Name: Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor het aanhechten van virussen aan glazen oppervlakken voor atoomkrachtmicroscopie en superresolutie fluorescentiebeeldvorming. Deze techniek zorgt voor gecontroleerde hechting van virionen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Dr. Till Böcking voor het originele single molecule preparation protocol. 
Dit werk werd ondersteund door NSF-subsidie 1121972(SS).

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
<li>Kol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Stiffness+Switch+in+Human+Immunodeficiency+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A Stiffness Switch in Human Immunodeficiency Virus.</a> Biophys. J. 92, 1777-1783 (2007).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+tip%E2%80%93sample+forces+in+jumping+mode+atomic+force+microscopy+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Minimizing tip–sample forces in jumping mode atomic force microscopy in liquid.</a> Ultramicroscopy. 114, 56-61 (2012).</li>
<li>Ortega-Esteban, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dynamics+of+human+adenovirus+disassembly+induced+by+mechanical+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Monitoring dynamics of human adenovirus disassembly induced by mechanical fatigue.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Hernando-Pérez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+Virology%3A+Direct+Measurement+of+Phage%5BTitle%5D)+AND+%22phi29+Stiffness+Provides+Evidence+of+Internal+Pressure+%28Small+15%2F2012%29.+Small%22%5BJournal%5D)">Physical Virology: Direct Measurement of Phage.</a> phi29 Stiffness Provides Evidence of Internal Pressure (Small 15/2012). Small. 8, 2365-2365 (2012).</li>
<li>Carrasco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+anisotropic+mechanical+reinforcement+of+a+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated anisotropic mechanical reinforcement of a virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13706-13711 (2006).</li>
<li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ethylene+oxide%29+Grafted+to+Silicon+Surfaces%3A+Grafting+Density+and+Protein+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(ethylene oxide) Grafted to Silicon Surfaces: Grafting Density and Protein Adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li>
<li>Visnapuu, M. -L., Duzdevich, D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+surfaces+in+single-molecule+bioscience%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">The importance of surfaces in single-molecule bioscience.</a> Mol. Biosyst. 4, 394-403 (2008).</li>
<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen in dit artikel.

Enkelvoudige virion imaging met AFM en High-resolution fluorescentie imaging kan worden gebruikt als alternatieve methodologie voor CryoEM tomografie. Elk van deze methodologieën heeft zijn specifieke sterke punten. Afm kan bijvoorbeeld worden gedaan op WT virionen zonder dat het monster of de interne virale eiwitten hoeven te worden getagd. De locatie van virale structuren is gedeconvoleerd van hun bijdragen aan de elastische eigenschappen van het virion.
Single virion super-resolution imaging in combinatie met de nieuw ontwikkelde virale reverse genetische benaderingen wordt een krachtige techniek voor het lokaliseren van lage copy number virale eiwitten20. Recombinante virussen met vervanging van hun eiwitten door eiwitten versmolten met fluorescerende eiwitten kunnen worden gemaakt en gezuiverd met behulp van deze omgekeerde genetische benaderingen. Hoewel beeldvorming met superresolutie specificiteit heeft, deels vanwege de genetische tagging, vereist het het gebruik van de mutante virussen.
AFM en superresolutiebeeldvorming zijn complementaire methoden die zeer vergelijkbare monstervoorbereidingen gebruiken. De methoden die in dit artikel worden beschreven, die worden aangenomen, vormen eerdere beeldvormingstesten met één molecuul, maken verankering van enkelvoudige virionen mogelijk met weinig effecten op de topologie van de virionen.

Op lading gebaseerde niet-specifieke interacties worden routinematig gebruikt voor adhesie van virionen in atoomkrachtmicroscopie1,2. Deze technieken werken vooral goed bij gebruik op niet-ontwikkelde virionen met zeer stijve capsids3-6. Hoewel deze technieken zeer effectief zijn in het immobiliseren van het monster, voorkomen ze niet dat niet-specifieke binding van eiwitten aan het oppervlak. De aspecifieke binding kan een probleem veroorzaken bij het in beeld brengen van virionen met AFM en superresolutiefluorescentietechnieken die incubaties van het monster met verschillende antilichamen vereisen. Hier schetsen we een monstervoorbereidingsmethode voor specifieke immobilisatie van virionen.
Poly(ethyleenglycol) (PEG) geënt op poly(L-lysine) (PLL) en geadsorbeerd op een glasoppervlak vormt een belangrijk blok voor de elektrostatische interacties van eiwitten met glas7. Single molecule assays die immobilisatie van enkele moleculen op glazen oppervlakken vereisen, hebben van deze eigenschap geprofiteerd en deze gebruikt om een specifieke PEG-gebaseerde single molecule immobilisatietechniek8-10te creëren. Dit preparaat werd ook gebruikt om clathrinekooien op het glasoppervlak11 te immobiliseren en een homogene fibronectinecoating te creëren voor de hechting van de controlecel 12.
We hebben de monstervoorbereidingsmethode op basis van PLL-g-PEG-adsorptie op glasoppervlakken van beeldvormingsmethoden met één molecuul overgenomen en toegepast op beeldvorming van enkelvoudige virionen van vesiculaire stomatitisvirus (VSV). Deze enkelvoudige virionen werden afgebeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM). Soortgelijke experimenten werden ook uitgevoerd op gefunctionaliseerde kralen als een controle. De virionen werden ook afgebeeld door fluorescentiemicroscopie met superresolutie, waarbij een VSV-G-antilichaam met Alexa 647 werd gebruikt om een afbeelding te maken van de envelop van enkele virionen. Fluorescerende beeldvorming met hoge resolutie maakt gebruik van lokalisatie van enkele moleculen om een afbeelding13-15te maken. fPALM bi-planaire beeldvorming maakt lokalisatie van enkele moleculen mogelijk met 20 nm in vlak en 50 nm resolutie langs de optische as15,16. Deze bi-planaire techniek werd gebruikt om fluorescerende beelden met superresolutie in beeld te brengen die in deze studie aanwezig waren. Een alternatieve techniek met vergelijkbare resultaten is STORM13,17,18.
Zowel AFM als superresolutie fluorescerende beelden van VSV die door de in dit document beschreven procedures aan het glas waren verankerd, toonden een specifieke binding van virionen aan het glas met minimale niet-specifieke interacties19. Hier presenteren we de voorbeeldvoorbereidingsprotocollen voor de AFM en superresolutie fluorescentie beeldvormingsexperimenten. In het kort: Schone glasafdekkingen worden gefunctionaliseerd door een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-biotine te adsorberen. Het is typisch voor deze dunne film om tussen 15-25% gefunctionaliseerd biotine op een gecoate oppervlakte te verstrekken. De coverslips worden verder geïncubeerd met tetramere avidin. Een biotinylated viraal antilichaam wordt vervolgens gebruikt om een unieke bindingsplaats voor de virionen te creëren. Binding van het antilichaam kan op twee manieren worden gedaan.
De eerste methode is geoptimaliseerd voor AFM, maar blijft geschikt voor superresolutie fluorescentie beeldvorming. Bij deze methode wordt het avidin gecoate oppervlak behandeld met biotinylated antilichaam voorafgaand aan virale adhesie. De geïmmobiliseerde virionen worden behandeld met Alexa 647 gelabeld antilichaam om de envelop te bedekken en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie van de virionen mogelijk te maken.
De tweede methode is om het virus in oplossing aan te vallen met het biotinylated antilichaam en Alexa 647 gelabeld antilichaam voordat de virussen aan het met avidin behandelde oppervlak worden vastgehouden; deze methode is geoptimaliseerd voor superresolutie fluorescentiebeeldvormingsexperimenten waarbij herstel van de virale envelop belangrijk is. Deze methode heeft het voordeel dat uniforme antilichaamcoating op het virale oppervlak mogelijk is. Het biotinylated antilichaam kan worden gemengd met Alexa 647 gelabelde virale antilichamen in verhoudingen die voldoende adsorptie van het virus naar het met avidin behandelde oppervlak mogelijk maken met behoud van een hoge concentratie fluorescerend label aan de buitenkant van de virale envelop. Deze Alexa 647 gelabelde virale antilichamen zijn niet biotinylated en hun overmaat kan worden weggespoeld om achtergrondgeluid te verminderen.

<table><tbody><tr><td>Glass coverslips (fPALM)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>72225-01</td><td>25 mm Coverslips</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)&nbsp;</td><td>SuSoS</td><td>-</td><td>Stock: 0,5 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin biotin-binding protein</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock: 0,25 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7,2 buffer</td></tr><tr><td>&alpha;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% Glycol, pH 7,2 buffer</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glucose oxidase type zeven van Aspergillius&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Catalase van Runderlever&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cysteamine (MEA</td></tr><tr><td>Stock Buffer</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10% glucose</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, mini dialyse-eenheid</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass: 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilisatie van virionen op glasoppervlakken is een cruciale stap in single virion imaging. Hier presenteren we een techniek die is overgenomen uit beeldvormende assays met één molecuul die hechting van enkelvoudige virionen op glasoppervlakken met specificiteit mogelijk maakt. Dit preparaat is gebaseerd op het enten van het oppervlak van het glas met een mengsel van PLL-g-PEG en PLL-g-PEG-Biotine, het toevoegen van een laag avidine en ten slotte het creëren van virionankers door aanhechting van biotinylated virusspecifieke antilichamen. We hebben deze techniek toegepast in een reeks experimenten, waaronder atoomkrachtmicroscopie (AFM) en fluorescentiebeeldvorming met superresolutie. Deze monstervoorbereidingsmethode resulteert in een controleadhesie van de virionen aan het oppervlak.

Single virion imaging met afm:
Het hierboven beschreven monstervoorbereidingsprotocol werd gebruikt bij het verankeren van virionen van het wilde type aan het glasoppervlak. VSV virionen zijn kogelvormig 180 nm lang en 80 nm in diameter. Omdat er een verscheidenheid aan virionen zijn waarvoor deze techniek kan worden toegepast, wordt het concept hier ook gedemonstreerd op biotinylated 36 nm kralen. De daaruit voortvloeiende AFM-experimenten zijn weergegeven in figuur 1. Het is belangrijk op te merken dat de VSV virionen een lagere Young's modulus (100 MPa) hebben in vergelijking met de niet-ontwikkelde virussen (GPa). De specifieke beelden van single virion VSV werden verkregen onder tapmodus in omgevingsomstandigheden met een stijve cantilever. Het doel was om het virus zo te vervormen dat de extra eiwitdichtheid binnen het virus zichtbaar wordt als een bult binnen het AFM-imago. Deze methode wordt gebruikt om de extra eiwitdichtheid in de virusholte te detecteren19.
Single virion super resolutie beeldvorming:
Alexa 647 gelabelde VSV-G antilichamen werden gebruikt om de envelop van individuele VSV virionen te coaten voor superresolutie experimenten met behulp van methode 5A. Om de tetheringdichtheid en de lage aspecifieke binding aan te tonen, wordt in figuur 2Aeen grote scan van het monster weergegeven . Het herstel van de virale envelop op een representatieve virion is weergegeven in figuur 2B (blauwe isosurface).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figuur 1. AFM beeldvorming van kralen en VSV op het gefunctionaliseerde PEGG oppervlak. AFM-scan van 36 nm biotinylated beads (A, B) en een VSV virion (C) verankerd aan het oppervlak met een biotinylated VSVG antilichaam. AFM werd gedaan in ac lucht topografie scan modus. De tipradius is <25 nm en metingen werden uitgevoerd onder krachtmodulatie en lichttikken. De tip had een krachtconstante van 3 N/m en resonantiefrequentie 75 kHz met onzekerheid van 15 kHz. Terwijl de kralen hun hoogte behouden tijdens de AFM-scan, heeft de VSV virion een aanzienlijk kleinere jonge modulus en is het aanzienlijk vervormd in hoogte. In deze afbeelding werd de virion specifiek afgebeeld met een stijve cantilever in tapmodus die een kleine xy convolutie produceerde (gebruikt om de tip versus het stompe uiteinde van het virus te bepalen) en het hoogteverschil tussen de punt en het stompe uiteinde van het virus wordt gebruikt om extra eiwitdichtheid aan het stompe uiteinde van het virus te detecteren19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figuur 2. Fluorescentie gebaseerde beeldvorming van VSV virionen op het PEGG gefunctionaliseerde oppervlak. A) recombinante VSV-virionen geïmmobiliseerd op het PEGG-oppervlak met behulp van een biotinylated anti VSVG-antilichaam afgebeeld in brede veldfluorescentie. B) Fluorescentiereconstructie met hoge resolutie van de envelop van VSV die aan het PEGG-oppervlak is bevestigd door middel van een biotinylated anti VSVG-antilichaam en versierd met Alexa 647 gelabelde anti-VSVG-antilichamen (methode 5A werd gebruikt voor het maken van deze afbeeldingen). Het blauwe oppervlak is een 2D isosurface projectie. Links ziet u een model van het kogelvormige virus. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Coverslip Grootte</td>
			<td style="width:93px;">vloeistof</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Vloeibare aliquots volgens coverslip grootte.

De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Deze procedure beschrijft de preparatie van glazen dekglasplaatjes met virussen voor gebruik in atoomkrachtmicroscopie en superresolutiemicroscopie, zoals fluorescentie-foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie. Reinig eerst het glazen substraat en bedek het glas met een dunne film van gedeeltelijk gebiotineerd polyethyleenglycol dat is gegraft aan poly-L-lysine. Behandel vervolgens het oppervlak met avadon om de bindingsaffiniteit van de gebiotineerde film te verhogen.Behandel het oppervlak nu met gebiotinyleerde antilichamen die specifiek zijn voor het betreffende virus. Behandel het met antilichamen geprepareerde oppervlak vervolgens met het betreffende virus. In tegenstelling tot spin coating heeft deze techniek het voordeel dat varianten homogeen over het oppervlak worden verdeeld.Om de microscopie te optimaliseren, plaatst u de dekglasjes verticaal in een Teflon dekglasrek van passende grootte en dompelt u deze onder in een bekerglas gevuld met gefilterde ethylalcohol; sonicate gedurende 30 minuten. Spoel de dekglasjes vervolgens uitgebreid af met ultrapuur water. Plaats de dekglasjes daarna in een apart schoon Teflon rek en een bekerglas gevuld met 1 M natriumhydroxide, sonicate gedurende 30 minuten en spoel uitgebreid af met ultrapuur water.Droog de gespoelde dekglasjes nu onder een stroom stikstof en breng ze over naar een schoon, droog Teflon rek. Controleer of elk dekglasje vrij is van zichtbare films of deeltjes. Plaats direct na het horizontaal drogen in de stikstofstroom één dekglasje in een steriele Petrischaal en pipetteer de juiste hoeveelheid gebiotineerd polylysine-gegraft polyethyleenglycol in PBS op het centrum van het dekglasje.Plaats een ander schoon dekglas bovenop de vloeistof via de sandwichmethode. Zorg ervoor dat het volume tussen de actieve zijden van de twee dekglazen volledig met vloeistof is gevuld. Dek de Petrischaal af en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten.Pak vervolgens de sandwich op met een pincet zonder het overtollige vloeistof eruit te knijpen. Knijp nu met de duim en wijsvinger de sandwich lichtjes en horizontaal samen. Schuif de dekglasjes in tegenovergestelde richtingen en scheid ze zonder de actieve zijden aan te raken.Spoel beide actieve zijden af met 25 milliliters ultrapuur water. Droog de dekglasjes vervolgens met een stikstofstroom en noteer in een steriele Petrischaal welke zijden van de dekglasjes actief zijn. Plaats een behandeld dekglasje met de actieve zijde naar boven en pipetteer een passende hoeveelheid ontdooide bewijslosie op het midden van de actieve zijde.Plaats een ander dekglas met de actieve zijde naar beneden om de vloeistof in te sluiten en incubeer vervolgens gedurende 25 tot 30 minuten bij kamertemperatuur. Scheid daarna de twee dekglazen zoals eerder beschreven. Zorg ervoor dat de actieve zijden niet worden aangeraakt.Spoel nu beide actieve zijden af met 25 milliliters ultrapuur water en droog de dekglasjes vervolgens met een stroom stikstof. Het is belangrijk om te onthouden welke zijden van de dekglasjes actief zijn. Plaats voor toekomstig gebruik een avid en behandeld dekglasje onmiddellijk met de actieve zijde naar boven in een steriele Petrischaal, en pipetteer een passende hoeveelheid ontdooide gebiotinyleerde antilichamen op het midden van de actieve zijde.Plaats een ander dekglas met de actieve zijde naar beneden op de vloeistof met behulp van een sandwichmethode. Incubeer dit vervolgens gedurende 45 tot 60 minuten bij kamertemperatuur. Spoel na het scheiden van de twee dekglazen beide actieve zijden af met 25 milliliters PBS. Plaats vervolgens een met antilichaam behandeld dekglas met de actieve zijde naar boven in een steriele Petrischaal en pipetteer een passende hoeveelheid virus op het midden van de actieve zijde.Plaats nu een tweede actieve dekglasplaat erop als sandwich, schuif deze op hun plaats, dek af en incubeer. Scheid vervolgens de twee dekglasplaatjes. Spoel beide actieve zijden met 25 milliliters PBS en breng ze over naar een Teflon rek en een bekerglas gevuld met PBS.Gebruik de bereide monsters direct of bewaar ze bij vier graden Celsius voor maximaal drie dagen. Hier werden wild-type varianten van het vesicular stomatitis virus verankerd aan het glasoppervlak en geanalyseerd met behulp van atoomkrachtmicroscopie. De breedte en lengte van het virion zijn 80 nanometers bij 180 nanometers, wat minimale vervormingen ten opzichte van de oorspronkelijke grootte van het virion laat zien.In dit experiment werd een enkel virion in beeld gebracht met fluorescentie-fotoactivatie-lokalisatiemicroscopie. Hiervoor werden Alexis 6 47-gelabelde VSVG-antilichamen gebruikt. Het blauwe iso-oppervlak toont het gereconstrueerde oppervlak van het virion met behulp van FOM-microscopie.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glazen dekglasjes met virussen klaarmaakt voor gebruik met atoomkrachtmicroscopie of superresolutiemicroscopie. Het is belangrijk om te allen tijde te onthouden welke zijde van het dekglasje de actieve chemie bevat.

sample-preparation-for-single-virion-atomic-force-microscopy-super

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Bron: Zeigler Allen, L., et al. Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'. J. Vis. Exp. (2013).Deze video demonstreert hoe flowcytometrie de isolatie van individuele, genoombevattende virussen uit gemengde populaties mogelijk maakt via fluorescentiegebaseerde detectie en nauwkeurige partikelsortering, gevolgd door inbedding in agarose voor daaropvolgende genomische karakterisering.

Fluorescentiegebaseerde sortering van individuele viruspartikels voor genomische analyse

Dit handschrift maakt gebruik van de Fiji-gebaseerde open-source softwarepakket VirusMapper single-deeltje analyse van toepassing op super-resolutie microscopie afbeeldingen om nauwkeurige modellen van de nanoschaal structuur te genereren.

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Dit protocol beschrijft het nodige eiwit subcellular localisatie om resultaten te verkrijgen op de zebravis netvlies door correleren super resolutie de lichte microscopie en elektronenmicroscopie afbeeldingen scannen.

Oereenstemming super resolutie en elektronenmicroscopie op te lossen eiwit lokalisatie in Zebrafish Retina

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Hier beschrijven we een enkele cel micro-aspiratie methode voor de scheiding van geïnfecteerde amoebae. Om virale subpopulaties te scheiden in Vermamoeba vermiformis geïnfecteerd door Faustovirussen en onbekende reus virussen, ontwikkelden we het protocol hieronder beschreven en toonden zijn vermogen om twee laag-overvloed roman reus virussen scheiden.

Single cell micro-aspiratie als alternatieve strategie voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering voor scheiding van gigantische virus mengsels

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Dit protocol beschrijft de geavanceerde beeldvormingstoepassingen en het beheer van gedeelde middelen van een laser-scannend confocaal microscoopsysteem, geïntegreerd met een multiplexed arraydetector voor hoogresolutie cellulaire en subcellulaire beeldvorming. De workflow maakt multimodale beeldvorming mogelijk van confocaal tot superresolutie (~120 nm) binnen één platform, waardoor visualisatie op nanoschaal toegankelijker wordt.

Superresolutie beeldvorming en gedeeld beheer: een protocol voor confocale microscopie met multiplexdetectie

Leer een betrouwbare methode voor het aanhechten van virussen aan glazen oppervlakken voor atoomkrachtmicroscopie en superresolutie fluorescentiebeeldvorming. Deze techniek zorgt voor gecontroleerde hechting van virionen.

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Meer video's verkennen