Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming
2 januari 2014
De bevestiging van virionen aan een oppervlak is een vereiste voor enkelvoudige virion imaging door Super-resolution fluorescentie imaging of atomic force microscopie (AFM). Hier demonstreren we een monstervoorbereidingsmethode voor gecontroleerde hechting van virionen op glasoppervlakken die geschikt zijn voor gebruik in AFM- en superresolutiefluorescentiebeeldvorming.
Deze procedure bereidt glazen dekglasjes met virussen voor gebruik in atoomkrachtmicroscopie en superresolutiemicroscopie voor, zoals fluorescente foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie. Reinig eerst het glazen substraat en bedek het glas met een dunne film van gedeeltelijk biotinyleren polyethyleenglycol gegraft op poly L-lysine. Behandel vervolgens het oppervlak met avadon om de bindingsaffiniteit van de biotinyleren film te verhogen.
Behandel nu het oppervlak met biotinyleren antilichamen specifiek voor het virus van belang. Behandel vervolgens het met antilichamen behandelde oppervlak met het virus van belang. In tegenstelling tot spin coating heeft deze techniek het voordeel dat varianten homogeen over het oppervlak worden verdeeld.
Om de microscopie te optimaliseren, plaats de dekglasjes verticaal in een Teflon rek van gepaste grootte en dompel ze onder in een beker gevuld met gefilterde ethylalcohol, soniceer gedurende 30 minuten. Spoel vervolgens de dekglasjes grondig met ultrapuur water. Plaats de dekglasjes vervolgens in een aparte schone Teflon rek en beker gevuld met één molair natriumhydroxide, soniceer gedurende 30 minuten en spoel grondig met ultrapuur water.
Droog nu de gespoelde dekglasjes onder een stikstofstroom en breng ze over naar een schone droge Teflon rek. Controleer of elk dekglasje vrij is van zichtbare films of deeltjes. Direct na het drogen in de stikstofstroom horizontaal, plaats een dekglasje in een steriele petrischaal op het midden van het dekglasje, pipet de juiste hoeveelheid biotinyleren Polylysine gegraft polyethyleenglycol in PBS.
Plaats een ander schoon dekglasje bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Zorg ervoor dat het volume tussen de actieve oppervlakken van de twee dekglasjes volledig gevuld is met vloeistof. Bedek de petrischaal en incubeer op kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten.
Pak vervolgens de sandwich met een paar pincetten zonder het overtollige vloeistof uit te knijpen. Knijp nu met duim en wijsvinger het sandwich lichtjes en horizontaal. Schuif de dekglasjes in tegengestelde richtingen en scheid ze zonder de actieve oppervlakken aan te raken.
Spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter ultrapuur water. Droog nu de dekglasjes met een stikstofstroom en noteer welke dekglasje oppervlakken actief zijn in een steriele petrischaal. Plaats een behandeld dekglasje met de actieve zijde naar boven en pipet een geschikte hoeveelheid ontdooid bewijsoplossing op het midden van de actieve zijde.
Plaats een ander dekglasje met actieve zijde naar beneden om de vloeistof te sandwichen en incubeer vervolgens op kamertemperatuur gedurende 25 tot 30 minuten. Scheid vervolgens de twee dekglasjes zoals eerder getoond. Zorg ervoor dat u de actieve oppervlakken niet aanraakt.
Spoel nu beide actieve oppervlakken met 25 milliliter ultrapuur water en droog vervolgens de dekglasjes met een stikstofstroom. Het is belangrijk om te onthouden welke dekglasje oppervlakken actief zijn. Plaats voor toekomstig gebruik onmiddellijk een avid en behandeld dekglasje met de actieve zijde naar boven in een steriele petrischaal, pipet een geschikte hoeveelheid ontdooid biotinyleren antilichaam op het midden van de actieve zijde.
Plaats een ander dekglasje met actieve zijde naar beneden bovenop de vloeistof in een sandwichmethode. Incubeer vervolgens op kamertemperatuur gedurende 45 tot 60 minuten. Na het scheiden van de twee dekglasjes, spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter PBS. Plaats vervolgens een met antilichamen behandeld dekglasje met actieve zijde naar boven in een steriele petrischaal en pipet een geschikte hoeveelheid virus op het midden van de actieve zijde.
Sandwich nu met een tweede actieve dekglasjes, bedek en incubeer. Scheid nu de twee dekglasjes. Spoel beide actieve oppervlakken met 25 milliliter PBS en breng ze over naar een Teflon rek en beker gevuld met PBS.
Gebruik de bereide monsters onmiddellijk of bewaar ze tot drie dagen op vier graden Celsius. Hier werden wild type varion van vesiculair stomatitisvirus verankerd aan het glazen oppervlak en geanalyseerd door atoomkrachtmicroscopie. De breedte en lengte van het virion zijn 80 nanometer door 180 nanometer, wat minimale vervormingen van de oorspronkelijke grootte van het virion laat zien.
In dit experiment werd het enkele virion geïmager door fluorescente foto-geactiveerde lokalisatiemicroscopie. Met behulp van Alexis 6 47 gelabelde VSVG antilichamen. Het blauwe isooppervlak toont het herstelde oppervlak van het virion met behulp van FOM microscopie.
Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u glazen dekglasjes met virussen kunt bereiden voor gebruik met atoomkrachtmicroscopie of superresolutiemicroscopie. Het is belangrijk om altijd te onthouden welk oppervlak van het dekglasje de actieve chemie heeft.
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het prepareren van glazen dekglasjes met virussen voor gebruik in atoomkrachtmicroscopie (AFM) en superresolutie fluorescentie-imaging. De techniek waarborgt een gecontroleerde adhesie van virionen, wat hoogresolutie-imaging van virale structuren faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- De hechting van virionen is essentieel voor beeldvormingstechnieken zoals AFM en superresolutie-microscopie.
- Gecontroleerde adhesie verbetert de kwaliteit van de beeldvormingsresultaten.
- Eerdere methoden boden mogelijk geen uniforme distributie van virionen.
- Deze studie introduceert een nieuwe methode voor monstervoorbereiding.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbare methode voor de adhesie van virionen aan glazen oppervlakken.
- Het verbeteren van de beeldkwaliteit in AFM en superresolutie-microscopie.
- Het aantonen van de effectiviteit van de methode met behulp van het vesiculaire stomatitisvirus.
Gebruikte methoden
- Het reinigen en coaten van glazen dekglasjes met gebiotineerd polyethyleenglycol.
- Het behandelen van oppervlakken met avidine en gebiotineerde antilichamen specifiek voor het virus.
- Het in een sandwichplaatsing brengen van dekglasjes om een uniforme vloeistofdistributie te faciliteren.
- Het gebruik van sonicatietechnieken en spoelmethoden om de reinheid te garanderen.
Belangrijkste resultaten
- Virionen werden succesvol verankerd aan glasoppervlakken voor beeldvorming.
- Enkelvoudige virionen werden met minimale vervorming in beeld gebracht met behulp van fluorescentiemicroscopie.
- De methode toonde een effectieve distributie van virionen over het oppervlak aan.
- De resultaten bevestigden de bruikbaarheid van de preparatiemethode voor resolutie-rijke beeldvorming.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een betrouwbare aanpak voor de adhesie van virionen.
- Deze techniek verbetert de beeldkwaliteit bij microscopie-toepassingen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode voor diverse toepassingen in virale beeldvorming.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Deze methode maakt gecontroleerde, homogene adhesie van virionen aan glasoppervlakken mogelijk, wat resolutiebeelden van hoge kwaliteit ondersteunt voor mechanistische studies naar virale structuur en interacties met de gastheer. Door een reproduceerbare monsterbereiding te garanderen, wordt de variabiliteit in daaropvolgende biofysische assays verminderd, wat de betrouwbaarheid van de gegevens voor targetvalidatie en lead-optimalisatie verbetert. De techniek is toepasbaar op omhulde virussen die relevant zijn voor antivirale ontdekkingsprogramma's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt directe visualisatie van de virionmorfologie en de distributie van oppervlakte-eiwitten mogelijk om inzicht te krijgen in de toegankelijkheid van het doelwit en de blootstelling van epitopen.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor het vergelijken van wild-type en mutante virionen onder identieke beeldvormingscondities.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de kwantitatieve beoordeling van de binding van antilichamen of liganden aan geïmmobiliseerde virionen via fluorescentie-uitlezingen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de uniformiteit van de assay door virion-clustering en oriëntatiebias over het beeldoppervlak te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt correlatie mogelijk tussen structurele veranderingen in virionen en functionele fenotypes, zoals infectiviteit of neutralisatieresistentie.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale monitoring van virale varianten in preklinische modellen mogelijk door gebruik te maken van een consistente monstervoorbereiding.
Integratie van pijplijn en workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows, waarbij structurele en biofysische karakterisering bijdragen aan de selectie van targets en het screenen van leadverbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot virale entry-mechanismen en antilichaam-gemedieerde neutralisatie via directe beeldvorming.
- Screening: Maakt reproduceerbare preparatie van virion-monsters mogelijk voor screeningcampagnes op basis van high-content imaging.
- Analytics: Genereert kwantitatieve morfometrische gegevens (bijv. virion-afmetingen) en fluorescentie-intensiteitsmetingen voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Verbindt in vitro virion-gedrag met preklinische effectiviteit door native structurele kenmerken tijdens de beeldvorming te behouden.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een aanpasbaar platform voor oppervlaktechemie dat toepasbaar is op meerdere virale targets binnen discovery-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verbetert het voorspellend vertrouwen in structural biology assays door artefacten door preparatie te minimaliseren.
- Operationele waarde: Verhoogt de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en beeldvormingsmodaliteiten door gestandaardiseerde oppervlaktefunctionalisering.
- Strategische waarde: Vermindert het aantal mislukte imaging-runs als gevolg van slechte adhesie van virionen, waardoor instrumenttijd en monsterbronnen worden bespaard.
- Impact op portfolio: Maakt snellere go/no-go beslissingen in antivirale projecten mogelijk door een vroege beoordeling van structurele risico's te bieden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in oppervlaktechemie en fluorescentiemicroscopietechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot AFM- en superresolutie-beeldvormingsinfrastructuur.
- Vereist strikte naleving van de oriëntatie van het actieve vlak tijdens de meerstapsassemblage.
- Aanpassing aan niet-omhulde virussen kan wijziging van de verankeringschemie vereisen.
- Opslagbeperkingen (tot 3 dagen bij 4°C) maken experimentele planning in dezelfde week noodzakelijk.
