Name: Histochemische kleuring van Arabidopsis thaliana Secundaire celwand Elements (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer histochemische kleuringstechnieken voor secundaire celwanden in Arabidopsis thaliana stengels. Deze methode omvat inbedden, snijden en kleuren met verschillende reagentia voor microscopische analyse van celwandcompositie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar voor Sabin Russell te bewerken hulp. Dit werk maakte deel uit van de DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Science, Bureau van biologische en milieu-onderzoek, door middel van contractonderzoek DE-AC02-05CH11231 tussen Lawrence Berkeley National Laboratory en het Amerikaanse ministerie van Energie.

1. Stem Embedding <ol><li> Maak een 7% agarose-oplossing in water (7 g elektroforese-grade agarose in 100 ml gedestilleerd water). De agar autoclaaf gedurende 20 minuten of door de magnetron gedurende 20 minuten bij laagste intensiteit (bijvoorbeeld 10% intensiteit van een 1250 watt magnetron). </li><li> Bereid een zelfgemaakte mal voor het inbedden van de stelen met behulp van plastic flesjes. <ol><li> Met behulp van een scheermesje, afgesneden van de conische bodem van 2 ml met schroefdop microcentrifugebuis (deel A). Met een injectienaald, prik een gat in de buis dop iets groter dan de diameter van de steel worden ingebed. Vervolgens cut 0,5 cm van de bodem van een 0,6 ml microcentrifugebuis (deel B). </li><li> Voeg de cut-off van 0,5 cm deel van de 0,6 ml microcentrifugebuis in de voorgesneden 2 ml microcentrifugebuis. Dicht de twee delen met Parafilm (figuur 1). OPMERKING: De onderkant van de buis wordt gesneden om de verwijdering van de ingebedde monster vergemakkelijken nadat de agarose is gestold. Thij gat in de dop zal helpen bij het houden van de stam stabiel als de stam is ingebed in agarose. De schimmel zal dienen om de agarose te houden en houd de stam recht bij het inbedden. De Parafilm houdt de beide delen A en B, totdat de agarose is ingesteld en de steel is ingebed. </li><li> Met behulp van een scheermesje, snijd een deel voort uit het gebied van belang, (bijv. midden van de eerste stam internodium). OPMERKING: Idealiter zou de stengel vlak voor inbedding vernietiging te voorkomen door dehydratatie worden gesneden. Alternatief kan de steel tijdelijk opgeslagen in een plaat met een filterpapier bevochtigd met water. Deze plaat kan op ijs tot klaar om te worden ingebed weefsel uitdroging en vervorming te voorkomen worden geplaatst. Opslag van de steel voor een periode langer dan 30 minuten zonder hoge vochtigheid zal de steel te drogen. </li></ol></li><li> Smelt de agarose in de magnetron op lage intensiteit. LET OP: De fles met agarose kan heet zijn. Gebruik een mitt te halen de fles. Laat de gesmolten agarose stand bij kamertemperatuur (tussen 20 ° C en 25 ° C) tot het afkoelt tot ongeveer 50 ° C. </li><li> Langzaam pipet 5 ml van de agar in de premade plastic mal om het flesje te vullen. OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de mallen. Luchtbellen lacunes leiden in de agarose mal en zal niet volledig bedekken de stam steekproef, die uiteindelijk zal leiden tot ongelijke snijden van het monster secties. <ol><li> Laat de agarose afkoelen 30-60 sec tot halfvaste geworden. Test met een kleine tandenstoker, om ervoor te zorgen dat het kan binnendringen en opstaan, maar niet zweven, in de agarose. OPMERKING: Als de stam wordt geplaatst wanneer de agarose nog warm is zal het monster beschadigen door verschrompeling van de stam, het vernietigen van de cel morfologie. </li><li> Plaats de steel in deze agarose-vial. Zorg ervoor dat de steel blijft recht. Plaats de geperforeerde dop zodanig dat het uiteinde van de steel wordt gehouden door de kap. Draai niet aan de schroefdop. Soms meer dan een stam (van een enkele soort) kan embe zijndded in een enkele flacon; maar in dat specifieke geval geen gebruik maken van de dop. OPMERKING: Als de schroefdop is ingeschakeld, zal de stam krijgen twisted. </li></ol></li><li> Laat het flesje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 min, totdat het stolt. </li><li> Verwijder de mal door het voorzichtig uit de buis te schuiven. Open de Parafilm. Duw de onderkant van deel B van de mal voorzichtig met duim om de gestolde agarose bevrijden van deel A op een glazen objectglaasje. </li><li> Snij de agarose ingebed stam in drie ongeveer gelijke stukken van 1,2 cm. Knip het deel van de stengel die niet in de agarose en gooi deze weg. <ol><li> Bewaar deze stukken van agarose met de embedded stengels in luchtdichte 2 ml microcentrifugebuizen in een donkere doos bij 4 ° C tot gebruik sectie. Ook bewaart de buizen bij 4 ° C gedurende maximaal een week. OPMERKING: Opslag is mogelijk, maar de onderzoeker moet zich bewust zijn dat de ingebedde stengels zijn nog in leven en, afhankelijk van het experiment, Artefacten zou kunnen worden ingevoerd. </li></ol></li></ol> 2. Stem Sectioning <ol><li> LET OP: Lees de vibratome zorgvuldig en volg alle veiligheidsinstructies. </li><li> Zorg ervoor dat het monster schijf schoon en volledig droog (vrij van vaste of vloeibare). Maak de objectplaatje met een scheermesje om eventuele lijmresten van eerdere experimenten te verwijderen en wassen met water. Dan droog met een papieren handdoek. OPMERKING: Dit zal ervoor zorgen dat de lijm werkt goed en bindt aan de agarose specimen. Als deze stap niet goed wordt uitgevoerd, is het mogelijk dat het monster niet kan voldoen aan de schijf en zal later leiden tot het monster af de schijf valt tijdens het snijden. <ol><li> Gebruik zacht papier doekjes om eventueel vocht uit de agarose blok met de exemplaren te verwijderen. </li><li> Breng een druppeltje weefselhechtmiddel op de objectplaatje. Streak uit de lijm het gebied in het midden van de plaat bedekken met de punt van de lijm fles. Snel plaatsde agarose blok zodat de specimens ofwel loodrecht op of parallel aan de plaat transversale en longitudinale doorsneden, respectievelijk. Laat de lijm het monster vast aan de objectplaatje bij kamertemperatuur of bij 4 ° C gedurende 10-30 minuten. OPMERKING: Dit is een tijd-gevoelige stap. </li></ol></li><li> Bevestig de objectplaatje op zijn plaats op de buffer lade of trog. Het blok / s agarose met de onderdelen dient tegelijk met het scheermesje. Vul het bufferbak met gedestilleerd water bij kamertemperatuur totdat de monsters volledig ondergedompeld. </li><li> Snijd een scheermesje in de helft en dan snijd de uiteinden met een stevige schaar, zodat het blad vlak blijft. Bevestig de helft van de voorgesneden scheermesje op de meshouder. <ol><li> Stel de hoek op de meshouder tot 84 °, de snelheid tot 0,90 mm / sec (positie 8 op de vibratome) en de frequentie tot 50 Hz (positie 5 op de vibratome). Maak doorsneden van 100 urn dik. Gebruik continue modus. NOTE: Deze dikte is geselecteerd om te verzekeren dat het weefsel de verschillende zuur en base behandelingen gebruikt in sommige van de kleuringsprotocollen kan weerstaan. Stel het venster voor het snijden en laat 15-20 minuten op een continue wijze voor de vibratome sectie een agarose blok van ongeveer 1,2 cm. </li></ol></li><li> Verzamel de secties met een wegwerp plastic pipet tijdens het snijden in de buffer lade. Als alternatief kan de secties worden overgedragen van de buffer lade in een glazen beker en vervolgens naar een duidelijke Petri plaat. Transfer paar secties om de 2,0 ml microcentrifugebuizen. Opmerking: De monsters zijn verzameld uit een Petri schaal omdat het gemakkelijker is om de onderwerpen op een heldere achtergrond zien, en omdat de bufferbak kan worden klaar voor het volgende monster. </li><li> De secties kunnen worden opgeslagen in een 50 ml buis of verzameld en opgeslagen in 1,5 tot 2 ml microcentrifuge buizen bij 4 ° C gedurende 30 tot 60 minuten. OPMERKING: Het opslaan van de secties voor langere perioden zullen resulteren in een slechte beeldkwaliteit. </li&gt; </ol> 3. Microscoop en Camera Setting for Imaging <ol><li> Pas de Koehler verlichting op de microscoop. Kies een doel. Focus op het model eerste. Breng de lichtintensiteit aan de helft of minder. Sluit het velddiafragma (FD) en diafragma (AP) of brengen de laagst mogelijke stand op die doelstelling. <ol><li> Hoe hoger de vergroting, hoe groter de ring zal zijn. Gebruik de condensor focalisatieknop om het veld iris zich zo sterk mogelijk te maken. </li><li> Langzaam breng het beeld van het veld iris (zeshoekige kleine ring) naar het centrum via de condensor-centrering knoppen (pin-vormige schroeven rondom de condensor). Verhoog langzaam het membraan (FD), zodanig dat het veld iris de rand bereikt. Stoppen met het verhogen van de FD net na het veld iris de rand is verstreken. </li><li> Verhoog langzaam het diafragma (AP) om het contrast aan te passen. Pas de lichtsterkte naar behoefte. OPMERKING: Koehler verlichting moet worden aangepast voor elke oOEL, elke experimentele dag. Noteer de nummers verkregen na correctie voor de dag. Deze nummers zullen worden hergebruikt elke keer dat de doelstellingen heen en weer worden geschakeld voor die bepaalde dag. </li></ol></li><li> Stel het diafragma, de intensiteit, belichtingstijd, gain, en filters zoals beschreven in Tabel 1. Deze informatie mag alleen worden gebruikt als een gids. </li><li> Gebruik een hoge resolutie digitale camera met een groot formaat interline CCD-chip zonder mechanische sluiter om de fluorescentie beelden vast te leggen; en een hoge-resolutie, high-speed camera voor bright-field beelden. </li><li> Verwerk de dia met standaardsoftware. Laad de software. Klik op &quot;Acquire&quot; en &quot;Set camera / board &#39;en selecteer de camera te gebruiken. Klik op &quot;OK.&quot; Klik op &quot;Ophalen&quot; gevolgd door &quot;tabblad Kleur.&quot; Under &quot;tab Color,&quot; kies &quot;Bayer methode&quot; gevolgd door &quot;Gemiddeld vier.&quot; Voeg de voorgestelde versterking (rood, groen, blauw) weerm. Tabel 1. Selecteer het tabblad &quot;Set opslaan&quot; en klik op de map waar afbeeldingen moeten worden opgeslagen. Stel &quot;Sluitertijd&quot; van de suggesties in Tabel 1. Stel &quot;Binning&quot; op &quot;1&quot; en &quot;Leef binning&quot; op &quot;1.&quot; Focus op het gebied van belang en klik op &quot;Opslaan levend.&quot; </li><li> De beelden op de camera software zijn in de &quot;TIF&quot; formaat. Analyseer de afbeeldingen voor orthopedie van de celtypen. Maken gebruik van standaard software voor downstreamgebruik van presentatie en publicatie. </li></ol> 4. Ultraviolet en bright-field imaging <ol><li> Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip gesneden zodat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een microscoopglaasje. Bedek de secties met een dekglas. Let op de secties onder UV-licht of bright-field verlichting. </li></ol> 5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) kleuring 12 <ol><li> Los 0,3 g floroglucinol in 10 ml absolute ethanol met 3% phloroglucinol te bereiden. Meng een deel geconcentreerd HCl (37 N) twee volumes 3% floroglucinol in ethanol; deze oplossing floroglucinol-HCl (Ph-HCl) of Wiesner vlek. OPMERKING: Deze oplossing is vers gemaakt worden op de dag van de kleuring en kan niet worden opgeslagen, omdat de oplossing zal na verloop van tijd en de vlekken komen te vervallen. LET OP: HCl is zeer corrosief, dus heel voorzichtig tijdens het hanteren van de Ph-HCl vlek. </li><li> Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de Ph-HCl oplossing voor de buis met de secties en dop onmiddellijk omdat het HCl in de Ph-HCl vlek is zeer corrosief. Beweeg de buis om te verzekeren dat alle onderdelen zijn gekleurd. Een alternatief voor deze stap is het dopje open te houden zodat de Ph-HCl-oplossing op en neer kan worden gepipetteerd, bij voorkeur zonder de secgen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip, als deze die delen kunnen beschadigen. <ol><li> Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met dekglas. Let op de secties onder bright-field verlichting. OPMERKING: De Ph-HCl-oplossing droogt 5-10 minuten, waardoor een verslechtering van de specimens. Daarom is de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode. </li></ol></li></ol> 6. MAULE kleuring 13,14 <ol><li> Los 0,2 g kaliumpermanganaat in 40 ml gedestilleerd water tot een 0,5% kaliumpermanganaat oplossing te bereiden. Bewaren in een donkere fles bij kamertemperatuur gedurende maximaal 7 dagen. <ol><li> Bereid een 3,7% HCl-oplossing door toevoeging van 1 ml geconcentreerd HCl (37 N) 9 ml gedestilleerd water (01:10). Bereid een verse 3,7% HCl-oplossing op dedag van het experiment. Zorg ervoor dat de 37 N HCl stockoplossing wordt gebruikt is niet te oud. Geconcentreerd ammoniumhydroxide-oplossing (14,8 M) moeten worden bewaard bij 4 ° C te voorkomen dat de molariteit van de verzadigde oplossing van af. </li></ol></li><li> Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% kaliumpermanganaatoplossing de buis met de secties. <ol><li> Pipetteer de 0,5% kaliumpermanganaat-oplossing op en neer voorzichtig, bij voorkeur zonder de secties. Incubeer gedurende 2 minuten en herhaal het pipetteren. Laat de microcentrifugebuisje staan ​​totdat alle secties settelen. OPMERKING: Zorg dat u de onderdelen niet te pipet in de pipet tip als voor de afdelingen kan beschadigd raken. Het kan moeilijk zijn om de stengeldelen zien als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten. </li><li> Met behulp van een pipet 1 ml, trekken uit 700 pi van 0,5% kaliumpermanganaat oplossing.Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen kaliumpermanganaatoplossing. Herhaal dit 3-4x of tot de oplossing van water helder blijft. </li><li> Gooi het water. Voeg snel 1 ml 3% HCl tot de diepbruine kleur van de secties wordt afgevoerd. Dit kan gebeuren binnen 3-5 min dan 2 wasbeurten van 5 minuten elk vereist. Pipet alle 3% HCl-oplossing en meteen doorgaan naar de volgende stap. </li><li> Voeg 1 ml geconcentreerde ammonia. Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje. Bedek de secties met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting. LET OP: Omdat ammonium hydroxide is uiterst corrosief, het vereist extra zorg en aandacht om te voorkomen dat corrosie van het stadium van de microscoop of de lens. OPMERKING: De ammoniumhydroxide dampen kan het dekglaasje mist, waardoor het moeilijk is om het monster te observeren. Wees daarom extra voorzichtig voor het toevoegen van het dekglaasje. De oplossing droogt in 5-10 minuten, zodat de beeldvorming moet worden voltooid binnen die periode. </li></ol></li></ol> 7. Congo rood kleuring 11,15 <ol><li> Los 0,5 g congo in 100 ml gedestilleerd water tot een 0,5% Congo rood te bereiden. </li><li> Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van de 0,5% Congo rood-oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,5% congo rode oplossing op en neer zonder verstoring van de secties. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet. <ol><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en herhaal het pipetteren. Breng vervolgens nog 3 min incubatie bij kamertemperatuur. </li><li> Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 pi van 0,5% congo rode oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de congo rode oplossing. Herhaal het wassen 3-4x tot het sopis duidelijk. </li><li> Gebruik een pipet 1 ml met de punt gesneden zodanig dat de onderdelen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder schade. Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje, en bedek ze met een dekglaasje. Let op de monsters op de microscoop dia onder blauw licht excitatie met behulp van een filter met een bandpass van 560/40. OPMERKING: Raak de onderdelen in het water op te slaan voor lang voor de microscopische analyse, zoals het water de congo rode uitwasbaar zijn in 10-30 minuten. </li></ol></li></ol> 8. Calcofluor Wit kleuring 9 <ol><li> Los op 0,02 g van fluorescerende witmakers 28 (calcofluor wit M2R) in 10 ml gedestilleerd water tot een 0,2% stockoplossing te bereiden. De 0,2%-oplossing kan worden opgeslagen gedurende zes maanden in een donkere fles bij 4 ° C. Bereid een werkende oplossing van 0,02% door verdunning van de 0,2% stockoplossing 10x met gedestilleerd water. </li><li> Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. In de buis 1 ml van 0.02% calcofluor wit oplossing. Pipet voorzichtig de 0,02% calcofluor witte oplossing op en neer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet. <ol><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren. Incubeer de sectie nog 3 min bij kamertemperatuur geroerd. OPMERKING: Laat de secties om zich te vestigen op de bodem van de buis om het gemakkelijker maken om pipet uit de oplossing zonder beschadiging van de secties. </li><li> Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% calcofluor witte oplossing en voeg 700 ul van gedestilleerd water; wacht 5 min te spoelen de calcofluor witte oplossing. Herhaal het wassen 3-4x. Gebruik een pipet 1 ml met pipet tip cut op zodanige wijze dat de delen gemakkelijk kan worden gepipetteerd uit zonder schade. </li><li> Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder UV-licht. </li></ol></li></ol> 9. Toluidine Blue O kleuring 16,17 <ol><li> Los op 0,02 g toluïdineblauw O in gedestilleerd water tot 100 ml van een 0,02%-oplossing te bereiden. OPMERKING: De toluïdineblauw O oplossing kan worden bewaard gedurende twee weken in een donkere fles op kamertemperatuur. </li><li> Transfer stengeldelen een 2,0 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml van 0.02% toluïdine blauw O oplossing aan de buis. Pipet voorzichtig de 0,02% toluïdineblauw O oplossing op en neer. Vervolgens incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en herhaal het pipetteren keer. OPMERKING: Zorg dat u de secties in de pipet tip omdat dit de secties schade niet te pipet. Laat de microcentrifugebuisje stilstaan ​​totdat de secties settelen. Dit kan moeilijk zijn om te zien, als de oplossing is donker, dus houd de buis met de hoofdstukken over reageerbuis rek en laat ze gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. <ol><li> Gebruik een pipet 1 ml te trekken uit 700 ul van 0,02% toluïdineblauw O oplossing. Voeg 700 ul van gedistilleerd water te spoelen de toluïdineblauw O solution. Herhaal dit 3-4x of tot het waswater oplossing helder is. Gebruik een pipet 1 ml met de pipetpunt gesneden zodanig dat de delen gemakkelijk kunnen worden gepipetteerd zonder ze te beschadigen. </li><li> Voorzichtig pipet secties in de punt en op een objectglaasje en dek ze af met een dekglaasje. Let op de secties onder bright-field verlichting. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li>
<li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+biosynthesis+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li>
<li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rewriting+the+lignin+roadmap%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry%E2%80%94past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry—past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li>
<li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+histochemistry%3A+official+publication+of+the+Biological+Stain+Commission%22%5BJournal%5D)">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic & histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li>
<li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li>
<li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li>
<li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+technology%22%5BJournal%5D)">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li>
<li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence%3A+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li>
<li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li>
<li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloroglucinol+Stain+for+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li>
<li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakano%2C+J+%22The+Detection+of+Lignin+Methods+in+Lignin+Chemistry%22">The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry</a>. , Springer-Verlag. Berlin. (1992).</li>
<li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+the+study+of+plant+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+19th+Workshop%2FConference+of+the+Association+for+Biology+Laboratory+Education+%28ABLE%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li>
<li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li>
<li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+the+M%C3%A4ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">The mechanism of the Mäule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li>
<li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+biotechnology+journal%22%5BJournal%5D)">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li>
<li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li>
<li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li>
<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen financiële belangen bekend te maken.

A. thaliana stengeldelen worden veel gebruikt om de organisatie van de cellen in de secundaire celwand bestuderen en kwalitatief onderzoek van de verschillen tussen wildtype en transgene planten. De meest gebruikte technieken voor het snijden van de exemplaren zijn directe snijdend; of wanneer monsters zijn ingebed in agarose of fixeermiddel kan snijden worden gedaan met een vibratome of microtoom. In tegenstelling tot de hand snijden, de laatste twee mogelijk maken waardoor de kans op het produceren onnauwkeur...

De celwand fabriek heeft een overvloed aan informatie binnen de verschillende onderdelen: lignine, cellulose, hemicellulose (xylan, glucuronoxylan, xyloglucan, arabinoxylan, gemengde koppeling glucaan, of glucomannaan), en pectine. Histologische technieken bieden belangrijke visuele aanwijzingen in het bestuderen van verschillen binnen de secundaire celwanden op organisatorisch en cellulair niveau. Verschillende histologische technieken werden ontwikkeld en is te vinden in de literatuur, maar deze technieken kan uitdagend en tijdrovend zijn voor beginners omdat zeer gedetailleerde protocollen met eenvoudige visuele instructies zijn zelden of nooit beschikbaar. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voor de histologische kleuring technieken bieden om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen. Snijden de stengel is de eerste stap bij visualisatie van celwanden en celvormen. Hoewel met de hand gesneden secties zijn goedkoop en nemen minder tijd voor te bereiden, gebruik van een vibratome biedt consistentie enlevert beelden van hoge kwaliteit. Met een vibratome kan produceren betere kwaliteit van de gegevens door het genereren van gelijke delen met dezelfde dikte, die helpt om scherpe beelden te produceren en vermindert de kans op het produceren onnauwkeurige verschillen tussen de monsters die eenvoudig worden veroorzaakt door een slechte monstervoorbereiding. Harsen gebruiken om verse exemplaren vast te stellen kan een uitdaging voor beginners en kan nog steeds tijdrovend zijn, zelfs voor experts als een analyse moet snel worden gedaan. Bovendien wordt het onmogelijk om eventuele biologische activiteit te meten met het monster wanneer deze is ingebed in een hars. Een eenvoudige techniek die agarose en een zelfgemaakte mal werkzaam is nuttig voor het inbedden stam weefsels, en het kan ook worden gebruikt in andere toepassingen die dissectie van zacht weefsel. Vergeleken met inbedding specimens hars, heeft deze methode het voordeel dat de weefsels in leven en reducerende monsterbuffer manipulatie. Snijden weefsels via een vibratome is zeer nauwkeurig en genereert homogenlende secties, die, afhankelijk van het doel van de studie, dan kan worden gebruikt met verschillende kleuringen. De eenvoudigste methoden om lignine en andere aromaten visualiseren in dienst ultraviolet (UV) licht. Excitatie van aromatische gebaseerde moleculen met UV licht is een oude techniek, maar het is nog steeds een van de snelste benaderingen voor visualisatie van lignine. Echter, UV-visualisatie is eigenlijk niet ideaal voor lignine detectie omdat UV-licht andere aromaten zal prikkelen. Lignine bestaat voornamelijk uit drie bouwstenen, de monolignols (hydroxycinnamyl alcoholen: coniferylalcohol, sinapyl alcohol, en p-coumaryl alcohol) 1-3. Phloroglucinol vlek kan aanwijzingen geven de mate van cinnamaldehydes aanwezig in het xyleem, vezels, weefsels en trachea 4. Floroglucinol is een goede indicator van de algemene cinnamaldehydes en kan onderscheid maken tussen cinnamaldehydes en andere aromaten. De sinapyl alcohol monomeren kan worden gedetecteerden gedifferentieerd door het gebruik Maule vlek. Toluïdineblauw O is een polychromatische kleurstof en derhalve is de mogelijkheid om verschillende onderdelen van de celwand vlekken in verschillende kleuren 5,6. Het primaire gebruik van toluïdineblauw O is aan pectine en lignine 5,6 detecteren. Het voordeel van toluïdineblauw O is dat veel elementen van de celwand kan worden gevisualiseerd in een enkele stap. Zowel calcofluor witte en congorood gemakkelijk in gebruik en kunnen worden gebruikt om cellulose te visualiseren. Calcofluor witte vlekken cellulose, callose, en andere niet-gesubstitueerde of gesubstitueerde zwak β-glucanen 6-9, terwijl Congo rood vlekken direct β-(1 → 4)-glucanen en in het bijzonder cellulose 10,11. Het doel van deze studie is om eenvoudige richtlijnen voorzien in het gebruik van de hiervoor genoemde kleuring technieken om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen van A. thaliana stengels.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS-nummer: 9012-36-6</td></tr><tr><td>Phloroglucinol</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-trihydroxybenzeen [CAS-nummer: 108-73-6]</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS-nummer: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Ammoniak</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS-nummer: 1336-21-6</td></tr><tr><td>Toluidinblauw O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS-nummer 92-31-9]&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaliumpermanganaat</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS-nummer 7722-64-7&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol 190 proof</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS-nummer: 64-17-5</td></tr><tr><td>Congorood</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C6277</td><td>Disodium 3,3'-[[1,1'-biphenyl]-4,4'-diylbis(azo)]bis(4-aminonaftaleen 1-sulfonaat) [CAS-nummer 573-58-0]</td></tr><tr><td>Fluorescente ophelderaar 28/ Calcofluor White Stain</td><td>Sigma</td><td>F3543&nbsp;</td><td>4,4'-Bis[[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbeen-2,2'-disulfonzuur [CAS-nummer 4404-43-7]&nbsp;</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica Vibrating blade microtome VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr><tr><td>Veiligheidsscheermesje</td><td>American Safety razor company</td><td>Artikelnr. 60-0139-0000&nbsp;</td><td>Roestvrijstalen scheermesje met dubbele snede (Personna Super)</td></tr><tr><td>Schroefdop microcentrifugebuisjes (2 ml)</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes (0,6 ml)</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>Handschoen</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&nbsp; Hot Hand Protector Mitt</td></tr><tr><td>Weefselkleefstof</td><td>Ted Pella Inc</td><td>10033</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C of 20 &deg;C voor 3 maanden of langere opslag</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive&nbsp;</td></tr><tr><td>Camera met CCD-chip zonder mechanische sluiter&nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>Hoge snelheid kleurencamera&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Camerasoftware&nbsp;</td><td>&nbsp;Molecular Devices</td><td>MetaMorph versie 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalyse&nbsp;</td><td>Adobe&nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>Microdekglazen, vierkant, nr. 1</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8")-Dekglasjes zijn corrosiebestendig en uniform dik en vlak. Nr. 1 dikte is 0,13 tot 0,17 mm.</td></tr><tr><td>Mat microscoopglaasjes, 1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan packaging</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 Filter kubus</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>Filter gebruikt voor Congorood analyse met een band-pass van 560/40.</td></tr></tbody></table>

histochemische kleuring van<em&gt; arabidopsis thaliana</em&gt; secundaire celwand elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is een modelorganisme dat veel wordt gebruikt om verschillende cellulaire processen in planten te begrijpen en te manipuleren, en het is uitgebreid gebruikt in de studie van secundaire celwandvorming. De afzetting van de secundaire celwand vindt plaats nadat de primaire celwand is aangelegd, een proces dat uitsluitend wordt uitgevoerd door gespecialiseerde cellen zoals die weefsels vormen die vaten en vezels vormen. De meeste secundaire celwanden bestaan uit cellulose (40–50%), hemicellulose (25–30%) en lignine (20–30%). Er zijn verschillende mutaties geïsoleerd die de biosynthese van secundaire celwanden beïnvloeden, en de corresponderende mutanten kunnen al dan niet duidelijke biochemische samenstellingsveranderingen of visuele fenomenen vertonen, omdat deze mutaties kunnen worden gemaskeerd door compenserende reacties. Kleuringsprocedures zijn historisch gezien gebruikt om verschillen op cellulair niveau te tonen. Deze methoden zijn uitsluitend visuele analysemiddelen; niettemin is hun rol bij snelle en kritieke analyse van groot belang. Congorood en calcofluor wit zijn kleurstoffen die worden gebruikt om polysachariden te detecteren, terwijl Mäule en phloroglucinol worden vaak gebruikt om verschillen in lignine te bepalen, en toluidineblauw O wordt gebruikt om polysachariden en lignine differentieel te kleuren. De ogenschijnlijk eenvoudige technieken van sectioenering, kleuring en beeldvorming kunnen een uitdaging zijn voor beginners. Beginnend met de monstervoorbereiding met behulp van het A. thaliana model, beschrijft deze studie de protocollen van een verscheidenheid aan kleuringsmethodologieën die eenvoudig kunnen worden geïmplementeerd voor observatie van cel- en weefselorganisatie in secundaire celwanden van planten.

Stem Embedding en Snijden: Het gebruik van de zelfgemaakte plastic mal insluiten stelen in 7% agarose bleek gemakkelijk (figuur 1). De twee delen (A en B; figuur 1) van de embedded flacon systeem maken het eenvoudig om gemakkelijk de steel ingebed in agarose als de agarose plakt niet aan de flacon onderdelen die inert zijn los, waardoor het systeem schoon. De flesjes kan meerdere keren worden hergebruikt jaar. Het gemak van het opslaan van de ingebedde stam maakt de volgende stap...

De samenstelling van de plantencelwand varieert tussen weefselsoorten en kan lignine, cellulose, hemicellulosen en pectine omvatten. Er zijn verschillende kleuringstechnieken ontwikkeld om verschillen op celtypeniveau te visualiseren. Dit artikel is een samenstelling van veelgebruikte celwandkleuringstechnieken.

Histochemische kleuring van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Secundaire celwand Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Het algemene doel van deze procedure is om histochemische kleuring van de secundaire celwandelementen van Arabidopsis ANA aan te tonen. Dit wordt bereikt door de plantstengel eerst in aros in te bedden. Vervolgens wordt de in aros ingebedde stengel uit de mal gehaald en overgebracht naar specimen-schijven, die daarna met een vibrato in dwarsdoorsneden van de stengel worden gesneden.Vervolgens worden de coupes onderworpen aan diverse histochemische kleuringsprocedures. Ten slotte wordt microscopie gebruikt om de differentiële veranderingen in de elementen van de secundaire celwand, verkregen door de histochemische kleuring, aan te tonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de celwand, zoals veranderingen in maculaire weefsels in plantenstengels.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat eenvoudige maar cruciale stappen die in deze protocollen worden genoemd, voorheen niet grondig zijn gedocumenteerd of op een vereenvoudigde wijze zijn gepresenteerd. Begin met het maken van een zelfgemaakte mal voor het inkapselen van de stengels met behulp van plastic vials. Gebruik eerst een scheermesje om de conische bodem van een microcentrifugebuis van twee milliliter met schroefdop af te snijden.Dit onderdeel wordt aangeduid als deel A, met een gaatje in de dop van de buis dat is gemaakt met een injectienaald en iets groter is dan de diameter van de steel die moet worden ingebed. Snijd vervolgens een halve centimeter van de onderkant van een microcentrifugebuis van 0,6 milliliter af. Dit onderdeel wordt aangeduid als deel B. Voeg het afgesneden deel van een halve centimeter van de microcentrifugebuis van 0,6 milliliter toe aan de vooraf gesneden microcentrifugebuis van twee milliliter.Verzegel de twee delen met paraform. Snijd met een scheermesje een stengelsectie uit het gebied van belang en smelt een 7%aros-oplossing in de magnetron op lage intensiteit. Zodra de gesmolten aros is afgekoeld tot ongeveer 50 °C, pipetteer dan langzaam vijf milliliter van de agros in de vooraf gemaakte plastic mal om het flacon te vullen.Nadat het aros 30 tot 60 seconden is afgekoeld en een halfvaste consistentie heeft, plaatst u de stam in het met aeros gevulde vial. Plaats vervolgens de geperforeerde dop zodanig dat de dop de punt van de stam vasthoudt. Laat het vial 10 tot 30 minuten bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius staan tot het gestold is.Verwijder de mal door deze voorzichtig uit de buis te schuiven. Open de parafilm en druk met de duim voorzichtig op de bodem van deel B van de mal om het gestolde aros vanuit deel A op een glazen microscoopglas te laten vallen. Schuif deze weg.Snijd de in de aros ingebedde stengel in drie ongeveer gelijke stukken van 1,2 centimeter lang. Snijd het deel van de stengel dat zich niet in de aros bevond weg en gooi dit weg. Zorg ervoor dat de specimen-schijf schoon en volledig droog is.Gebruik zachte papieren doekjes om elk vocht te verwijderen van het aros-blok met de specimens. Breng een kleine druppel weefsellijm aan op de specimen-schijf. Plaats het aros-blok snel zodanig dat de specimens ofwel loodrecht op de plaat staan voor transversale dwarsdoorsneden, ofwel parallel aan de plaat.Laat bij longitudinale dwarsdoorsneden de lijm het monster op de monsterdisc fixeren bij kamertemperatuur of bij vier graden Celsius gedurende 10 tot 30 minuten. Fixeer de monsterdisc op de bufferlade of in het blok van aros, zodanig dat de secties parallel lopen aan het scheermesje. Vul de bufferlade met gedestilleerd water op kamertemperatuur totdat de monsters volledig zijn ondergedompeld.Snijd een scheermesje doormidden en trim vervolgens de uiteinden met een stevige schaar, zodat het mesje volledig vlak blijft. Bevestig één helft van het voorgesneden scheermesje aan de messenhouder. Stel de hoek op de messenhouder in op 84 graden, de snelheid op 0,90 millimeters per seconde en de frequentie op 50 hertz.Snijd de coupes tot een dikte van 100 micron met behulp van de continue modus. Verzamel de coupes tijdens het snijden in de bufferbak met een wegwerpplasticpipet. Breng enkele coupes over naar tweemilliliter microcentrifugebuisjes voor fluorolkleuring.Breng de stengelsecties over naar een microcentrifugebuisje. Voeg één milliliter van de fluoroloplossing toe aan het buisje en sluit het onmiddellijk met een dop. Omdat het zoutzuur in de fluoroglucinolkleuring zeer corrosief is, moet het buisje voorzichtig worden bewogen om te garanderen dat alle secties gekleurd worden.Pipetteer de coupes voorzichtig in een afgeknipt pipetpuntje en op een objectglas. Dek de coupes af met een dekglas. Observeer de coupes onder brightfield-verlichting.De oplossing droogt binnen vijf tot 10 minuten op, wat leidt tot een verslechtering van de preparaten. Daarom moet de beeldvorming binnen die tijd worden voltooid. Voor een tegenkleuring worden de stamsneden overgebracht naar een microcentrifugebuisje.Voeg één milliliter van de 0,5% kaliumpermanganaatoplossing toe aan de buis met de coupes. Pipetteer de 0,5% kaliumpermanganaatoplossing voorzichtig op en neer, bij voorkeur zonder de coupes te verplaatsen. Na een incubatie van twee minuten en herhaald pipetteren, laat men de microcentrifugebuis staan totdat alle coupes zijn neergedaald.Zuig met een pipette van één milliliter 700 microliters van een 0,5% kaliumpermanganaatoplossing op, voeg 700 microliters gedestilleerd water toe om het kaliumpermanganaat uit te spoelen. Herhaal dit drie tot vier keer of totdat de wateroplossing helder blijft. Gooi het water weg en voeg vervolgens snel één milliliter 3% zoutzuur toe totdat de diepbruine kleur uit de coupes is verdwenen.Dit kan binnen drie tot vijf minuten gebeuren of kan twee wasbeurten van vijf minuten vereisen. Pipetteer alle 3% zoutzuuroplossing uit en voeg onmiddellijk één milliliter geconcentreerde ammoniumhydroxide-oplossing toe. Voordat u afbeeldingen maakt onder brightfield-verlichting voor Congo-roodkleuring, brengt u de stamsecties over naar een microcentrifugebuis en voegt u één milliliter van de 0,5% Congo-roodoplossing toe.Pipetteer de 0,5% Congo red-oplossing voorzichtig op en neer zonder de coupes te verstoren. Voordat de coupes worden geïncubeerd en gewassen zoals beschreven in het tekstprotocol, worden de dissecten voorzichtig met een afgeknotte pipetpunt op een microscoopglas overgebracht. Dek ze vervolgens af met een dekglas.Observeer de monsters onder de microscoop. Verschuif deze onder blauwe lichtexcitatie met gebruik van een emissiefilter van 560 nanometer voor calcior white-kleuring. Breng de stamsecties over naar een microcentrifugebuis en voeg 1 mL van de 0,02% calcior white-oplossing toe.Pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer. Ga verder met het incuberen en wassen van de coupes zoals gedetailleerd in het tekstprotocol, voordat de coupes onder UV-licht worden geobserveerd. Voor toluidineblauw-o-kleuring worden de stamsneden overgebracht naar een microcentrifugebuisje.Voeg vervolgens één milliliter van de 0,02% toluidineblauw O-oplossing toe aan de buis en pipetteer de oplossing voorzichtig op en neer. Incubeer en was de coupes vervolgens zoals beschreven in het tekstprotocol voordat ze onder brightfield-verlichting worden geobserveerd. Raadpleeg het tekstprotocol voor details over de microscoop- en camera-instellingen voor beeldvorming, alsook voor de procedure voor ultraviolette en brightfield-beeldvorming.Aromatische verbindingen, waaronder de lignine in de cellen, kunnen worden gevisualiseerd door hun autofluorescentie onder UV-licht. Xyleem en interfibre vertoonden autofluorescentie onder UV-bestraling, maar dit was niet het geval in het merg, de cortex of de epidermis, omdat lignine en aromatische polymeren worden afgezet tijdens de secundaire celwandbiosynthese. Fluorolkleuring reageert met aldehydegroepen van lignine, wat resulteert in een roze of fuchsia kleur zoals waargenomen onder UV-bestraling. Een fuchsia kleuring is waarneembaar in het xyleem en de interfibre, maar ontbreekt in het merg, de cortex of de epidermis.Meestal correleert de intensiteit van de kleur op kwalitatieve wijze met het niveau van lignificatie. De MALS-kleuring is specifiek voor het detecteren van ingal-lignine-eenheden in xyleem en interf-vezels. Een rode kleuring duidt op de aanwezigheid van ingal-lignine-eenheden in de lignine-elementen.Er is echter een fellere rode kleurwaarneming in de vezels in vergelijking met de xylemweefsels, wat suggereert dat de vezels een hoger gehalte aan ingal-lignine bevatten, terwijl het xylem rijker is aan gua-lignine-eenheden. Stamlengtes gekleurd met calcior white werden onder UV-licht geobserveerd, waarbij bleek dat de epidermis, cortex en het merg waren gekleurd omdat al deze weefsels cellulose als belangrijkste polysaccharide-polymeer in hun celwanden bevatten. Met Congo red gekleurde coupes werden geobserveerd onder excitatie met blauw licht en kleurden eveneens de epidermis, cortex en het merg.In tegenstelling tot calcior kleurden Congo-rood polysacchariden beter in het xylem en de interfasciculaire vezels en leken ze minder beïnvloed door de aanwezigheid van lignine. Odine Blue O wordt geclassificeerd als een polychromatische kleurstof omdat het resulteert in een meerkleurig preparaat. Odine Blue O is een kationische kleurstof die bindt aan negatief geladen groepen en verschillende kleuren genereert.Wanneer de kleurstof zich bindt aan verschillende ionische groepen in de cel, onthulde anilineblauw O van dwarsdoorsneden van de stengel dat het xyleem en de interfasciculaire vezels verlignified zijn, aangezien ze een groenblauwe of blauwe kleur vertonen, wat overeenkomt met de UV- en fluoroglucosonaties. Alle kleuringswaarnemingen tonen in contrast hiermee dat het merg, de cortex en de epidermale weefsels een groenblauwe of blauwe kleur vertonen, omdat ze, hoewel ze niet verlignified zijn, pectinpolymeren in hun celwanden bevatten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u plantenstengels in coupes snijdt en hoe u de verschillende weefsels in de plantencelwand differentieel kleurt met verschillende histochemische kleurstoffen.

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the Wiesner staining technique for staining the lignin present in specialized plant cells. This staining technique helps to visualize the lignified cell walls in Arabidopsis thaliana stems and helps to quantify the lignification in the cell walls of different types of cells.

Wiesner Staining for Visualizing Lignin: A Technique to Stain Lignin Deposits Present in Stems of Arabidopsis Thaliana

In this video, we describe the Maule staining technique for staining syringyl lignin present in the specialized plant cells. This staining technique helps to characterize the lignin distribution in the xylem and interfascicular fibers.

Maule Staining for Lignin: A Technique to Characterize Lignin Distribution in Arabidopsis Thaliana Stem Sections

In this video, we demonstrate the Congo red staining method to visualize cellulose deposits in Arabidopsis thaliana stem sections.

Congo Red Staining: A Technique to Visualize Cellulose Deposits in Plant Stem Sections

In this video, we describe a staining procedure to visualize cellulose deposition within cell walls of Arabidopsis thaliana, a dicot plant, using calcofluor white, which specifically binds to β-linked glucans, exhibiting fluorescence under UV light.

Calcofluor White Staining: A Simple Method for UV-Induced Fluorescence Visualization of Cellulose Deposits in Cell Walls of Dicot Plant Stem Sections

This video demonstrates an immunostaining technique to localize arabinogalactan proteins (AGPs) and pectins in plant tissues. Fixed and resin-embedded plant tissue sections are stained with AGP- and pectin-specific primary and fluorescent secondary antibodies and a cellulose-binding fluorescent dye to reveal their tissue-specific colocalization in the cell wall.

Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in Plant Tissue

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

In dit protocol, we beschrijven van technieken voor de juiste dissectie van Arabidopsis bloemen en siliques, sommige fundamentele clearing-technieken, en geselecteerd kleuring van procedures voor geheel-mount waarnemingen van reproductieve structuren.

Geheel-mount Clearing en kleuring van Arabidopsis bloem organen en Siliques

Het doel van dit protocol is om te laten zien hoe de CFDA te laden in verschillende sites van de onderste delen van Arabidopsis. Vervolgens presenteren we de resulterende distributie patroon van CF in de scheuten.

Shootward beweging van CFDA Tracer geladen in de bodem gootsteen weefsels van Arabidopsis

Dit protocol beschrijft in detail hoe het plantaardige materiaal voor immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines is bevestigd, ingebed in een hydrofiele acrylhars, doorsneden en gemonteerd op glazen dia's. We laten zien dat celwandgerelateerde epitopen worden gedetecteerd met specifieke antilichamen.

Fluorescerende immunolocalisatie van Arabinogalactan-eiwitten en pectines in de celwand van plantenweefsels

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Dit protocol beschrijft de bereiding van intacte monsters van de endospermcellaag in Arabidopsis thaliana zaden. De methode vereist alleen gewone laboratoriumapparatuur, zoals een injectienaald en een precisietang, en maakt fluorescerende levende celbeeldvorming met hoge resolutie mogelijk van endospermcellen in zowel ontwikkelende als rijpe zaden.

Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Leer histochemische kleuringstechnieken voor secundaire celwanden in Arabidopsis thaliana stengels. Deze methode omvat inbedden, snijden en kleuren met verschillende reagentia voor microscopische analyse van celwandcompositie.

Histochemische kleuring van

Meer video's verkennen