Met behulp van een α-bungarotoxin Binding Site Tag om te studeren GABA A receptor membraanlokalisatie en handel

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de lokalisatie op het oppervlak en de endocytose van gabaa-receptoren in hippocampale neuronen. Dit wordt bereikt door eerst hippocampale neuronen te transfecteren met de getagde gabaa-receptor subunit en de gecultiveerde neuronen te laten ontwikkelen in de incubator. De tweede stap is het labelen van de gabaa-receptoren op het oppervlak met alpha-bungarotoxine gekoppelde fluorescerende Alexa-kleurstof.

Vervolgens worden de neuronen gedurende verschillende tijdstippen geïncubeerd om endocytose van de gelabelde receptoren mogelijk te maken. De laatste stap is het fixeren van de monsters op de juiste tijdstippen en het uitvoeren van immunokleuring met anti-GFP om de totale pool van getagde receptoren waar te nemen. Uiteindelijk wordt confocale microscopie gebruikt om veranderingen in de oppervlkelokalisatie en endocytose van de getagde gabaa-receptoren aan te tonen middels gefixeerde of live-imagingbenaderingen.

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen op het gebied van receptortransport te beantwoorden, zoals welk effect ligandbinding kan hebben op de endocytose- en insertiesnelheden van receptoren, en of verschillende liganden en modulatoren het recyclen en de degradatie van receptoren kunnen beïnvloeden. Hoewel deze methode voornamelijk is gebruikt om geligande ionkanalen en G-eiwitgekoppelde receptoren te bestuderen in de context van het zenuwstelsel, kan ze ook worden toegepast om de dynamische lokalisatie en het transport van andere membraaneiwitten in celculturen en primaire cellen van diverse weefsels te bestuderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode met twee zaken worstelen.

Ten eerste om functionele constructen te creëren en ten tweede voor de oefening en ervaring die nodig zijn om meerdere tijdspunten gelijktijdig te verwerken. Bereid ter start vier tot vijf ronde, met poly-de-lysine gecoate glazen dekglasjes voor in elk weefselkweekschaaltje van 3,5 centimeter, zoals beschreven in het tekstprotocol. Transfect vervolgens op de dag van het cultiveren vers gedissocieerde neuronen met één tot vier microgram maxiprep construct-DNA per plaat.

De getransfecteerde neuronen op de met poly-D-lysine gecoate dekglasjes hebben een uiteindelijke dichtheid van ongeveer 200 000 neuronen per schaal van 3,5 centimeter. Vervang het medium vier tot 24 uur na de bereiding van de neuronale culturen. Laat de neuronen vervolgens uitgroeien in de incubator tot 14 tot 17 dagen in vitro of tot het gewenste stadium om de endocytose-assay uit te voeren.

Stel eerst een laboratoriumkoel- en verwarmingsapparaat in op 16 °C. Koel extracellular heaps, gebufferde zoutoplossing of HBS af tot 16 °C in een waterbad. Verplaats de schaaltjes met neuronen naar de aluminium plaat op 16 °C en koel deze vijf minuten lang.

Verwijder het medium en vervang dit door 1 mL HBS van 16 °C plus 150 µM tubocurarine gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens het medium naar een gelabelde afvalbak en vervang het door 1 mL HBS van 16 °C plus tubocurarine plus alfa-bungarotoxine Alexa 594, met incubatie bij 16 °C gedurende 15 minuten.

Breng na incubatie het medium over naar een gelabelde afvalcontainer en was de schaaltjes drie keer met 2 mL HBS van 16 °C voor live-imaging tijdreeksexperimenten na receptor-endocytose met gebruik van een glazen 3,5 cm cultuurschaaltje. Plaats het schaaltje op een verwarmde tafel van de microscoop en start de beeldvorming met een confocale of turf-microscoop. Stel everything in voor gefixeerde dekglasplaatjes.

Breng de dekglasjes van tijdstip T=0 over naar een schaal met 4% paraformaldehyde en 4% sucrose op kamertemperatuur gedurende 20 minuten voor de overige tijdstippen. Vervang HBS door geconditioneerd, geëquilibreerd medium van 37 °C en plaats deze terug in de incubator voor endocytose bij 37 °C voor de benodigde tijdstippen. Neem de schalen uit de incubator en was deze snel tweemaal met twee milliliter gefosfateerde zoutoplossing (DPBS) op kamertemperatuur.

Fixeer het preparaat vervolgens gedurende 20 minuten in 4%paraform aldehyde, 4%sucrose. Verwijder na deze fixatie van 20 minuten de 4%paraform aldehyde, 4%sucrose naar de afvalcontainer en was de schaaltjes twee keer met twee milliliter DPBS op kamertemperatuur. Incubeer de dekglasjes vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Een immunofluorescentie-blokkeeroplossing met 0,2% Triton X 100 om de neuronen te permeabiliseren en immunovleking met anti-GFP van de intracellulaire receptorenpool en/of labeling van andere eiwitten van belang mogelijk te maken. Verwijder vervolgens de permeabiliserende blokkeeroplossing en incubeer de dekglasjes gedurende 20 tot 30 minuten in een immunofluorescentie-blokkeeroplossing zonder Triton X 100. Voer de incubaties van de dekglasjes met het primaire antilichaam uit in blokkeeroplossing gedurende enkele uren bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 °C na de incubatie.

Was de dekglasjes door ze gedurende vijf minuten in DPBS te weken, in totaal drie keer. Incubeer de dekglasjes vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur met secundaire antilichamen in blokkeeroplossing. Was de dekglasjes drie keer met DPBS zoals eerder beschreven.

Monteer vervolgens elk dekglas door overtollige vloeistof aan de achterzijde van het dekglas met laboratoriumdoekjes te verwijderen en het dekglas vervolgens omgekeerd op vier microliters monteermedium op een objectglas te plaatsen. Voer de beeldacquisitie uit met confocale microscopie, blind voor de experimentele conditie, met gebruik van een 60 x olie-immersie-objectief met een numerieke apertuur van 1.49.

Leg met dezelfde instellingen voor beeldacquisitie enkelvoudige Z-sectiebeelden vast waarbij het neuronale cellichaam en verschillende dendritische uitlopers in focus zijn. Kwantificeer het alpha bungalow toxine, het Alexa fluorescentiesignaal en de GFP-immunokleuring over 20 microns van drie tot vier proximale dendrieten per neuron, waarbij voor de analyse van alle endocytosegegevens dezelfde drempelwaarde wordt gebruikt. Analyseer de gegevens van 10 tot 12 neuronen voor elk tijdstip. Herhaal het experiment met verschillende onafhankelijke neuronale culturen.

GABAerge axonen maken inhiberende contacten met dendrieten van piramidale neuronen. Presynaptische inhiberende terminalen worden geïdentificeerd door de vesiculaire inhiberende aminozuurtransporter die GABA en glycine in synaptische blaasjes laadt. GABA$_A$-receptoren bevinden zich in nauw contact met de neurotransmitter-afgifteplaatsen die verankerd zijn door het postsynaptische inhiberende steuneiwit gephyrine. Hier worden $\alpha$2-phg-FPBBS-expresserende neuronen getoond met oppervlakte-GABA$_A$-receptoren gelabeld met Alexa 594-bungalotoxine, gevolgd door immunokleuring voor de totale receptorpopulatie met een anti-GFP-antilichaam (getoond in groen), en ofwel het postsynaptische inhiberende steuneiwit gephyrine of de vesiculaire inhiberende aminozuurtransporter.

Hier wordt de endocytose van de GABA A-receptor met alpha 2 in hippocampale neuronen na 15 dagen in vitro getoond met alpha-bungaroxine. Fluorescentiemetingen van individuele dendritische processen, zoals weergegeven in de panelen, zijn genormaliseerd naar het expressieniveau van het construct via de GFP-antilichamen. De uiteindelijke vergelijking van de tijdspunten wordt gemaakt door normalisatie naar de meting bij T = 0.

Kwantificering van de internalisatie van receptoren over een periode van 60 minuten, op basis van veranderingen in het fluorescentiesignaal in de tijd, werd het best beschreven door een enkele exponentiële functie. Een alternatieve benadering is om de endocytose van receptoren in één enkel neuron te volgen middels time-lapse confocale microscopie van levende cellen. De punctate en overlappende fluorescentie van P-H-G-F-P-getagde GABA A-receptoren en met surface alpha bungalow toxine gelabelde receptoren is zichtbaar aan het begin van het experiment; gedurende het tijdsverloop neemt het signaal van de met alpha bungalow toxine gelabelde GABA A-receptoren af naarmate de receptoren endocyteren.

Terwijl het P-H-G-F-P-signaal hoog blijft door de insertie van nieuwe receptoren, is de minimale afname van het P-H-G-F-P-signaal na deze procedure toe te schrijven aan veranderingen in de distributie van receptoren op het celoppervlak en fotobleken. Andere methoden, zoals bungalowtoxine-insertieassays, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de insertiesnelheden van receptoren bij verschillende behandelingen. Deze techniek maakt het mogelijk om te beoordelen hoe cellulaire activiteit, specifieke proteinedomeinen, agonisten en andere modulatoren de receptoromzeteling kunnen beïnvloeden in levende neuronen, andere cellen en weefsels.

Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u alpha bungalow toxine gekoppeld aan Alexa-kleurstoffen kunt gebruiken in combinatie met standaard immunofluorescentietechnieken om de lokalisatie van oppervlaktereceptoren in hippocampale neuronen te kwantificeren.