Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects

Het algemene doel van het volgende experiment is het meten van de kinetiek van eiwitten, eiwitinteracties en de allosterische effecten van kleine liganden op die interacties met behulp van biolayer interferometrie, BLI. Dit wordt bereikt door een van de eiwitten te voorzien van specifiek biotine en dit parallel te immobiliseren op het oppervlak van streptavidine-gecoate biosensoren.

Als tweede stap wordt het aan de sensor gebonden eiwit blootgesteld aan een buffer die de bindingspartner bevat, waarbij de binding in real-time wordt gemeten aan de hand van het effect op de optische interferentie aan het sensoroppervlak. Vervolgens wordt elke sensor overgebracht naar een buffer zonder de bindingspartner om de real-time dissociatie van het eiwit te meten. Eiwitcomplexen.

De verkregen resultaten maken het mogelijk om de kinetische snelheidsconstanten voor de binding en dissociatie van de interagerende eiwitten en daarmee hun bindingsaffiniteit te bepalen. Verdere resultaten tonen aan dat BLI de effecten van kleine liganden op de dissociatiesnelheid van het eiwit-eiwitcomplex kan detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals surface plasmon resonance, is dat BLI niet overmatig gevoelig is voor veranderingen in de brekingsindex.

De bindings- en associatiestappen kunnen dus veranderingen in kleine liganden omvatten om hun effecten op de proteïne-proteïne interacties in real-time te testen. Hoewel deze methode inzicht kan bieden in de kinetiek van proteïne-proteïne interacties, kan deze ook worden toegepast op verschillende combinaties, zoals de binding van proteïnen aan geïmmobiliseerd DNA of RNA, of de binding van liposomen aan een geïmmobiliseerde proteïne. Begin dit experiment door het BLI-instrument in te stellen zoals beschreven in het tekstprotocol.

Stel vervolgens het experimentele ontwerp in de software voor gegevensverwerving in. Selecteer 'nieuw kinetiekexperiment' in het tabblad van de experimentwizard. Er verschijnt nu een menu met tabbladen met alle stappen die op het eerste tabblad moeten worden gedefinieerd.

Definieer de te gebruiken kolommen op de 96-wells monsterplaat. Wijs kolommen toe voor de buffer, het te immobiliseren eiwit of de bindingspartner.

Voer voor elke associatie de concentratie van de te gebruiken bindingspartner in. Definieer op het tweede tabblad alle stappen die nodig zijn voor de assay. Deze omvatten de baseline, belading, associatie en dissociatie van de bindingspartner.

Individuele assaystappen worden gekoppeld aan kolommen met wells op de monsterplaat door de assaystap te selecteren en vervolgens dubbel te klikken op de betreffende kolom. Hiermee worden de sensoren geprogrammeerd om van de ene kolom wells naar de volgende te bewegen. Begin de assay met een korte baseline-stap, gekoppeld aan de eerste kolom wells met assaybuffer, om de initiële BLI-signalen in de 96-wellplaat vast te stellen.

Koppel vervolgens de ladingsstap aan de wells die het gebiotinyleerde eiwit zullen bevatten. Gebruik de drempelfunctie om een vooraf bepaald bindingsniveau te bereiken. Stel de drempeloptie zo in dat alle sensoren naar de volgende kolom met wells worden verplaatst.

Wanneer een van de sensoren de drempelwaarde bereikt, voeg dan een extra baseline-stap in buffer toe om niet-geïmmobiliseerde gebiotinyleerde eiwitten van de sensoren weg te wassen en nieuwe stabiele baseline-signalen vast te stellen. Voor basisassays om globale bindings- en dissociatiesnelheidsconstanten te bepalen, moet een extra baseline-stap worden opgenomen met sensoren in een nieuwe kolom bufferputjes voorafgaand aan de associatie. Koppel vervolgens de associatiestap aan de kolom putjes die variërende concentraties van de bindingspartner bevatten.

Pas de stapduur aan zodat ten minste een verzadigende concentratie van de bindingspartner een equilibrium-bindingssignaal bereikt. Wijs voor de dissociatiestap de sensoren toe om terug te keren naar kolom vier, dezelfde bufferputjes als gebruikt voor de extra basislijn vóór associatie. De tijden voor de associatie- en dissociatiestappen kunnen tijdens het experiment worden aangepast als de snelheden lager of hoger zijn dan verwacht.

Geef op tabblad drie de locaties in de sensorlade aan die vooraf bevochtigde sensoren voor de assay zullen bevatten. Tabblad vier maakt een grafische controle van het programma mogelijk. Voer op tabblad vijf de benodigde details in, waaronder de locatie van de gegevensbestanden en de gewenste temperatuur.

Voor het experiment moeten de streptavidine-gecoate sensoren gedurende ten minste 10 minuten worden voorgebehandeld met vloeistof. Om de beschermende sucrosecoating te verwijderen, haalt u het rek met sensoren uit de sensorlade en plaatst u een 96-wells plaat in de bodem van de lade door één hoek van de plaat in de oriëntatieinkeping van de lade te schuiven.

Voeg 200 µL assaybuffer per putje toe aan de kolom met sensoren die gebruikt gaat worden. Plaats in die kolom van de 96-wells plaat het rek met sensoren in de juiste oriëntatie, zoals toegewezen tijdens het programmeren, terug in het plateau. Vul de putjes van de monsterplaat met assaybuffer of de juiste proteïnediluties. Vermijd het ontstaan van luchtbellen, aangezien deze ruis in het optische signaal kunnen veroorzaken.

Voeg één of meer referentieputjes toe waarin ofwel het gebiotinyleerde eiwit of de bindingspartner ontbreekt. Open de deur van het instrument en noteer de lichtopbrengst van de sensorarm. Plaats de sensorlade op het platform, waarbij de tabbladen van de lade in de sleuven van het platform worden geschoven.

Plaats de monsterplaat in de platenhouder. Zorg ervoor dat de plaat vlak ligt en in de juiste oriëntatie is geplaatst, zoals aangegeven op de platenhouder. Sluit de deur en start de analyse via het programma voor gegevensverwerving.

Indien de sensoren nog steeds voorbevochtiging vereisen, selecteer dan de optie om het starten van het experiment uit te stellen. Zodra alle monsterpreparatie is voltooid en zowel de monsterplaat als het sensorrek in het instrument zijn geplaatst, klikt u op de go-knop om de assay uit te voeren. Open na afloop van de assay de software voor data-analyse en laad de map waarin de gegevens staan.

Klik op het tabblad 'Processing' om een stapsgewijs verwerkingsmenu en de ruwe kinetische gegevens te zien, waarbij elke sensor onder 'Data selection' een andere kleur heeft gekregen. Klik op de knop voor sensorselectie op de kaart van de monsterplaat. Wijs in het verwerkingsmenu de wells voor één of twee controlesensoren toe als referentiewells.

Vink het vakje voor aftrekking aan en selecteer referentieputjes om het referentiesignaal van het signaal van elke andere sensor af te trekken. Lijn alle sporen uit op Y gelijk aan nul door de stap 'align y axis' te gebruiken. Selecteer vervolgens 'baseline' als de uitlijningsstap voor het tijdsbereik.

Voer de laatste 10 seconden van die baseline in. Door binnen die baseline-stap te klikken, wordt de uitlijning weergegeven. Vink vervolgens het vakje voor inter-stapcorrectie aan om signaalverschuivingen tussen de associatie- en dissociatiestappen te minimaliseren.

Selecteer een lijn voor de basislijn of dissociatie. Selecteer in de meeste gevallen de KY-gole filterfunctie en klik op 'process data' om verder te gaan; inspecteer de uiteindelijke bewerkte gegevens visueel in het paneel rechtsonder. Om de gegevens te analyseren, klikt u op het tabblad 'analysis' in 'data analysis', selecteer de stap die geanalyseerd moet worden en kies voor associatie en dissociatie.

Selecteer voor model 'one to one' voor de fitting en kies 'global'. Selecteer bij 'group by' de optie 'color' en selecteer 'r max unlinked by sensor' om een onafhankelijke fitting van de maximale signaalrespons bij verzadigende binding van de partner aan het geïmmobiliseerde eiwit mogelijk te maken. Klik ten slotte op 'fit curves' om de niet-lineaire regressieanalyse te starten.

Bestudeer de resultaten van de fitting, waarin de regressiecurves over de sensordatasporen zijn gelegd, samen met plots van de fittingresiduen en een tabel met de bepaalde parameterwaarden en statistieken. Hier worden de real-time binding- en dissociatie-BLI-kinetieken weergegeven. Dit experiment begon met een baseline-stap van 10 minuten, aangezien de sensoren slechts kortstondig waren voorgebehandeld, waarna gebiotinyleerde epsilon op de sensoren werd geladen.

Gedurende alle overige stappen was er geen detecteerbare dissociatie van epsilon waarneembaar op de referentiecurve, waaraan geen bindingspartner was toegevoegd. Een tweede referentiesensor bevatte geen gemobiliseerd eiwit en vertoonde een lage aspecifieke binding van de bindingspartner. Diverse concentraties F1 minus epsilon werden gebruikt in de associatiestap voor sensoren A tot en met F om de resultaten globaal te fitten en de optimale waarden voor de associatiesnelheidsconstante en de equilibriumdissociatieconstante KD te verkrijgen; de resultaten werden verwerkt, wat leidde tot de blauwe datatraceringen.

In dit geval werd het referentiesensortrace afgetrokken van de monstertraces om te corrigeren voor aspecifieke binding van de bindingspartner en signaaldrift van het systeem. In de stap van de data-analyse werden alle curven globaal gefit met een één-op-éénmodel. De globale fit gaat uit van volledige dissociatie van de bindingspartner.

Hier wordt een ander experiment getoond waarin het enzym werd gebonden aan sensor-geïmmobiliseerde epsilon in de aanwezigheid van 1 mM ATP$\gamma$S. Dit zorgt ervoor dat de meeste F1 epsilon-complexen de niet-inhiberende conformatie aannemen, die gemakkelijk divergeert. De sensoren werden vervolgens overgebracht naar dissociatieputjes die assaybuffer met verschillende liganden bevatten. Dit demonstreert de effecten van verschillende liganden op de conformatie van epsilon.

Bijvoorbeeld, blootstelling aan magnesium A GP en fosfaat vertraagde de netto dissociatie aanzienlijk, wat aangeeft dat epsilon van conformatie veranderde naar de strak gebonden inhiberende toestand. Bij het voor het eerst opzetten van BLI-assays is het belangrijk om controles op te nemen om te testen op aspecifieke binding van eiwitten aan de sensoren en of aspecifieke binding significant varieert met de te gebruiken eiwitconcentraties. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u BLI-assays ontwerpt, programmeert en analyseert voor het meten van de kinetiek van eiwit-eiwitinteracties en daarvan de waarde moeten inzien.

BLI maakt een directe test mogelijk voor de effecten van kleine liganden op proteïne-proteïne-interacties.