Name: Methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Leer methoden om microbiële groei op zwavelloog uit pulpmolens te faciliteren en het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben te karakteriseren. Deze techniek ondersteunt duurzaam afvalbeheer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Jim McMurray bedanken voor het leveren van de zwarte liquor en Dr. David Tilotta en August Meng voor hun hulp met GC-MS. Ondersteuning voor Stephanie L. Mathews werd verstrekt door een USDA National Needs Fellowship (toekenningsnummer 2010-38420-20399).

1. Verzameling van zwarte liquor en voorbereiding van zwarte liquor voor groeiculturen
<ol>
	<li>Verzamel een monster zwarte liquor uit de uitlaatklep bevestigd aan de kraftdigester in een steriele glazen fles en laat het afkoelen tot kamertemperatuur voordat u doorgaat met de volgende stappen. 
	Neutralisatie</li>
	<li>Voeg 100 ml zwarte liquor monster toe aan een 500 ml beker uitgerust met een roerlat.</li>
	<li>Plaats de beker op een roerplaat en pas de snelheid aan op medium.</li>
	<li>Voeg langzaam druppels fosforzuur toe tot de zwarte liquor viskeus wordt (viscositeit vergelijkbaar met glycerol).</li>
	<li>Aliquoteer alle zwarte liquor oplossing door het langzaam in 50 ml kegelbuizen te gieten en centrifugeer gedurende 30 min bij 9.300 x g.</li>
	<li>Plaats het supernatant in de beker en meet de pH met behulp van pH-testlinten. Het pellet van geprecipiteerd lignin kan worden weggegooid en behandeld als niet-gevaarlijk vast afval.</li>
	<li>Ga door met het toevoegen van fosforzuur en centrifugeer de oplossing totdat de pH-strips een neutrale pH van het supernatant aangeven. 
	Steriliseren</li>
	<li>Leidt de oplossing door een 0,22 µm filter om eventuele verontreinigende bacteriën te verwijderen en plaats de gefilterde oplossing in een steriele container voor opslag. Bewaar bij kamertemperatuur.</li>
</ol>
2. Lignocellulose Extractie
Koolhydraat Separatie
<ol>
	<li>Plaats 5 g switchgrass, dennen of Bermuda gras (gemalen tot 1 mm of kleinere deeltjesgrootte) in een 500 ml Erlenmeyer kolf. Voeg vervolgens 200 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water, 7,5 g NaClO2, 2,5 ml glazuur azijnzuur en een roerlat toe aan de kolf.</li>
	<li>Plaats de kolf in een oliebaad geplaatst op een roerplaat bij 80 °C gedurende 1 uur. Pas de snelheid van de roerplaat aan op medium.</li>
	<li>Voeg een extra 7,5 g NaClO2 en 2,5 ml glazuur azijnzuur toe aan de kolf. Blijf roeren bij 80 °C in het oliebaad gedurende 30 min.</li>
	<li>Herhaal de vorige stap 2x (Opmerking: een totaal van 30 g NaClO2 en 10 ml glazuur azijnzuur wordt toegevoegd aan de kolf met de lignocellulose biomassa). Koel de oplossing af tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats een blad filterpapier in een Büchner trechter. Plaats de trechter bovenop een zijarmkolf en bevestig deze aan een vacuüm.</li>
	<li>Giet de oplossing langzaam in de trechter.</li>
	<li>Was het vaste materiaal 3x met 100 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water. Gooi het filtraat weg na het wassen van het vaste materiaal.</li>
	<li>Reserveer 1 g van het vaste materiaal en plaats het op een schoon blad filterpapier.</li>
	<li>Droog dit vaste materiaal een nacht in een 50 °C oven. Nadat u de steekproef uit de oven hebt gehaald, plaats deze in een opslagviaal gelabeld ‘holocellulose’.</li>
	<li>Voeg het resterende vaste materiaal toe aan 250 ml van 10% NaOH (v/v) in een 500 ml Erlenmeyer kolf. Sluit de kolf met een stop.</li>
	<li>Plaats de oplossing in een incubator bij 70 °C gedurende 1 uur schudden bij 250 rpm.</li>
	<li>Koel de oplossing gedurende 30 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het vaste materiaal met behulp van filterpapier en een Büchner trechter bevestigd aan een zijarmkolf.</li>
	<li>Breng het vaste materiaal op een schone blad filterpapier over naar een 50 °C oven en laat het een nacht drogen.</li>
	<li>Nadat het residu is opgedroogd, plaats het in een opslagviaal en label het ‘cellulose’.</li>
	<li>Breng het filtraat van stap 2.13 over naar een 500 ml Erlenmeyer kolf en voeg 30 ml azijnzuur en 250 ml isopropyl alcohol toe. Sluit de kolf en plaats de oplossing op de werkbank gedurende ten minste 8 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Breng alle oplossing over naar 50 ml kegelbuizen en centrifugeer de oplossing gedurende 30 min bij 9.300 x g. Pipet de oplossing voorzichtig uit de kegelbuis en gooi weg.</li>
	<li>Resuspendeer het pellet in 30 ml gedistilleerd of gedeïoniseerd water door te vortexen.</li>
	<li>Herhaal stappen 2.17-2.18 15x om het pellet grondig te wassen.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en bewaar het pellet voor vriesdrogen. Eenmaal vriesgedroogd, verzamel het monster en plaats het in een viaal gelabeld ‘hemicellulose’. 
	Lignine scheiding 
	Lignine scheiding protocol gebaseerd op Karaaslan et al.12</li>
	<li>Voeg 5 g switchgrass, dennen of Bermuda gras (gemalen tot 1 mm of kleinere deeltjesgrootte) toe aan 500 ml van een oplossing van 0,25 M NaOH en 30% ethanol. Plaats de suspensie in een incubator bij 75 °C met schudden bij 250 rpm gedurende 2 uur.</li>
	<li>Koel de oplossing af tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaats een blad filterpapier in een Büchner trechter bovenop een zijarmkolf. Bevestig aan een vacuüm en giet de oplossing langzaam in de trechter.</li>
	<li>Gooi het vaste materiaal weg.</li>
	<li>Voeg een roerlat toe aan de kolf met het filtraat en plaats de kolf bovenop een roerplaat ingesteld op medium snelheid. Voeg druppelsgewijs geconcentreerd zoutzuur toe aan de oplossing totdat een pH van 2,0 wordt verk

<ol><li>Tejado, A., Pena, C., Labidi, J., Echeverria, J. M., Mondragon, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physico-chemical+characterization+of+lignin+from+different+sources+for+use+in+phenol-formaldehyde+resin+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Physico-chemical characterization of lignin from different sources for use in phenol-formaldehyde resin synthesis.</a> Bioresource Technol. 98, 1655-1663 (2007).</li>
<li>Brannvall, E. Overview of pulp and paper processes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrannvall%2C+E+%22Pulp+and+paper+chemistry+and+technology%22">Pulp and paper chemistry and technology</a>. Elk, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 1-12 (2009).</li>
<li>Biermann, C. J. Pulping fundamentals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiermann%2C+CJ+%22Handbook+of+pulping+and+papermaking%22">Handbook of pulping and papermaking</a>. , 2nd edition, Academic Press INC. 55-100 (1996).</li>
<li>Sjöström, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSj%C3%B6str%C3%B6m%2C+E+%22Wood+chemistry%3A+fundamentals+and+applications%22">Wood chemistry: fundamentals and applications</a>. , 2nd, San Deigo Academic Press. (1924).</li>
<li>Philbrook, A., Alissandratos, A., Easton, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+processes+for+generating+fuels+and+commodity+chemicals+from+lignocellulosic+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biochemical processes for generating fuels and commodity chemicals from lignocellulosic biomass.</a> Environ. Biotechnol. , 39-63 (2013).</li>
<li>Sanchez, R., Ferrer, A., Serrano, L., Toledano, A., Labidi, J., Rodriguez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperaloafunifera+as+a+raw+material+for+integral+utilization+of+its+components%5BTitle%5D)+AND+%22BioResources%22%5BJournal%5D)">Hesperaloafunifera as a raw material for integral utilization of its components.</a> BioResources. 6 (1), 3-21 (2011).</li>
<li>Font, X., Caminal, G., Gabarrel, X., Romero, S., Vicent, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+liquor+detoxification+by+laccase+of+Trametesversicolorpellets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chemical+Tech.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Black liquor detoxification by laccase of Trametesversicolorpellets.</a> J. Chemical Tech. Biotech. 78, 548-554 (2003).</li>
<li>Zimmerman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+lignin+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Degradation of lignin by bacteria.</a> J. Biotechnol. 13, 119-130 (1990).</li>
<li>Ahamad, M., Taylor, C. R., Pink, D., Burton, K., Eastwood, D., Bending, G. R., Bugg, T. D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+assay+for+lignin+degradation%3A+comparative+analysis+of+bacterial+and+fungal+lignin+degraders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Development of novel assay for lignin degradation: comparative analysis of bacterial and fungal lignin degraders.</a> Mol. Biosystems. 6, 815-821 (2010).</li>
<li>Ramchandra, M., Crawford, D. L., Hertel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extracellular+lignin+peroxidase+of+the+lignocellulolyticactinomycete+Streptomyces+viridosporus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micro%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extracellular lignin peroxidase of the lignocellulolyticactinomycete Streptomyces viridosporus.</a> Appl. Environ. Micro. 54, 3057-3063 (1988).</li>
<li>Mishra, M., Thakur, I. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMishra%2C+M+%22Microorganisms+in+environmental+management%3A+microbes+and+the+environment%22">Microorganisms in environmental management: microbes and the environment</a>. Satyanarayana, T., Johri, B. N., Prakash, A. , Springer. (2012).</li>
<li>Karaaslan, A. M., Tshabalala, M. A., Wood Bushcle-Diller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hemicellulose+chitosan-based+semi-interpenetrating+network+hydrogels%3A+mechanical%2C+swelling+and+controlled+drug+release+properties%5BTitle%5D)+AND+%22BioResources%22%5BJournal%5D)">hemicellulose chitosan-based semi-interpenetrating network hydrogels: mechanical, swelling and controlled drug release properties.</a> BioResources. 5 (2), 1036-1054 (2010).</li>
<li>Lech, K., Brent, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLech%2C+K+%22Short+protocols+in+molecular+biology%22">Short protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Kevin, S. , 2nd, John Wiley & Sons. (1992).</li>
<li>Raj, A., Krishna Reddy, M. M., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+low+molecular+weight+aromatic+compounds+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+%28GC-MS%29+from+kraft+lignin+degradation+by+three+Bacillus+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Biodeterior.+Biodegradation%22%5BJournal%5D)">Identification of low molecular weight aromatic compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) from kraft lignin degradation by three Bacillus sp.</a> Int. Biodeterior. Biodegradation. 59, 292-296 (2007).</li>
<li>Chandra, R., Raj, A., Purohit, H. J., Kapley, A. Biodegradation of kraft lignin by three pure and mixed aerobic bacterial cultures isolated from pulp and paper sludge. Proceeding of the 25th international symposium on toxicology environmental and occupational health, , (2005).</li>
<li>Chen, Y., Chai, L., Tang, C., Yang, Z., Zheng, Y., Shi, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kraft+lignin+biodegradation+by+Novosphingobium+sp.+B-7+and+analysis+of+the+degradation+process%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Kraft lignin biodegradation by Novosphingobium sp. B-7 and analysis of the degradation process.</a> Bioresource Technol. 123, 682-685 (2012).</li>
<li>Bandounas, L., Wierckx, N. J., de Winde, J. H., Ruijssenaars, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+novel+bacterial+strains+exhibiting+ligninolytic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of novel bacterial strains exhibiting ligninolytic potential.</a> BMC Biotechnol. 11 (94), (2011).</li>
<li>Chandra, R., Abhishek, A., Sankhwar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+decolorization+and+detoxification+of+black+liquor+from+rayon+grade+pulp+manufacturing+industry+and+detection+of+their+metabolic+products%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Bacterial decolorization and detoxification of black liquor from rayon grade pulp manufacturing industry and detection of their metabolic products.</a> Bioresource Technol. 102, 6429-6436 (2011).</li>
<li>Gellerdtedt, G. Chemistry of Bleaching of Chemical Pulp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGellerdtedt%2C+G+%22Pulp+and+Paper+Chemistry+and+Technology%22">Pulp and Paper Chemistry and Technology</a>. Ek, M., Gellerstedt, G., Henriksson, G. 2, De Gruyter. 201-237 (2009).</li>
<li>Kringstad, K. P., Lindstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spent+liquors+from+pulp+bleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Spent liquors from pulp bleaching.</a> Environ. Sci. Tech. 18, 236-247 (1984).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit protocol beschrijft een combinatie van technieken die beogen micro-organismen te identificeren die pulpafval kunnen afbreken, de koolstofbronnen die worden gebruikt tijdens groei op pulpafval, en de microbiële metabolische producten die worden geproduceerd wanneer ze worden gekweekt op pulpafval. We hebben het succes van dit protocol aangetoond met de microbiële omgevingsisolaat: een facultatief anaëroob dat kan groeien op 10% zwarte liquor en de componenten van de lignocellulose-extractie als enige koolstofbronnen v...

Het pulpen van hout is een chemisch intensief proces dat gedurende vele jaren is geoptimaliseerd om een systeem met minimale afval te creëren. Sommige uitkomsten van dit proces kunnen echter worden gebruikt om producten met een hogere waarde te produceren. Zwarte liquor is een voorbeeld hiervan. Het wordt gegenereerd door het kraftproces, de dominante methode voor chemische pulping, die 85% van de wereldwijde lignineproductie vertegenwoordigt1. Het kraftproces (Figuur 1) gebruikt temperatuur (160-200 °C), druk (120 psig) en de chemicaliën in witte liquor (natriumhydroxide en natriumsulfide) om de lignine uit de houtvezels op te lossen2,3. Zwarte liquor bevat lignine, organische zuren en polysacharide-afbraakbijproducten4. Het wordt verbrand om stoom te produceren en chemicaliën terug te winnen in de terugwinningsketel die thermische energie levert voor downstream papier- en pulpproductieprocessen. Het volume zwarte liquor dat wordt gegenereerd door het pulpen, kan de hoeveelheid overschrijden die de terugwinningsketel effectief kan verwerken. Het lozen van de zwarte liquor als effluent heeft een negatieve invloed op aquatische flora en fauna en is dus geen optie. Toepassing van microbiële organismen die zwarte liquor voor groei kunnen gebruiken, zou voordelig zijn in termen van verhoging van chemische terugwinning en de generatie van waardetoegevoegde producten die de algehele levenscyclusanalyse van het pulpingsysteem zou verbeteren. Chemische en biologische omzetting van lignine-afgeleide monomeren heeft met succes vanilline en kaneelzuur geproduceerd voor gebruik als zoetstoffen en geuradditieven, fenol dat wordt gebruikt voor kunststof en harsen, en cyclohexaan, dat kan worden gebruikt als brandstof5.
Eerder onderzoek naar de biodegradatie van dit pulpafval was gericht op lignine depolymerisatie. Het International Lignin Institute (ILI) meldt dat er jaarlijks tussen de 40 en 50 miljoen ton lignine wordt geproduceerd (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php). Slechts 1,5% van die lignine wordt gebruikt voor commerciële industriële processen6. Lignine depolymerisatie door laccase en peroxidase-enzymen geproduceerd door witrot-zwammen van de Phanerochaete en Trametes-geslachten is uitgebreid bestudeerd7. Bodembacteriën die bekend staan om het afbreken van aromatische verbindingen zoals Nocardia en Rhodococcus8, Pseudomonas putida mt-29 en Streptomyces viridosporus T7A10 zijn ook gebleken capabel te zijn in lignine-afbraak. Bacteriële afbraak van pulpafval is veelbelovend omdat sommige bacteriën kunnen gedijen in de zoute en alkalische (pH 10-14) omstandigheden die kenmerkend zijn voor de pulpafval-effluenten11. Terwijl lignine het belangrijkste bestanddeel van zwarte liquor is, kunnen micro-organismen ook de andere componenten die zwarte liquor vormen, afbreken. Deze technieken identificeren niet uitsluitend lignine-afbrekende micro-organismen, maar dienen om micro-organismen te identificeren die direct kunnen worden toegepast op de zwarte liquor van pulpafval in plaats van op de verder verwerkte bestanddelen.
Zwarte liquor werd verzameld en aangepast voor microbieel groei door neutralisatie en filter-sterilisatie. Groeivereisten voor micro-organismen werden geïdentificeerd voor een omgevingsmicrobiologisch isolaat door minimale mediagroei-experimenten op lignocellulose-componenten geproduceerd door een nieuw lignocellulose-extractieprotocol. Groeimedia werden geanalyseerd door gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) om de metabolische producten van het omgevingsmicrobiologisch isolaat te bepalen wanneer het werd gekweekt op zwarte liquor als enige koolstofbron. De combinatie van deze technieken biedt een beoordelingsinstrument om de metabolische capaciteit van een micro-organisme te bepalen wanneer het wordt gekweekt op pulpfabrieksafval zoals zwarte liquor. Het gebruik van dergelijke technieken biedt ook inzicht in de waarde van de toepassing van specifieke micro-organismen op pulpfabrieksafval voor de generatie van bijproducten.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxaan (gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher</td><td>D111</td><td>Ontvlambaar, vooroxidatie chemisch product</td></tr><tr><td>Black Liquor</td><td>Department of Forest Biomaterials at North Carolina State University</td><td>N/A</td><td>pH 12.72, 13,67% vaste stof</td></tr><tr><td>Ethanol (microbiologiekwaliteit)</td><td>Fisher</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetaat (ACS reagenskwaliteit)</td><td>EMD</td><td>EX0240-9</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Glazuur acetic acid (gecertificeerd ACS)</td><td>EMD</td><td>AX0073</td><td>Corrosief</td></tr><tr><td>Guaiacol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1136</td><td>Schadelijk bij inname, corrosief</td></tr><tr><td>HP-5 capillaire kolom</td><td>Agilent</td><td>19091J-577</td><td>60 m x 0,18 mm binnendiameter, 0,18 &mu;m dikte</td></tr><tr><td>Zoutzuur (gecertificeerd ACS)</td><td>EMD</td><td>HX0603P</td><td></td></tr><tr><td>N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoraceetamide met trimethylchloorsilane 99:1% (BSTFA)</td><td>Fluka</td><td>15238</td><td>Ontvlambaar, veroorzaakt huidbrandwonden en oogbeschadiging bij contact</td></tr><tr><td>Na2SO4 (FCC kwaliteit)</td><td>VWR</td><td>BDH8026</td><td></td></tr><tr><td>NaClO2 (80%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244155</td><td>Ontvlambaar, toxisch&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH (gecertificeerd ACS)</td><td>EMD</td><td>1.06498.1000</td><td>Corrosief</td></tr><tr><td>Alkacid pH test linten</td><td>Fisher</td><td>A979</td><td></td></tr><tr><td>Fosforzuur (gecertificeerd ACS)</td><td>Fisher</td><td>A242</td><td></td></tr><tr><td>Polaris Q massaspectrometer&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridien (99%)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12005</td><td>Ontvlambaar, toxisch bij contact met de huid</td></tr><tr><td>Switchgrass</td><td>Cherry Research Farm Goldsboro, NC</td><td>N/A</td><td>Geoogst augustus 2011</td></tr><tr><td>Thermo Finnigan trace gas chromatograaf</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman nr. 1 filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben

Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

Het kraftproces wordt toegepast op houtsnippers voor de scheiding van lignine van de polysacchariden binnen lignocellulose voor pulp die een hoogwaardig papier zal produceren. Zwarte liquor is een pulpafval dat wordt gegenereerd door het kraftproces en dat potentieel heeft voor downstream bioconversie. Echter, de recalcitrante aard van de lignocellulosebronnen, zijn chemische derivaten die het grootste deel van de beschikbare organische koolstof binnen zwarte liquor vormen, en de basische pH vormen uitdagingen voor microbiële biodegradatie van dit afvalmateriaal. Methoden voor het verzamelen en modificeren van zwarte liquor voor microbieel groei zijn gericht op het gebruik van dit pulpafval om de lignine, organische zuren en polysaccharide afbraakbijproducten om te zetten in waardevolle chemicaliën. De gepresenteerde lignocellulose-extractietechnieken bieden een reproduceerbare methode voor de bereiding van lignocellulose-groeisubstraten voor het begrijpen van de metabolische capaciteiten van gekweekte micro-organismen. Gebruik van gaschromatografie-massaspectrometrie maakt de identificatie en kwantificering mogelijk van de fermentatieproducten die resulteren uit de groei van micro-organismen op pulpafval. Deze methoden kunnen, wanneer ze samen worden gebruikt, de bepaling van de metabolische activiteit van micro-organismen vergemakkelijken met potentieel om fermentatieproducten te produceren die een grotere waarde zouden bieden aan het pulpsysteem en afvalwatervervuiling te verminderen, waardoor de potentiële winst van papiermolens toeneemt en aanvullende toepassingen voor zwarte liquor worden geboden.

Het verzamelen en modificeren van zwarte loog die wordt gegenereerd in het kraft-pulpingsproces (Figuur 1) maakt het mogelijk om dit pulpingsafval te gebruiken om de biologische afbreekbaarheid van een enkel bacterieel isolaat of een gemengde cultuur te bepalen. Figuur 2 toont de aerobe groei, gemeten via de optische dichtheid, van het microbiële milieu-isolaat gekweekt in alleen LB-medium en in LB-medium aangevuld met 10% geneutraliseerde zwarte loog. Deze resultaten geven aan dat deze ...

Industriële afvalstoffen kunnen worden verzameld en gemodificeerd om microbiële groei te analyseren. Technieken voor de extractie van lignocellulose leveren componenten om specifieke biologische afbraakcapaciteit te analyseren. Gaschromatografie-massaspectrometrie identificeert fermentatieproducten van micro-organismen die zijn gekweekt op pulpafval. Deze methoden bepalen het metabolische vermogen van micro-organismen om pulpafval af te breken.

Methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om het vermogen van een micro-organisme of consortia van micro-organismen te bepalen om het pulpafval zwarte loog te benutten voor groei, welke componenten van de zwarte loog voor deze groei worden gebruikt en welke producten ontstaan door het microbiële metabolisme van dit pulpafval. Dit wordt bereikt door het pulpafval zwarte loog te verzamelen en dit voor te bereiden voor gebruik als component van een kweekmedium. In een tweede stap worden lignocellulose-componenten geëxtraheerd, die worden gebruikt om de vereisten voor de koolstofbron van de micro-organismen te bepalen.Vervolgens worden media bereid, geïnoculeerd en geanalyseerd op microbiële groei om het vermogen van de micro-organismen om te groeien op zwarte loog en de componenten daarvan te bepalen. De resultaten tonen het gebruik van zwarte loog als enige koolstofbron voor groei en de synthese van metabolische producten door het microbiële milieu-isolaat, gebaseerd op de groei gevisualiseerd op minimale media agarplaten en via GCMS. We kregen aanvankelijk het idee voor deze methode tijdens een discussie over de mogelijkheid dat microben in staat zijn te groeien op pulpafvalproducten en dat we deze microben rechtstreeks uit een pulpfabriek zouden kunnen isoleren.Het belangrijkste voordeel van de zignal cellose-extractietechniek ten opzichte van huidige bestaande methoden, zoals bleken met natriumhydroxide, is dat bleken met natriumchloride een hoge en verhoogde zuiverheid biedt. Een visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Aangezien de stappen voor de preparatie van Theo cellulose- en GCMS-monsters moeilijk aan te leren zijn, wat te wijten is aan het aantal benodigde stappen en de noodzaak van visuele bepaling om de voltooiing van het proces te verifiëren.Deze methode kan niet alleen inzicht bieden in de microbiële afbraak van zwarte loog, maar kan ook worden toegepast op industriële afvalstromen die lignocellulosehoudende materialen bevatten, zoals gewasresten, bosresten en stedelijk vast afval. Om deze procedure te starten, wordt het monster zwarte loog via de afsluiter van de craft-digester opgevangen in een steriele glazen fles en afgekoeld tot kamertemperatuur voordat men overgaat naar de volgende stap. Voeg vervolgens 100 milliliters van het monster zwarte loog toe aan een bekerglas van 500 milliliter voorzien van een roerstaaf en roer het monster op gemiddelde snelheid.Neutraliseer de zwarte loog door fosforzuur druppelsgewijs toe te voegen totdat de vloeistof viskeus wordt. Verdeel vervolgens de zwarte loogoplossing over 50 milliliter conische buizen en centrifugeer de monsters bij 9.300 Gs gedurende 30 minuten. Om de koolhydraten te scheiden, plaatst u vijf gram switchgrass die is vermalen tot één millimeter of kleiner, samen met een roerstaf, in een 500 milliliter kolf.Voeg vervolgens 200 milliliters gedestilleerd water, 7,5 grams natriumchloriet en 2,5 milliliters glaciaal azijnzuur toe. Plaats de kolf gedurende één uur in een oliebad op een roerplaat bij 80 degrees Celsius. Voeg daarna nog eens 7,5 grams natriumchloride en 2,5 milliliters glaciaal azijnzuur toe aan de kolf.Blijf 30 minuten roeren bij 80 °C nadat de vorige stap twee keer is herhaald. Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Filtreer deze vervolgens onder vacuüm via een Büchnertrechter om het vaste materiaal te isoleren.Was het vaste materiaal drie keer met 100 milliliters gedestilleerd water. Verzamel vervolgens één gram van het vaste materiaal en plaats dit op een schoon vel filterpapier. Plaats het vaste materiaal bij 50 degrees Celsius om een nacht te drogen.Nadat het monster de volgende dag uit de oven is gehaald, wordt het overgebracht naar een bewaardisbuisje met het label 'hollow cell'. Voeg het resterende vaste materiaal toe aan een kolf van 500 milliliter met 250 milliliters van 10% natriumhydroxide en sluit de kolf af met de stop. Plaats de oplossing gedurende één uur in een incubator bij 70 °C onder schudden bij 250 RPM.Laat de oplossing vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Isoleer na 30 minuten het vaste materiaal via vacuümfiltratie met een Büchnertrechter. Zodra het vaste residu een nacht lang is gedroogd in een oven op 50 °C, wordt het geplaatst in een bewaarbuisje met het label cellulose. Overbreng het filtraat naar een kolf van 500 mL en voeg 30 mL azijnzuur en 250 mL isopropylalcohol toe; sluit de kolf af en laat de resulterende oplossing ten minste acht uur op het aanrecht staan bij kamertemperatuur.Breng na voltooiing de gehele oplossing over in conische buizen van 50 milliliter en centrifugeer het monster 30 minuten bij 9.300 Gs. Pipetteer na centrifugatie voorzichtig de oplossing uit de conische buizen en gooi deze weg. Was vervolgens de pellets met 30 milliliter gedestilleerd water door middel van vortexen en centrifugeer 30 minuten bij 9.300 Gs.Herhaal deze stap 15 keer om de pellet grondig te wassen. Verwijder na centrifugatie het supernatant om de pellet te isoleren voor vriesdrogen. Zodra het monster is gevriesdroogd, plaatst u het in een flacon met het label hemicellulose.Voeg voor de ligninescheiding vijf gram gemalen switchgrass van één millimeter of kleiner toe aan een 500 milliliter oplossing van 0,25 M natriumhydroxide en 30% ethanol. Plaats de suspensie in een incubator bij 75 °C met schudden op 250 RPM gedurende twee uur. Voeg na het filteren van de afgekoelde oplossing een roerstaafje toe aan de kolf en plaats deze op een roerplaat die is ingesteld op een gemiddelde snelheid.Voeg geconcentreerd zoutzuur druppelsgewijs toe aan het filtraat totdat een pH van 2 is bereikt. Laat de oplossing een nacht staan bij kamertemperatuur. Zodra de oplossing is overgebracht naar conische buizen van 50 milliliter, worden de monsters gecentrifugeerd bij 9 300 GS gedurende 30 minuten.Pipette na voltooiing de oplossing voorzichtig uit de conische buis en gooi deze weg. Was het pellet met 30 milliliters gedestilleerd water door middel van vortexen en centrifugeer gedurende 30 minuten bij 9, 300 Gs. Herhaal deze stap 15 keer om het pellet grondig te wassen.Verwijder na centrifugatie het supernatant om het pellet te isoleren voor vriesdrogen. Plaats het monster na het vriesdrogen in een flacon met het label lignine. Voeg 50 milliliter steriel M9-minimaal medium toe aan een steriele kolf van 125 milliliter.Voeg vervolgens 10% volume zwartloog toe aan het medium. Voeg voor de inoculatie 0,1% volume van een overnight bacteriële kweek toe aan het mengsel en incubeer de kweken bij 37 °C in een incubator met schudden bij 200 RPM. In de midden-logfase worden de bacteriën, na centrifugatie van de niet-geïnoculeerde en geïnoculeerde bacteriële kweken, met een spuit overgebracht naar een afgesloten steriel anaeroob serumflesje.Voeg na 450 uur groei 10 milliliter van elk supernatant toe aan afzonderlijke glazen reageerbuizen. Verzuur elk supernatant met geconcentreerd zoutzuur, druppelsgewijs toegevoegd, tot een pH van één tot twee. Voeg aan elk monster 30 milliliter ethylacetaat toe aan het supernatant.Nadat de reageerbuis is afgesloten, wordt de oplossing gemengd door de buis vier tot zes keer om te keren. Plaats vervolgens één tot twee gram watervrij natriumsulfaat in een schone glazen reageerbuis. Verzamel voorzichtig de bovenste organische laag door te pipetteren met de wegwerpburette van glas.Breng de organische fase over in de reageerbuis met het watervrije natriumsulfaat. Ontwater de organische fase over het watervrije natriumsulfaat door voorzichtig tegen de reageerbuis te tikken om de inhoud geleidelijk te mengen. Voeg kleine hoeveelheden watervrij natriumsulfaat toe en meng totdat er geen grote klonten meer aanwezig zijn.Filter vervolgens de oplossing onder vacuüm door een Büchnertrechter, breng de oplossing daarna over naar een indampkolf en damp het filtraat in met behulp van een rotatieverdamper. Plaats na afloop drie milligram van de residuen van de ethylacetaat-extractie in een amberkleurig chromatografiebuisje van twee milliliter. Los het residu op in 100 µL van één vier dioxane en 10 µL pyridine.Voeg vervolgens 50 µL van een B-S-T-F-A-oplossing met 1% trimethylchloride toe aan het vial. Plaats de oplossing 15 minuten lang in een incubator bij 60 °C onder schudding. Analyseer het monster via GCMS.Het verzamelen en modificeren van zwarte loog die wordt gegenereerd in het ambachtelijke pulpingsproces dient om dit pulpingafval te gebruiken voor het bepalen van het biodegradatievermogen van een enkel bacterieel isolaat of een gemengde cultuur. Hier wordt de aerobe groei getoond, gemeten via de optische dichtheid, van een omgevingsstam gekweekt in LB-medium en LB-medium aangevuld met 10% geneutraliseerde zwarte loog. Deze resultaten geven aan dat deze bacterie groeit in de aanwezigheid van zwarte loog.De groei van het milieu-isolaat in LB-medium is sneller dan wanneer het wordt gekweekt in de aanwezigheid van zwarte loog, maar de optische dichtheid begint na 62 uur af te nemen. Daarentegen blijft de optische dichtheid bij de groei van het microbiële milieu-isolaat in de aanwezigheid van zwarte loog toenemen tot na 230 uur groei. De groeicurve van het microbiële milieu-isolaat in de aanwezigheid van zwarte loog vertoont daarnaast een bifasische groei, wat suggereert dat de zwarte loog meer dan één koolstofbron bevat die door het microbiële milieu-isolaat kan worden gebruikt, en dat de bacterie een voorkeur vertoont voor de benutting van bepaalde nutriënten.Verdere experimenten zijn nodig om het vermogen vast te stellen om zwarte loog te gebruiken voor de groeibehoeften. Men kan ook de groei van een bacterie op niet geneutraliseerde zwarte loog bepalen of het effect van verhoogde concentraties zwarte loog op de groei bepalen. Na het aantonen van groei op zwarte loog kan men het gebruik van koolstofbronnen bepalen met behulp van groeiexperimenten in minimaal medium.Commerciële substraten die de componenten van lignocellulose vormen, kunnen worden gebruikt als koolstofbronnen in het minimale medium. Het hier gepresenteerde extractieprotocol voor LIGNOCELLULOSE dient als model voor het bepalen van de groeiveiten van de afgebeelde bacterie. Hier is de groei van het microbiële milieu-isolaat op M nine minimaal medium agar, aangevuld met elke component van de lignocellulose-extractie.De aanwezigheid van kolonies op de minimale media agarplaten duidt op het vermogen van het milieu-isolaat om holocellulose, cellulose, hemicellulose en lignine af te breken. Kolonies die aanwezig zijn op M9 minimale media kunnen wijzen op het vermogen van het milieu-isolaat om agar in plaats van de platen af te breken. Groeicurves op minimale media voor vloeibare culturen zouden ook gebruikt kunnen worden om de specifieke groeisnelheid op elke lignocellulosefractie te bepalen, zodat agar, wat een potentiële koolstofbron zou kunnen zijn, niet toegevoegd hoeft te worden.De analyse van geëxtraheerde en gederiveerde bacteriële culturen via GCMS onthult de geproduceerde metabolieten. Hier worden het GCMS-spectrum van TMS-derivaten in het niet-geïnoculeerde monster en het spectrum van TMS-derivaten geproduceerd door het microbiële milieu-isolaat bij anaerobe groei in M9-minimaal medium met 10% niet-geneutraliseerde zwarte loog getoond. Vergelijking van de twee spectra onthult verschillen in de aanwezige componenten in het medium, wat wijst op de aanwezigheid van fermentatieproducten en de degradatie van componenten uit de zwarte loog.In het geïnoculeerde monster verscheen een piek met een retentietijd van 39,34 minuten. Een piek met een retentietijd van 21,84 minuten nam toe in het geïnoculeerde monster. Een piek met een retentietijd van 25,79 nam af in het geïnoculeerde monster.Het hier getoonde spectrum is dat van de guac-standaard, die is gebruikt om de piek met een retentietijd van 25,79 minuten te identificeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u kunt bepalen of een micro-organisme of een consortium van micro-organismen zwarte loog kan afbreken. Bovendien kunt u, door dit protocol te volgen, andere methoden gebruiken, zoals groeicurves, om aanvullende vragen te beantwoorden over de groeisnelheid van een micro-organisme of micro-organismen bij verschillende concentraties zwarte loog of lignocellulose-extractcomponenten.

methods-for-facilitating-microbial-growth-on-pulp-mill-waste-streams

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Methoden voor het vergemakkelijken van microbiële groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben

Source: Villela, H. D. M., et al. Prospecting Microbial Strains for Bioremediation and Probiotics Development for Metaorganism Research and Preservation. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the isolation of pollutant-degrading marine bacteria through serial dilution, colony selection, and growth in EE2-containing medium. By using EE2 as the sole carbon source, the protocol identifies bacterial strains capable of metabolizing this environmental pollutant.

Screening Marine Bacteria for the Isolation of Pollutant-Degrading Strains

Plastic folies label "biologisch afbreekbaar" zijn commercieel beschikbaar voor gebruik in de landbouw als mulch. Grondbewerking vertegenwoordigt een aantrekkelijke verwijdering methode, maar degradatie onder veldomstandigheden wordt slecht begrepen. Het doel van deze studie was werkwijzen voor het isoleren van natieve bodemschimmels en bacteriën die plastic mulch films koloniseren na grafveld ontwikkelen.

Isolatie van de Native Soil Micro-organismen met Potentieel voor Breaking Down Biologisch afbreekbaar plastic mulch films gebruikt in de landbouw

Chronoamperometrische groei van anodisch elektroactieve microbiële biofilms in een fed-batch reactor met behulp van een drie-elektrode opstelling, gecontroleerd door een potentiostaat, wordt gedemonstreerd. De extracellulaire elektronenoverdracht wordt gekenmerkt door middel van cyclische voltammetrie in de aanwezigheid van de elektronendonor en in de afwezigheid van de elektronendonor. Fundamentele data-analyse wordt gedemonstreerd.

Afvalwater Afgeleide Elektroactieve Microbiële Biofilms: Groei, Onderhoud en Basis Karakterisering

Een hele cel bioreporter test met Burkholderia sartisoli RP037-mChe is ontwikkeld om fracties van een organische verontreiniging (dwz fluoreen-) beschikbaar voor bacteriële degradatie na actief transport door mycelium overbruggen met lucht gevulde poriën in een water onverzadigd modelsysteem detecteren.

A Whole Cell Bioreporter Aanpak Verkeer en biologische beschikbaarheid van organische stoffen te evalueren in Water Onverzadigde Systems

Biofilms hebben complexe interacties met hun omgeving. Om biofiel-omgevingsinteracties grondig te onderzoeken, presenteren we hier een reeks methoden om een heterogene chemische omgeving te creëren voor biofilmontwikkeling, om lokale stroomsnelheid te kwantificeren en om massatransport in en rond biofilmkolonies te analyseren.

Methoden voor het karakteriseren van de co-ontwikkeling van biofilm en Habitat Heterogeniteit

Een nieuw reactorontwerp, een zogenaamde bioreactor met hoge dichtheid (HDBR), wordt gepresenteerd voor het kweken en bestuderen van microbiële gemeenschappen met hoge dichtheid. Hier wordt de HDBR met succes toegepast in een fotobioreactor (PBR) configuratie voor de studie van stikstofmetabolisme door een gemengde algengemeenschap met hoge dichtheid.

A Novel Bioreactor voor High Density Teelt van Diverse microbiële gemeenschappen

Flow cytometrische analyse heeft waardevol voor het onderzoeken van zuivere culturen en controle van de microbiële Gemeenschap dynamiek bewezen. Wij presenteren drie uitgebreide werkstromen, van monsterneming tot data-analyse, voor zuivere culturen en complexe gemeenschappen in duidelijke medium zoals in uitdagende matrices, respectievelijk.

Wezenlijke Microbiome Dynamics – Stroom Cytometry gebaseerd werkstromen van reinculturen aan natuurlijke gemeenschappen

Vervuiling beïnvloedt alle biomes. Mariene omgevingen zijn vooral getroffen, vooral koraalriffen, een van de meest gevoelige ecosystemen op aarde. Bioremediation is de capaciteit van organismen om verontreinigingen te degraderen. Hier beschrijven we methodologieën te isoleren en te testen microben presenteren bioremediatie vermogen en potentiële probiotische kenmerken voor koralen.

Prospectie van microbiële stammen voor bioremediatie en probiotica ontwikkeling voor Metaorganisme onderzoek en conservering

Hier presenteren we een protocol voor het screenen van bodembiodiversiteit om te zoeken naar schimmelstammen die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen. Ten eerste worden schimmelstammen die kunnen groeien op humuszuren of lignocellulose geïsoleerd. Hun activiteit wordt vervolgens getest, zowel in enzymatische assays als op verontreinigende stoffen zoals koolwaterstoffen en kunststoffen.

Isolatie en screening van bodembiodiversiteit voor schimmels die betrokken zijn bij de afbraak van recalcitrante materialen

Dit protocol beschrijft de assemblage van mini-bioreactorarrays die moeten worden gebruikt voor continue stroomcultuur van complexe fecale gemeenschappen onder anaërobe omstandigheden. We bespreken ook de methoden voor assemblage, inoculatie en bemonstering van de reactoren voor verdere analyse.

Bioreactorassemblage voor continue cultuur van complexe fecale gemeenschappen

Leer methoden om microbiële groei op zwavelloog uit pulpmolens te faciliteren en het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben te karakteriseren. Deze techniek ondersteunt duurzaam afvalbeheer.

Methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben (Video) | JoVE Journal

Methoden voor het vergemakkelijken van microbieel groei op afvalstromen van pulpmolens en karakterisering van het biodegradatiepotentieel van gekweekte microben

Meer video's verkennen