Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming
January 2nd, 2014
De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.
Deze procedure bereidt glazen dekglasjes met virussen voor gebruik in atoomkrachtmicroscopie en superresolutiemicroscopie voor, zoals fluorescente foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie. Reinig eerst het glazen substraat en bedek het glas met een dunne film van gedeeltelijk biotinyleren polyethyleenglycol gegraft op poly L-lysine. Behandel vervolgens het oppervlak met avadon om de bindingsaffiniteit van de biotinyleren film te verhogen.
Behandel nu het oppervlak met biotinyleren antilichamen specifiek voor het virus van belang. Behandel vervolgens het met antilichamen behandelde oppervlak met het virus van belang. In tegenstelling tot spin coating heeft deze techniek het voordeel dat varianten homogeen over het oppervlak worden verdeeld.
Om de microscopie te optimaliseren, plaats de dekglasjes verticaal in een Teflon rek van gepaste grootte en dompel ze onder in een beker gevuld met gefilterde ethylalcohol, soniceer gedurende 30 minuten. Spoel vervolgens de dekglasjes grondig met ultrapuur water. Plaats de dekglasjes vervolgens in een aparte schone Teflon rek en beker gevuld met één molair natriumhydroxide, soniceer gedurende 30 minuten en spoel grondig met ultrapuur water.
Droog nu de gespoelde dekglasjes onder een stikstofstroom en breng ze over naar een schone droge Teflon rek. Controleer of elk dekglasje vrij is van zichtbare films of deeltjes. Direct na het drogen in de stikstofstroom horizontaal, plaats een dekglasje in een steriele petrischaal op het midden van het dekglasje, pipet de juiste hoeveelheid biotinyleren Polylysine gegraft polyethyleenglycol in PBS.
Plaats een ander schoon dekglasje bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Zorg ervoor dat het volume tussen de actieve oppervlakken van de twee dekglasjes volledig gevuld is met vloeistof. Bedek de petrischaal en incubeer op kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten.
Pak vervolgens de sandwich met een paar pincetten zonder het overtollige vloeistof uit te knijpen. Knijp nu met duim en wijsvinger het sandwich lichtjes en horizontaal. Schuif de dekglasjes in tegengestelde richtingen en scheid ze zonder de actieve oppervlakken aan te raken.
Spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter ultrapuur water. Droog nu de dekglasjes met een stikstofstroom en noteer welke dekglasje oppervlakken actief zijn in een steriele petrischaal. Plaats een behandeld dekglasje met de actieve zijde naar boven en pipet een geschikte hoeveelheid ontdooid bewijsoplossing op het midden van de actieve zijde.
Plaats een ander dekglasje met actieve zijde naar beneden om de vloeistof te sandwichen en incubeer vervolgens op kamertemperatuur gedurende 25 tot 30 minuten. Scheid vervolgens de twee dekglasjes zoals eerder getoond. Zorg ervoor dat u de actieve oppervlakken niet aanraakt.
Spoel nu beide actieve oppervlakken met 25 milliliter ultrapuur water en droog vervolgens de dekglasjes met een stikstofstroom. Het is belangrijk om te onthouden welke dekglasje oppervlakken actief zijn. Plaats voor toekomstig gebruik onmiddellijk een avid en behandeld dekglasje met de actieve zijde naar boven in een steriele petrischaal, pipet een geschikte hoeveelheid ontdooid biotinyleren antilichaam op het midden van de actieve zijde.
Plaats een ander dekglasje met actieve zijde naar beneden bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Incubeer vervolgens op kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten. Na het scheiden van de twee dekglasjes, spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter PBS. Plaats vervolgens een met antilichamen behandeld dekglasje met actieve zijde naar boven in een steriele petrischaal en pipet een geschikte hoeveelheid virus op het midden van de actieve zijde.
Sandwich nu met een tweede actieve dekglasjes, bedek en incubeer. Scheid nu de twee dekglasjes. Spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter PBS en breng ze over naar een Teflon rek en beker gevuld met PBS.
Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze tot drie dagen op vier graden Celsius. Hier werden wild type varion van vesiculair stomatitisvirus verankerd aan het glazen oppervlak en geanalyseerd door atoomkrachtmicroscopie. De breedte en lengte van het virion zijn 80 nanometer door 180 nanometer, wat minimale vervormingen van de oorspronkelijke grootte van het virion laat zien.
In dit experiment werd het enkele virion geïmager door fluorescente foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie. Met behulp van Alexis 6 47 gelabelde VSVG antilichamen. Het blauwe isooppervlak toont het herstelde oppervlak van het virion met behulp van FOM microscopie.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glazen dekglasjes met virussen kunt bereiden voor gebruik met atoomkrachtmicroscopie of superresolutiemicroscopie. Het is belangrijk om altijd te onthouden welk oppervlak van het dekglasje de actieve chemie heeft.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het voorbereiden van glazen dekglasjes met virussen voor gebruik in atoomkrachtmicroscopie (AFM) en superresolutiefluorescentiebeeldvorming. De techniek zorgt voor gecontroleerde hechting van virionen, wat hoge resolutie beeldvorming van virale structuren mogelijk maakt.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Virionhechting is essentieel voor beeldvormingstechnieken zoals AFM en superresolutiemicroscopie.
- Gecontroleerde hechting verbetert de kwaliteit van beeldvormingsresultaten.
- Vorige methoden bieden mogelijk geen uniforme verdeling van virionen.
- Deze studie introduceert een nieuwe methode voor monstervoorbereiding.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor de hechting van virionen aan glazen oppervlakken.
- Om de beeldkwaliteit in AFM en superresolutiemicroscopie te verbeteren.
- Om de effectiviteit van de methode te demonstreren met behulp van vesicular stomatitis virus.
Gebruikte methoden
- Reiniging en coating van glazen dekglasjes met biotinylerend polyethyleenglycol.
- Behandeling van oppervlakken met avidine en biotinylerende antilichamen specifiek voor het virus.
- Sandwichen van dekglasjes om uniforme vloeistofverdeling te faciliteren.
- Gebruik van sonicatie en spoeltechnieken om reiniging te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Virionen werden met succes verankerd op glazen oppervlakken voor beeldvorming.
- Enkelvoudige virionen werden met minimale vervorming afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- De methode toonde een effectieve verdeling van virionen over het oppervlak.
- Resultaten bevestigden de haalbaarheid van de voorbereidingsmethode voor hoge resolutie beeldvorming.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een betrouwbare aanpak voor virionhechting.
- Deze techniek verbetert de kwaliteit van beeldvorming in microscopietoepassingen.
- Toekomstige studies kunnen op deze methode voortbouwen voor verschillende virale beeldvormingstoepassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
