Imaging Ontruimde Intact Biological Systems op cellulair niveau door 3DISCO

Het algemene doel van het volgende experiment is om fluorescent gelabelde intacte biologische monsters te beeldvormen zonder histologisch snijden. Dit wordt bereikt door sequentiële incubatie van gefixeerde weefsels in organische oplosmiddelen totdat een volledige transparantie is bereikt. Als tweede stap.

De transparante weefsels worden in 3D beeld gevormd met behulp van een laserscanmicroscoop. Vervolgens worden de beeldresultaten geanalyseerd en kunnen de neuronale structuren in het niet-gesneden ruggenmerg en hersenen in 3D worden gereconstrueerd vanuit de verzamelde drie disco-afbeeldingen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het neurologische veld over hoe neuronale en GAL-verbindingen in de hele hersenen en het ruggenmerg kunnen worden in kaart gebracht.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van neurodegeneratie, aangezien we nu neurale integriteit door het hele zenuwstelsel kunnen visualiseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de organisatie van het zenuwstelsel, kan deze ook worden toegepast op andere organen zoals de long of tumorweefsel. Eenmaal beheerst, duurt deze techniek slechts enkele uren voor kleine organen zoals het ruggenmerg of de long, en ongeveer één of twee dagen voor de hersenen. Begin de procedure door twee tot drie milliliter vers bereide 50% THF toe te voegen aan één glazen flesje per verzameld weefsel.

Breng vervolgens de gefixeerde organen over in de clearing-oplossing en sluit de flesjes stevig. Plaats de flesjes op een roterende tafel en bedek ze met aluminiumfolie, roer de monsters gedurende de juiste tijd met een constante snelheid van 30 RPM. Verwijder vervolgens de clearing-oplossing en gebruik een nieuw PE of pipet om het weefsel op te schorsen in de volgende oplossing.

Zoals aangegeven in de tabel tijdens de laatste clearing-stap, houd de monsters in oplossing totdat ze volledig transparant worden voor multifoton- of confocale microscopie. Zodra een volledige clearing is bereikt, monteer het monster op een beeldslide om dit te bereiken. Gebruik tandheelkundig cement om een rand rond het weefsel te maken.

Vul de pool met de laatste clearing-oplossing net voordat het tandheelkundig cement volledig hard wordt, en plaats vervolgens het gewiste monster in het midden van de pool en bedek het met een dekglas. Druk het dekglas totdat het volledig is verzegeld door het tandheelkundig cement en raakt aan het oppervlak van het gewiste orgaan voor lichtbladmicroscopie zodra een volledige clearing is bereikt, monteer, en draai vervolgens handmatig de schroef van de monsterstandaard om het monster te fixeren. Dompel vervolgens het monster in de beeldkamer van de lichtbladmicroscoop gevuld met de laatste clearing-oplossing die geschikt is voor het beeldweefsel.

Verzamel vervolgens Z-scans die het volledige gewiste weefsel bedekken met de beste resolutie die de microscoop kan leveren, en zoom in op de gebieden van belang om afbeeldingen met hogere resolutie te verzamelen. Nadat de afbeeldingen zijn verzameld, laadt u de beeldserie in de Amira-software met de resolve RT-module. Wanneer de serie is geladen, voer de juiste voxelgroottes in in het venster met afbeeldingsleesparameters en klik op oké.

Selecteer vervolgens de subtoepassing met multiplanair weergave. Gebruik vervolgens de primaire en dikte-schuifregelaars om de optimale projectiedikte en drempelwaarde voor de grijstinten te kiezen. Gebruik ten slotte de crophoekmodule om de plakjes in verschillende 3D-oriëntaties te bladeren.

Om de monsters te visualiseren, is het in kaart brengen van de structurele organisatie van neuronen uiterst belangrijk voor het begrijpen van hoe ze functioneren bij gezondheid en ziekte. Hoewel drie disco op verschillende organen kan worden toegepast, is het dan vooral nuttig voor het traceren van lange neuronale verbindingen in het ruggenmerg en de hersenen. Met behulp van ultramicroscopie-scans van grote gewiste segmenten van het ruggenmerg kan bijvoorbeeld de axonale verbindingen worden gevolgd over centimeters in het ruggenmerg van knaagdieren, zoals geïllustreerd in deze afbeeldingen.

Op een vergelijkbare manier kan de volledig gewiste muizenhersenen en hippocampus worden beeld gevormd om neuronale verbindingen in de hersenen te volgen. Wanneer confocale of multifoton-microscopie wordt gebruikt, kan de beeldresolutie aanzienlijk worden verbeterd, vooral in de Z-dimensie. Multifoton-beeldvorming van gewiste ruggenmergen van GFPM-lijnmuizen bereikt bijvoorbeeld een naadloos beeld door de hele 1,5 tot twee millimeter diepte van het ruggenmerg.

Confocale microscopie op het gewiste ruggenmerg levert op een vergelijkbare manier een verbeterde resolutie op. Multifoton-beeldvorming van gewiste hersenen levert zeer hoge resolutiebeelden op om fijne details van neuronale structuren te visualiseren, inclusief dendritische stekels. De monsters voor drie disco kunnen op verschillende manieren worden gelabeld.

Het is bijvoorbeeld mogelijk om de volledige vaatbundel van de hersenen en het ruggenmerg te labelen met behulp van lectine-geconjugeerde fluorescente tracers, die kunnen worden gebruikt om de bloed-hersenbarrière te bestuderen bij gezondheid en ziekte. Met drie disco kunnen kleinere cellen in groot weefsel ook worden beeld gevormd. Zowel microglia als astrocyten zijn bijvoorbeeld sterk betrokken bij de pathologie van neurodegeneratie, inclusief de ziekte van Alzheimer en traumatische verwondingen.

Met behulp van drie disco kan hun dichtheid en verdeling in het ruggenmerg worden bestudeerd. Ook niet-neuronale weefsels kunnen worden beeld gevormd. Clara-cellen in de gehele knaagdierenlong kunnen bijvoorbeeld worden geïmmunolabeld met antilichamen en beeld gevormd zonder secties op enkelcelniveau.

Op vergelijkbare wijze is het mogelijk om cellen in ongeautoriseerd pancreasweefsel te wissen en te beeld vormen. De fluorescent gelabelde alfa-cellen worden bijvoorbeeld geïmagereerd na clearing in deze pancreasafbeeldingen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, omdat hoewel de clearing- en beeldvormingsstappen eenvoudig zijn, kan de gegevensanalyse gecompliceerd zijn.

Tijdens het toepassen van deze procedure is het belangrijk om duidelijke weefsels te beeldvormen zodra de volledige transparantie is bere