan sterts bij 4 ° C tot klaar voor microscopie. </li><li> Afbeelding acquisitie en analyse van het experiment met confocale microscopie (blind voor experimentele conditie). 60X olie NA 1.49 immersie objectief met de volgende lasers: Argon gas 488 nm, 561 diode, 640 diode. <ol><li> Met dezelfde beeldaanwinst instellingen, verwerven enkele beelden Z gedeelte met de neuronale cel lichaam en verscheidene dendritische processen focus. </li><li> Kwantificeren α-bungarotoxine Alexa fluorescentiesignaal en GFP immunokleuring langs 20 urn 3-4 proximale dendrieten per neuron, met dezelfde drempel voor analyse van endocytose gegevens. </li><li> Analyseer gegevens 10-12 neuronen voor elk tijdstip, het experiment te herhalen met verschillende onafhankelijke neuronale culturen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li>
<li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li>
<li>Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mobility+of+functional+GABA%28A%29+receptors+at+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses.</a> Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Cell+Surface+GABAB+Receptors+Using+an+%CE%B1-Bungarotoxin+Tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-like+protein+Plic-1+enhances+the+membrane+insertion+of+GABAA+receptors+by+increasing+their+stability+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum.</a> J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Tuning+of+Inhibitory+Neurotransmission+Based+on+GABAAR+Diffusion+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics.</a> Neuron. 62, 670-682 (2009).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+regulate+GABAA+receptor+lateral+mobility+and+clustering+at+inhibitory+synapses+through+serine+327+on+the+gamma2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).</li>
<li>Katchalski-Katzir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+peptides+that+bind+alpha-bungarotoxin+with+high+affinity+and+mimic+the+three-dimensional+structure+of+the+binding-site+of+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor.</a> Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).</li>
<li>Scherf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta+-hairpin+structure+in+a+13-mer+peptide+that+binds+alpha+-bungarotoxin+with+high+affinity+and+neutralizes+its+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cell+surface+GABAB+receptors+using+an+alpha-bungarotoxin+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+treatment+induces+subtype-specific+changes+in+GABAA+receptor+trafficking+and+decreases+synaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).</li>
<li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkage+and+visualization+of+acetylcholine+receptors+on+myotubes+with+biotinylated+alpha-bungarotoxin+and+fluorescent+avidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).</li>
<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAB+receptor+internalisation+is+regulated+by+the+R2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
<li>Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+phosphorylation+of+GABAA+receptors+regulates+receptor+insertion+and+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current.</a> EMBO. 31, 2937-2951 (2012).</li>
<li>Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+G-Protein+Coupling+in+an+mGluR6+Point+Mutant+Associated+with+Congenital+Stationary+Night+Blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness.</a> Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).</li>
<li>Terunuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+activation+of+NMDA+receptors+promotes+dephosphorylation+and+alters+postendocytic+sorting+of+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).</li>
<li>Goslin, K. G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Nerve+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Culturing Nerve Cells.</a> , 2nd ed, MIT Press. (1998).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De BBS gebaseerde vaste en levende technieken die hier beschreven kan worden gebruikt om receptor of andere plasmamembraaneiwit handel in cellijnen, neuronen en andere primaire cellen te volgen. Deze werkwijze is met succes gebruikt voor membraan insertie en verwijdering van ligand-gated ionkanalen en GPCR bestuderen en veranderingen in de handel deze door de aanwezigheid van receptor agonisten en modulatoren. Belangrijke aspecten bevatten passende lokalisatie van het label om een ​​extracellulaire locatie en het uitvoe...

Het gebruik van fluorescent gekoppelde α-bungarotoxine receptor lokalisatie en dynamica studie is ontwikkeld in studies van de nicotine acetylcholine receptor 13-15, het toxine endogene doelwit. Vervolgens heeft incorporatie van de minimale Bgt bindend peptide (BBS) is gebruikt om de handel van zowel prikkelende en remmende ligand-gated ionkanalen en G-eiwit gekoppelde receptoren 2,10,16-21 bestuderen. Dit BBS-gebaseerde techniek biedt voordelen voor andere benaderingen gebruikt voor mensenhandel studies zoals oppervlakte biotinylatie methoden, antilichaam etikettering van levende cellen met antilichamen tegen extracellulaire epitopen, en fluorescentie herstel na fotobleken (FRAP). Tijdens celoppervlak biotinylatie vrije amines covalent gemodificeerd, met de potentie om cellulaire activiteit beïnvloeden. Antilichamen gebaseerde studies vaak gehinderd door oppervlakte-antigeen clustering of aftopping, die handel gebeurtenissen kan veranderen. Door het bleken stap FRAP studies, een belangrijke zorg is beschadiging van de onderliggende cellulaire structuur. Een bijkomend voordeel is dat BBS gemerkte constructen kunnen ook worden gebruikt voor biochemische methodologieën met biotine gekoppeld bungarotoxin om te beoordelen receptor handel. Deze techniek is direct voor cellijnen en primaire cellen. Voor gebruik in cellen die nicotine acetylcholine (nAChR) receptoren, moet de nAChR antagonist tubocurarine het hele protocol gebruikt worden zoals aangegeven. Het uitvoeren van een eenvoudige oppervlak Bgt labeling (gelijk aan T = 0 tijdstip voor de endocytose Protocol) op getransfecteerde cellen in de afwezigheid van tubocurarine zal bewijzen endogene nAChR verschaffen. Een belangrijke overweging voor deze techniek is geschikt inbrengen van de BBS zodat was aanwezig op een extracellulaire locatie wanneer het eiwit van interesse wordt aan de plasmamembraan. Bijvoorbeeld, de N-eindstandige domeinen van GABAAR subeenheden in de vesiculaire lumen bevinden tijdens TRAFficking en word extracellulaire receptor na inbrengen in de plasmamembraan, waardoor specifieke etikettering van celoppervlak receptoren en beoordeling van hun verwijdering uit het celoppervlak door endocytisch evenementen. We hebben eerder aangetoond dat de toevoeging van GFP, myc of BBS epitopen dit domein GABAAR subeenheden functioneel stil. Standaard controles moeten worden uitgevoerd zodat de gecodeerde eiwit tot expressie op niveaus vergelijkbaar met een niet-gecodeerd construct, dat het een goed gelokaliseerd en dat het geen invloed receptorfunctie. Deze karakterisering van getransfecteerde constructen zal ook helpen bij het oplossen van problemen overexpressie zorgen.

<table><tbody><tr><td>P3 Primary Cell 4D kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>B35450</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Molecular Probes</td><td>B13423</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Tubocurarine chloride</td><td>Tocris</td><td>2820</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium&nbsp;</td><td>DAKO</td><td>cS703</td><td></td></tr><tr><td>DPBS zonder calcium, magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Gephyrin antilichaam</td><td>Synaptic Systems</td><td>147 011</td><td>1:300</td></tr><tr><td>VIAAT/VGAT antilichaam</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 002</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>anti GFP</td><td>Life Technologies</td><td>A6455</td><td>1:2.000</td></tr><tr><td>Glasbodem weefselkweekschaal</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C - Mattek Dishes</td><td></td></tr><tr><td>Dekvlakken (ronde dekglas), #1 dikte, 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>640-0702</td><td></td></tr></tbody></table>

met behulp van een α-bungarotoxin binding site tag om te studeren gaba a receptor membraanlokalisatie en handel

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Het wordt steeds duidelijker dat de neurotransmitter receptoren, waaronder ionotrope GABA A-receptoren (GABAAR), vertonen zeer dynamische handel en celoppervlak mobiliteit 1-7. Om receptoroppervlak cel lokalisatie en endocytose bestuderen, de hier beschreven techniek combineert het gebruik van TL-α-bungarotoxin met cellen die constructen die een α-bungarotoxin (SW) bindingsplaats (BBS). De BBS (WRYYESSLEPYPD) is gebaseerd op de α-subeenheid van de spier nicotine acetylcholine receptor, die Bgt bindt met hoge affiniteit 8,9. Opneming van het BBS site kan oppervlak lokalisatie en metingen van receptor inbrengen of verwijderen onder toepassing van exogeen fluorescente Bgt, zoals eerder beschreven in het volgen van GABAA en GABAB metabotrope receptoren 2,10. Naast de BBS plaats, hebben wij een pH-gevoelige GFP (pHGFP 11) tussen aminozuren 4 en 5 van het rijpe GABAAR subeenheid van standaard molecular biologie en PCR klonering strategieën (zie figuur 1) 12. De BBS 3 &#39;van de pH-gevoelige GFP reporter, gescheiden door een 13-aminozuur alanine / proline linker. Voor verhandelen studies in deze publicatie die gebaseerd zijn op gefixeerde monsters beschreven, de pHGFP dient als een reporter totale gelabeld GABAAR subeenheideiwit niveaus, zodat normalisatie van de Bgt gemerkte receptor populatie totale receptor populatie. Dit minimaliseert cel om Bgt vlekken signaal variabiliteit als gevolg van hogere of lagere baseline expressie van het tagged GABAAR subeenheden cel. Verder is de pHGFP tag maakt een eenvoudige identificatie van construct tot expressie brengen van levende of vaste imaging experimenten.

Karakterisatie van een BBS gelabeld construct belangrijkste bedienings zoals bepalen of het tot expressie gebrachte eiwit assembleert correct (met name receptoren bestaan ​​uit meerdere subeenheden), traffics naar het celoppervlak en lokaliseert gepast. Remmende synapsen zijn samengesteld uit GABA A receptor oppervlak clusters die colocalize met de remmende steiger eiwit gephyrin en worden apposed presynaptische remmende terminals, geïdentificeerd door de vesiculaire remmende aminozuur transporter dat GABA en glycine ge...

Hier laten wij het gebruik van fluorescente Alexa kleurstof gekoppeld met α-bungarotoxine aan GABAA-receptor oppervlak lokalisatie en endocytose in hippocampale neuronen meten. Door het gebruik van constructies, voorzien van een korte extracellulaire tag die bindt α-bungarotoxin, kan de analyse van plasmamembraaneiwit endocytische mensenhandel worden bereikt.

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de lokalisatie op het oppervlak en de endocytose van gabaa-receptoren in hippocampale neuronen. Dit wordt bereikt door eerst hippocampale neuronen te transfecteren met de getagde gabaa-receptor subunit en de gecultiveerde neuronen te laten ontwikkelen in de incubator. De tweede stap is het labelen van de gabaa-receptoren op het oppervlak met alpha-bungarotoxine gekoppelde fluorescerende Alexa-kleurstof.Vervolgens worden de neuronen gedurende verschillende tijdstippen geïncubeerd om endocytose van de gelabelde receptoren mogelijk te maken. De laatste stap is het fixeren van de monsters op de juiste tijdstippen en het uitvoeren van immunokleuring met anti-GFP om de totale pool van getagde receptoren waar te nemen. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om veranderingen in de oppervlkelokalisatie en endocytose van de getagde gabaa-receptoren aan te tonen middels gefixeerde of live-imagingbenaderingen.Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van receptortransport te beantwoorden, zoals welk effect ligandbinding kan hebben op de endocytose- en insertiesnelheden van receptoren, en of verschillende lig

using-an-bungarotoxin-binding-site-tag-to-study-gaba-receptor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Tagging door de extracellulaire domeinen van membraanreceptoren met superecliptic pHluorin, en imaging deze fusie-receptoren in gekweekte muis neuronen, kunnen we direct visualiseren individuele vesiculaire inbrengen gebeurtenissen van de receptoren aan het plasmamembraan. Deze techniek zal instrumenteel ophelderen van de moleculaire mechanismen voor insertie receptor naar de plasmamembraan.

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

This video demonstrates an antibody-feeding approach to study the trafficking of glutamate receptors in primary hippocampal neuronal cultures. This approach allows the observation of receptor populations at both the plasma and internal membranes. Discrimination between these subsets is achieved by labeling the receptors before and after membrane permeabilization, using the same primary antibody but secondary antibodies conjugated to different fluorophores.

An In Vitro Technique to Study Glutamate Receptor Trafficking in Hippocampal Neurons

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Een construct dat codeert TMEM184A met een GFP-tag aan het carboxy-uiteinde ontworpen voor eukaryotische expressie, werd gebruikt in testen die de identificatie van TMEM184A als heparine receptor in vasculaire cellen bevestigen.

Met een GFP-gelabeld TMEM184A Construct voor bevestiging van Heparine Receptor Identity

Hier presenteren we protocollen om te ontdekken van verbindingen actief bij GABAA -receptoren, van de binding aan de Fysiologie en farmacologie.

Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

Het doel van dit protocol is te vergemakkelijken van de studie van NMDA-receptoren (NMDAR) op een grotere schaal en het onderzoek van f effecten van kleine moleculen en hun therapeutische toepassingen.

Een High-throughput Calcium-flux Assay te studeren NMDA-receptoren met gevoeligheid voor Glycine/D-serine en glutamaat

Neuronale prikkelbaarheid kan worden gedifferentieerd door middel van een dynamisch proces van endo- en exocytose van excitatory ionotropic glutamaat receptoren. Hier beschreven is een toegankelijke, hoge-inhoud assay voor het kwantificeren van de groepen van de bevolking van de oppervlakte en interne receptor.

Een High-inhoud Assay voor het toezicht op AMPA Receptor mensenhandel

Dit artikel presenteert een methode voor de studie van glutamaat receptor (glur) handel in gezien primaire hippocampal culturen. Met behulp van een antilichaam-voedende benadering voor het etiket van endogene of overexpressie receptoren in combinatie met farmacologische benaderingen, deze methode maakt het mogelijk voor de identificatie van moleculaire mechanismen regulering van GluR oppervlakte expressie door modulerende processen voor internalisatie of recycling.

Een aanpak van antilichamen voeding te bestuderen glutamaat receptor handel in Dissociated primaire Hippocampal culturen

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Dit protocol beschrijft expressie en kwantificatie van neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van de zoogdier-Neuro-2a-cellijn. pH-gevoelige fluorescentielabels en confocale microscopie maken een nauwkeurige evaluatie mogelijk van receptorlokalisatie bij het plasmamembraan ten opzichte van die in pH-neutrale intracellulaire compartimenten, wat de studie van nAChR-transport en farmacologische modulatie vergemakkelijkt.

Lokalisatie van plasmamembraan en intracellulaire neuronale nicotinische acetylcholinereceptoren met behulp van kwantitatieve beeldvorming in zoogdiercellen

Leer hoe u GABA_A-receptor oppervlaktelokalisatie en endocytose meet in hippocampale neuronen met behulp van fluorescent gelabelde α-bungarotoxin. Deze methode ondersteunt onderzoek naar synaptische functie en plasticiteit.

Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

Meer video's verkennen