Name: Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 57 s
Description: Leer bio-layer interferometrie voor het meten van eiwit-eiwit interactiekinetiek en allosterische effecten van kleine liganden op ATP-synthase. Deze methode biedt real-time inzicht in bindingsdynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken FortéBio voor het verschaffen grafieken in figuur 1. Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie ​​GM083088 aan TMD

<html> 1. Programmering van het instrument voor BLI Assay Zet het instrument tenminste een uur gepresenteerd om de lamp is opgewarmd, dat noodzakelijk is om ruis te minimaliseren en drift optische signaal gedurende het experiment. Stel de gewenste temperatuur via het tabblad instrument om het monster plaat voorverwarmen door de houder. Stel vervolgens de experimentele benadering in de Data Acquisition software. Selecteer &quot;Nieuwe Kinetics Experiment&quot; in het tabblad Experiment Wizard. Dit biedt een menu met tabbladen met alle stappen die moeten worden gedefinieerd. 1.1. Plaat Definitie Definieer de kolommen worden gebruikt op de 96-well plaat sample. Kolommen toewijzen aan buffer, geïmmobiliseerd eiwit of bindende partner bevatten. Voor elke vereniging goed, voer de concentratie van binding partner te gebruiken. Opmerking: de plaat definitie figuur 2 heeft opties voor verschillende assays. 1.2. Assay Definitie NHOUD &quot;&gt; begrenzen alle stappen die nodig zijn voor de test. namelijk (i) Baseline (diverse), (ii) laden, (iii) Associatie en (iv) Dissociatie van bindingspartner. Dan, zoals hieronder beschreven, te verbinden individuele assay stappen kolommen van putten op het monster plaat door het selecteren van de test stap en vervolgens dubbelklikken op de betreffende kolom. Dit programma de sensoren worden verplaatst van de ene kolom van putten naar de volgende tijdens de test. <ol><li> Baseline Begin met een korte basislijn stap (≥ 60 sec), met sensoren in assaybuffer (figuur 2, kolom 1), initiële BLI signalen vast in de 96-well plaat. </li><li> Loading (immobiliseren van het gebiotinyleerde eiwit op de sensoren) Sensoren toewijzen aan putjes die het gebiotinyleerde eiwit (Figuur 2, kolom 2) bevat. Gebruik de drempel functie om een ​​vooraf bepaald niveau van binding (zie Inleiding) te bereiken. Stel de optie drempel zodat alle sensoren beweging zal zijnd naar de volgende kolom van putten wanneer een van de sensoren de drempel bereikt. </li><li> Baseline Inclusief een basislijn stap in buffer (fig. 2, kolom 3, meestal&gt; 5 min) om geïmmobiliseerde gebiotinyleerde eiwitten weg te wassen van de sensoren en nieuwe, stabiele basislijn signalen vast. Voor basis binding / dissociatie bepalingen (zoals in figuur 3), omvat een extra stap basislijn (60 sec) met sensoren Arai buffer (figuur 2, kolom 4) vóór stap Association. </li><li> Association (de bindingspartner aan het geïmmobiliseerde eiwit) Voor een eenvoudige binding / dissociatie assay (zoals in figuur 3), selecteert een reeks concentraties van bindingspartner worden gebruikt voor verschillende sensoren / putjes (Figuur 2, kolom 5). Stel de staptijd zodat ten minste een verzadigende concentratie van de bindingspartner evenwicht moeten benaderen bindingssignaal. Voor eenassay allosterische effecten van kleine liganden op dissociatie van het eiwit-eiwit complex (zoals in figuur 5) te testen, selecteert een hoge concentratie bindingspartner (~ 10-voudig boven het geschatte Kd) voor gebruik in alle associatie putjes. </li><li> Dissociatie (van de bindende partner) Voor een eenvoudige binding / dissociatie assay alleen (zoals in figuur 3), wijzen de sensoren terug naar kolom 4 (figuur 2), dezelfde buffer putjes als voor de extra basislijn vóór Association. Voor een test om allosterische effecten van kleine liganden testen, maar wijzen sensoren om naar kolom 6 (figuur 2), waarbij elk putje kan buffer plus verschillende allosterische liganden bevatten. </li></ol> 1.3. Sensor Assignment Schrijf de plaats in de sensor lade die voorbevochtigd sensoren bevatten voor de test. Identificeer alle lege posities aangezien dit experiment zal fail als er geen sensoren opgepikt. 1.4. Beoordeling Experiment Visualiseer alle geplande stappen om te controleren op fouten en ga terug om ze te corrigeren. 1.5. Run Experiment Voer benodigde gegevens, inclusief locatie van gegevensbestanden. Voer de gewenste temperatuur voor het experiment. Als de sensors nog prewetting vereist, schakelt u de optie uit te stellen begint het experiment. Tot slot, zodra alle monstervoorbereiding is voltooid (stap 2) en zowel het monster plaat en de sensor lade zijn in het instrument geladen, klikt u op de toets Go om de test uit te voeren. 2. Monstervoorbereiding <ol><li> Bereid een geschikte testbuffer. Buffer gebruikt voor experimenten getoond in figuren 3 en 5: 20 mM MOPS (3 - (N-morfolino) propaansulfonzuur), Tris (Tris (hydroxymethyl) amino-methaan) (toegevoegd om de pH op 8,0), 50 mM KCl. Inclusief BSA (runderserumalbumine, vetzuurvrij, 0,5mg / ml eind) in de buffer voor alle assaystappen en verdunningen van het gebiotinyleerde eiwit of bindingspartner niet-specifieke binding van eiwitten aan de sensoren minimaliseren. </li><li> Verdun het gebiotinyleerde eiwit (ε) in assaybuffer tot een geschikte concentratie (zie inleiding). </li><li> Bereid verdunningen van de bindende partner (F 1 (-ε)) in assaybuffer (zie bespreking voor reeks concentraties te gebruiken). </li><li> Voorbevochtigd de met streptavidine beklede sensors minstens 10 minuten om hun beschermende sucrose coating verwijderen. Verwijder het rek-sensor bevattende de lade sensor en plaats een 96-wells plaat in de bodem van de lade schuiven een hoek van de plaat in het oriëntatie inkeping op de lade. Voor de kolom sensoren te gebruiken, voeg 200 pl testbuffer per well in die kolom van de 96-well plaat. Zet de rek van sensoren om de bak in de juiste oriëntatie (met tabs slots). </li><li> Zoals toegekend tijdens de programmering in stap 1, vul putten of de monsterplaat met testbuffer of geschikte eiwit verdunningen, zoals in figuur 2. Voorkomen dat er luchtbellen, ze ruis in het optische signaal kan veroorzaken. Een of meer referentie putten die (i) gebiotinyleerd eiwit of (ii) bindingspartner weglaten. </li><li> Open de deur van het apparaat en plaats de lade sensor op het podium (links), met lipjes van de lade geplaatst in de sleuven van het podium. Plaats het monster plaat in de plaathouder (rechts), zorg ervoor dat de plaat zit vlak en in de juiste richting, zoals aangegeven op de plaat houder. Sluit de deur en start de test van de data-acquisitie programma (stap 1.5). </li></ol> 3. Data Processing <ol><li> Nadat de test is uitgevoerd, opent u de data-analyse software en laad de map met de gegevens. Klik op het tabblad &quot;Processing&quot; naar een stapsgewijze Processing menu (links) en de ruwe kinetische gegevens te zien, met elke sensor (AH) toegewezen aan een andere kleur (zieFiguur 3). </li><li> Onder &quot;Data Selection&quot;, klik op de &quot;Sensor Selectie&quot; knop. Op de &quot;monsterplaat Map&quot;, wijst de putjes 1 of 2-sensoren (G, H in bepalingsbuffer van figuur 3) als referentie putjes. Op de verwerking menu, vink het vakje &quot;aftrekken&quot; en selecteer &quot;Reference Wells&quot; naar referentie-signaal (enkel of gemiddeld) af te trekken van het signaal om de andere sensor. </li><li> Lijn alle sporen naar Y = 0 met behulp van de &quot;Align Y-as&quot; stap. Selecteer &quot;Baseline&quot; als de uitlijning stap (dit is de laatste basislijn vóór de Vereniging stap). Voor &quot;Time Range&quot;, voer de laatste 10 seconden van dat uitgangswaarde (dwz 50-60 seconden voor een 60-sec basislijn, zoals in figuur 3). </li><li> Vink het vakje &quot;Inter-stap Correction&quot; om het signaal van verschuivingen tussen de vereniging en dissociatie stappen te minimaliseren. Selecteer af te stemmen op Baseline of dissociatie. </li><li> Selecteer Savitzky-Golay filtreren functie in de meeste gevallen en klik op &quot;Process Data!&quot; doorgaan. Visueel te inspecterende laatste verwerkte gegevens (onderste rechter paneel). Met assays bedoeld voor wereldwijde data-analyse (zoals in figuur 4), indien signaal sporen tonen een significante verschuiving tussen Vereniging en dissociatie stappen, veranderen de selectie van dissociatie of Baseline voor de &quot;Inter-stap Correction&quot; en opnieuw verwerken van de gegevens voordat u verder gaat met gegevens analyse. </li></ol> 4. Data Analysis Klik op het tabblad &quot;Analyse&quot; in Data-analyse te beginnen. Opmerking: het voorbeeld onderstaande stappen voor globale analyse van veelvoudige binding / dissociatie curves (zoals in figuur 3). <ol><li> Voor &quot;Step te analyseren&quot;, kies Association en dissociatie. Voor &quot;model&quot;, selecteert 01:01. Opmerking: andere beperkte opties zijn beschikbaar. </li><li> Voor &quot;Montage&quot;, kies Global (Full). Voor &quot;Group By&quot; te selecteren kleur (zoals op de grafiek). Selecteer &quot;R max ontkoppeld Door Sensor&quot; onafhankelijke montage van R max staan ​​(maximale signaal respons op het verzadigen binding van de partner het geïmmobiliseerde eiwit). Let op: we doen dit voor de meeste assays, zoals sensoren enigszins variëren in de hoeveelheid eiwit geïmmobiliseerd (zie figuur 3, laden). </li><li> Op de getoonde tafel, zorg ervoor dat alle sensor sporen te analyseren hebben dezelfde kleur, dus ze zullen worden geanalyseerd als een wereldwijde set. Indien nodig, selecteert u een of meer sensoren sporen weg te laten uit de wereldwijde montage: onder de kolom &quot;Inclusief&quot;, klik met de rechtermuisknop op de gewenste sensor positie en selecteer &quot;Uitsluiten Wells&quot;. </li><li> Klik op &quot;Fit Curves!&quot; de lineaire regressieanalyse starten. Onderzoek de fitting resultaten, die (i) overlay van regressiecurves met sensorgegevens sporen (zoals in figuur 4), (ii) percelen fitting residuen en (iii) een tabel met bepaalde parameterwaarden (snelheidsconstanten Rmax bevatten K D) en statistieken (standaardfouten voor parameters, Chi-kwadraat, R2). </li><li> Onder &quot;Data Export&quot;, sparen fitting resultaten door te klikken op &quot;Table Exporteren naar. Csv bestand&quot;. Voor graphing of verdere analyse van de gegevens / uitgerust bochten met andere software, klikt u op &quot;Exporteren Fitting Results&quot; om de gegevens van elke sensor en voorzien curve in een tekstbestand opslaan. </li></ol>

<ol><li>Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Transducer+Principles+for+Label-Free+Biomolecular+Interaction+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis.</a> Biosensors. 1, 70-92 (2011).</li>
<li>Homola, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+of+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Present and future of surface plasmon resonance biosensors.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).</li>
<li>Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+Detection+of+Low+Molecular+Weight+Analytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes.</a> Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).</li>
<li>Duncan, T. M. The Enzymes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+TM+%22Energy+Coupling+and+Molecular+Motors+Vol%22">Energy Coupling and Molecular Motors Vol</a>. Hackney, D. D., Tamanoi, F. XXIII, Elsevier Academic Press. 203-275 (2004).</li>
<li>Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+subunit+%CE%B5+in+the+catalysis+and+regulation+of+FOF1-ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).</li>
<li>Cingolani, G., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+ATP+synthase+catalytic+complex+%28F1%29+from+Escherichia+coli+in+an+autoinhibited+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).</li>
<li>Mirsaeidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((After+40+years%2C+new+medicine+for+combating+TB%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mycobacteriol%22%5BJournal%5D)">After 40 years, new medicine for combating TB.</a> Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).</li>
<li>Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-ATPase+of+Escherichia+coli%3A+The+%CF%B5-inhibited+state+forms+after+ATP+hydrolysis%2C+is+distinct+from+the+ADP-inhibited+state%2C+and+responds+dynamically+to+catalytic+site+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands.</a> J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).</li>
<li>Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -x, Brankow, D., Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+Processing+of+neu+Differentiation+Factor%3A+glycosylation%2C+trafficking%2C+and+regulated+cleavage+from+the+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface.</a> J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).</li>
<li>Loo, T. W., Clarke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Topology+of+a+Cysteine-less+Mutant+of+Human+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein.</a> J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).</li>
<li>Tsao, K. -L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+plasmid+expression+vector+for+the+production+of+biotinylated+proteins+by+site-specific%2C+enzymatic+modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli.</a> Gene. 169, 59-64 (1996).</li>
<li>Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) - How Does it Work?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDayne%2C+D+%22Fort%C3%A9Bio+newsletter+In+Interactions%22">FortéBio newsletter In Interactions</a>. 5, 8-9 (2012).</li>
<li>Wartchow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comput.+Aided+Mol.+Des%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten.

Thans beschikbare instrumenten voor BLI toelaten belangrijke doorvoer en flexibiliteit in assays voor biomoleculaire interacties. Verschillende monsters oplossing wordt overgebracht in putjes van een zwarte microtiterplaat en een stel evenwijdige BLI sensoren geprogrammeerd heen en weer schakelen tussen kolommen van putten op de plaat. De monsters worden geroerd door orbitaal schudden gedurende de test. Het systeem hier gebruikt heeft 8 sensoren en gebruikt een 96-well plaat monster, maar een ander systeem gebruikt 16 s...

Eiwit-eiwit interacties zijn belangrijk voor vele biologische processen en labelvrije optische methoden zoals Surface Plasmon Resonance (SPR) gebruikt in vitro kinetiek van binding en dissociatie 1 bestuderen. De meeste labelvrije methoden immobiliseren een biomolecuul op een sensor oppervlak en gebruiken een optisch signaal om een bindende partner te detecteren uit de oplossing als het associeert met de geïmmobiliseerde biomolecuul 1. Terwijl SPR is een zeer gevoelige methode is gevoelig voor storingen als gevolg van veranderingen in de brekingsindex van de oplossing stroomt via sensor 2. Hoewel niet zo gevoelig als SPR, Bio-layer interferometrie (BLI) wordt minder beïnvloed door veranderingen in de samenstelling van de steekproef 1,3. BLI gebruikt glasvezel biosensoren dat een merkgebonden biocompatibele coating aan het uiteinde hebben. Het systeem hier gebruikte (Octet-RED96) bevat acht spectrofotometers. Wit licht wordt doorgesluisd naar een rij van sondes die bewegen op een robotarm. Lichtdetectors are opgepikt door de sondes en verplaatst naar een 96-wells plaat met monsters. Een van de doelmoleculen is geïmmobiliseerd op het oppervlak biosensor. Vervolgens sensoren worden verplaatst naar putjes die de bindingspartner in oplossing. BLI bewaakt associatie van de bindende partner met het geïmmobiliseerde molecuul, en vervolgens controleert dissociatie na het verplaatsen van de sensoren om oplossing zonder de bindende partner. Binding van moleculen aan de biosensor oppervlak leidt tot veranderingen in optische interferentie tussen lichtgolven die naar de spectrofotometers reflecteren vanuit een binnenoppervlak en de externe interface tussen sensor en oplossing. Deze veranderingen in storing kan worden gekwantificeerd en gebruikt om kinetische tarieven van de binding en dissociatie, zoals samengevat in de animatie van figuur 1 te bepalen. We hebben BLI toegepast interacties tussen de katalytische complex van bacterieel ATP synthase en de ε subeenheid, die automatisch remmen het enzym te meten. ATP synthase is een membraan ingebedde roterende nanomotor die synthese en hydrolyse van ATP 4 katalyseert. De katalytische complex (F 1) kunnen worden geïsoleerd in een oplosbare vorm die werkt als een ATPase. Subeenheid ε twee domeinen: het N-terminale domein (NBD) is noodzakelijk voor een goede montage en functionele koppeling van het enzym, maar niet direct met de katalytische subeenheden, het C-eindstandige domein (CTD) kan het enzym remmen door interactie met meerdere katalytische subeenheden 5,6. Deze ε regulatie is specifiek voor bacteriële ATP synthases en wordt niet waargenomen in de mitochondriale homoloog. ATP synthase heeft zich ontpopt als een doelwit voor antibacteriële geneesmiddelen, zoals blijkt uit de recente goedkeuring van de FDA bedaquiline om resistente tuberculose 7 behandelen. Zo richten ε&#39;s remmende rol voor drug discovery kon antibiotica die niet de mitochondriale ATP synthase hoeft te remmen opleveren. Met de geïsoleerde katalytische complex (F1), εwordt een scheidbaar subeenheid. Echter, met ε gebonden aan V 1, de εCTD kan een dramatisch conformatieverandering ondergaan, gedeeltelijk ingevoegd in de centrale holte van het enzym en die een remmende toestand die waarschijnlijk direct 6,8 dissociëren. We maken gebruik van BLI om kinetiek van F 1 / ε binding en dissociatie te meten, en indirect, allosteric effecten van katalytische-ter-liganden op conformatie ε te onderzoeken. In ons systeem, ε gekozen voor immobilisatie op het sensoroppervlak aangezien BLI-signaal (zoals SPR) gevoelig is voor de massa van de moleculen binden aan het oppervlak. De ε subeenheid kleine (~ 15 kDa) ten opzichte van de belangrijkste F1 complex (~ 347 kDa). Zo zal een grotere BLI signaal het gevolg zijn van binding van F 1 aan geïmmobiliseerd ε. Om toezicht te houden F 1 dissociatie, die kan erg traag, moet ε sterk worden geïmmobiliseerd. Dus kozen we biotinyleren, En immobiliseren van met streptavidine beklede biosensoren. Eiwitten kunnen worden gebiotinyleerd door (i) willekeurige modificatie van oppervlakte lysines 9, (ii) reactie van een unieke natieve of gemodificeerde cysteine ​​met een biotine-maleïmide reagens 10 of (iii) toevoeging van een genetisch bepaalde biotine-acceptor peptide dat enzymatisch gebiotinyleerd tijdens in vivo expressie van het gelabeld eiwit 11. In ons systeem wordt ε gebiotinyleerd met de methode (iii) 8. Zodra-biotine gelabeld ε wordt geïmmobiliseerd op streptavidine sensoren, kan BLI meten van de binding en dissociatie van F 1 die is uitgeput van de subunit ε (F 1 (-ε)). Voor de hier beschreven experimenten, waren voorafgaande testen gedaan om redelijke hoeveelheden van het gebiotinyleerde eiwit vast te immobiliseren op de sensoren. Dit kan variëren, afhankelijk van het molecuulgewicht van het eiwit en zijn bindingspartner, maar het doel is om een ​​minimale hoeveelheid geïmmobiliseerd proteïne t bepalenpet verschaft (i) voldoende signaal-ruis voor binding kinetiek met een lage concentratie van de bindingspartner (hierna K D) en (ii) een minimale verstoring van bindingskinetiek met bijna verzadigende concentratie van de bindingspartner. Ook kan stoichiometrie van biotinylering variëren (maar vermijd&gt; 1 mol biotine / mol eiwit), zodat aanvankelijke test kan nodig zijn voor elke nieuwe partij gebiotinyleerd proteïne te bevestigen dat een consistente BLI verkregen kan worden bij immobilisatie op streptavidine-beklede sensoren.

<table><tbody><tr><td>Octet-RED96</td><td>Pall/FortéBio</td><td>30-5048</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td>Vrij van vetzuren</td></tr><tr><td>Biosensor/Streptavidin</td><td>Pall/FortéBio</td><td>18-5019</td><td>Schaal van 96 sensoren</td></tr><tr><td>Microtiterplaat</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655209</td><td>Zwart, Polypropyleen</td></tr><tr><td>Data Acquisitie software</td><td>Pall/FortéBio</td><td>Versie 6.4</td><td>Nieuwere versies beschikbaar</td></tr><tr><td>Data Analyse software</td><td>Pall/FortéBio</td><td>Versie 6.4</td><td>Nieuwere versies beschikbaar</td></tr></tbody></table>

bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en allosteric ligand effects

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We beschrijven het gebruik van Bio-layer Interferometrie remmende subeenheid interacties van ε studie met het katalytische complex van Escherichia coli ATP synthase. Bacteriële type F ATP synthase is het doelwit van een nieuwe, door de FDA goedgekeurde antibioticum-resistente tuberculose te bestrijden. Inzicht bacterie-specifieke auto-remming van ATP synthase door het C-terminale domein van subeenheid ε kan een nieuw middel om het enzym ontdekking van antibacteriële geneesmiddelen doelwit. De C-terminale domein van ε ondergaat een dramatische conformatieverandering wanneer het enzym overgangen tussen de actieve en inactieve toestanden en katalytische plaatse liganden beïnvloeden welke conformaties ε is overheersend. De test meet kinetiek van de binding ε / dissociatie met de katalytische complex en indirect mealen de verschuiving van enzym gebonden ε en naar de schijnbaar nondissociable remmende conformatie. De Bio-laag Interferometrie signaal niet overgevoelig voor oplossing samenstelling, dus het kan ook gebruikt worden om allosterische effecten van katalytische-ter liganden op ε de conformatieveranderingen volgen.

Real time binding en dissociatie BLI kinetiek in figuur 3. Dit experiment werd uitgevoerd met testbuffer tezamen en dissociatie. Dit experiment werd gestart met een 10 minuten basislijn stap omdat de sensoren was voorbevochtigd slechts kort. Vervolgens werd gebiotinyleerd ε geladen op de sensoren. Geen detecteerbare dissociatie van ε trad in alle overige stappen gezien vanaf de referentiecurve (G) die geen bindende partner toegevoegd. Een tweede referentie sensor (H) miste geïmmobiliseerd eiwit en toond...

De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε&#39;s.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het meten van de kinetiek van eiwitten, eiwitinteracties en de allosterische effecten van kleine liganden op die interacties met behulp van biolayer interferometrie, BLI. Dit wordt bereikt door een van de eiwitten te voorzien van specifiek biotine en dit parallel te immobiliseren op het oppervlak van streptavidine-gecoate biosensoren.Als tweede stap wordt het aan de sensor gebonden eiwit blootgesteld aan een buffer die de bindingspartner bevat, waarbij de binding in real-time wordt gemeten aan de hand van het effect op de optische interferentie aan het sensoroppervlak. Vervolgens wordt elke sensor overgebracht naar een buffer zonder de bindingspartner om de real-time dissociatie van het eiwit te meten. Eiwitcomplexen.De verkregen resultaten maken het mogelijk om de kinetische snelheidsconstanten voor de binding en dissociatie van de interagerende eiwitten en daarmee hun bindingsaffiniteit te bepalen. Verdere resultaten tonen aan dat BLI de effecten van kleine liganden op de dissociatiesnelheid van het eiwit-eiwitcomplex kan detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals surface plas

bio-layer-interferometry-for-measuring-kinetics-protein-protein

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

We passen label-free eiwit interactie analyse met behulp van Biacore X100 voor structuur-functie analyse van de binding van verschillende cystatine B mutanten te papaïne door kinetische karakterisering. Kalibratie-vrije concentratie analyse (CBVC) meet de concentratie van het eiwit met behoud van bindende activiteit, zonder de noodzaak van een standaard curve. We tonen aan dat de bevestiging van de concentraties met behulp van CFCA verhoogt de betrouwbaarheid van de kinetische analyse en dat...

Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

In this video, we demonstrate biolayer interferometry (BLI) technology to detect the intermolecular interactions between ligands and target analytes in real-time. BLI measures changes in the interference pattern of white light reflected off a layer of immobilized ligands on a biosensor surface as they interact with analytes in solution.

Biolayer Interferometry Technology to Detect Interactions between Ligand and Analyte

Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.

Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay

Hier presenteren we een protocol voor het controleren van de montage en demontage van de toxine van de bloedzweer met behulp van biolayer interferometrie (BLI). Na montage/demontage op de biosensor oppervlak, de grote eiwitcomplexen worden vrijgegeven uit het oppervlak voor visualisatie en identificatie van onderdelen van de complexen met behulp van elektronenmicroscopie en massaspectrometrie, respectievelijk.

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Dit artikel beschrijft een protocol voor het bestuderen van DNA-eiwitinteracties met behulp van een op streptavidine gebaseerd biolaaginterferometrie (BLI) systeem. Het schetst de essentiële stappen en overwegingen voor het gebruik van basis- of geavanceerde bindingskinetiek om de evenwichtsbindingsaffiniteit (KD) van de interactie te bepalen.

Analyse van DNA-eiwitinteracties met op streptavidine gebaseerde biolaaginterferometrie

Een eenvoudig protocol om de neutrale vetgehalte van algen cellen te bepalen met behulp van een Nile Red kleuring procedure wordt beschreven. Deze tijdbesparende techniek biedt een alternatief voor traditionele-gravimetrische basis lipide kwantificering protocollen. Het is ontworpen voor de specifieke toepassing van controle bioproces prestaties.

Een eenvoudige en snelle protocol voor het meten van neutrale lipiden in algencellen met behulp van fluorescentie

Colloïdale sondev-nanoscopie kan binnen verschillende velden worden gebruikt om inzicht te krijgen in de fysische stabiliteit en coagulatiesnelheid van colloïdale systemen en om medicijnontdekking en formuleringswetenschappen te ondersteunen met behulp van biologische systemen. De beschreven methode biedt een kwantitatief en kwalitatief middel om dergelijke systemen te bestuderen.

Kwantitatieve en kwalitatieve onderzoek van Particle-deeltje Interacties gebruik Colloïdaal Probe Nanoscopy

De gepresenteerde protocollen beschrijven twee op enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) gebaseerde technieken voor de snelle onderzoeking van ligand-receptor interacties: De eerste test stelt de bepaling van constante disassociatie tussen ligand en receptor mogelijk. De tweede test maakt een snelle screening van blokkerende peptiden voor ligand-receptor interacties mogelijk.

Een ELISA Based Binding en concurrentie methode om snel bepalen Ligand-receptor interacties

Hier presenteren we een methode om ligand-vrije cadmiumsulfide (CdS) nanodeeltjes te synthetiseren op basis van een uniek zwavelcopolymeer. Het zwavelcopolymeer fungeert als een hoogtemperatuuroplosmiddel en een zwavelbron tijdens de synthese van de nanodeeltjes en stabiliseert de nanodeeltjes na de reactie.

Synthese van Ligand-vrij CdS Nanodeeltjes binnen een Zwavel copolymeermatrix

Leer bio-layer interferometrie voor het meten van eiwit-eiwit interactiekinetiek en allosterische effecten van kleine liganden op ATP-synthase. Deze methode biedt real-time inzicht in bindingsdynamica.

Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Meer video's verkennen