Bio-layer interferometrie voor het meten van kinetiek van eiwit-eiwit interacties en Allosteric Ligand Effects
18 februari 2014
De protocollen beschrijven hier kinetische analyses van eiwit-eiwit interacties met Bio-layer interferometrie. F type ATP synthase, dat betrokken is bij de cellulaire energiemetabolisme, kan worden geremd door de ε subeenheid in bacteriën. We hebben Bio-layer interferometrie aangepast aan interacties van de katalytische complex studeren met remmende C-terminale domein ε's.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de kinetica van eiwitten, eiwitinteracties en de allosterische effecten van kleine liganden op die interacties te meten met behulp van biolaaginterferometrie, BLI. Dit wordt bereikt door een van de eiwitten met specifiek biotin te bereiden en het parallel te immobiliseren op het oppervlak van strep. Aden gecoate biosensoren.
Als tweede stap wordt het sensorgebonden eiwit blootgesteld aan buffer die zijn bindingspartner bevat, en de binding wordt in realtime gemeten door het effect op optische interferentie aan het sensoroppervlak. Vervolgens wordt elke sensor overgebracht naar buffer zonder de bindingspartner om realtime dissociatie van het eiwit te meten. Eiwitcomplexen.
De verkregen resultaten maken het mogelijk om de kinetiekconstanten voor binding en dissociatie van de interacterende eiwitten te bepalen en dus hun bindingsaffiniteit. Verdere resultaten tonen aan dat BLI de effecten van kleine liganden op de dissociatiesnelheid van het eiwit-eiwitcomplex kan detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals oppervlakteplasmaresonantie, is dat BLI niet overdreven gevoelig is voor veranderingen in de brekingsindex.
Dus de binding en associatiestappen kunnen veranderingen in kleine liganden omvatten om hun effecten op de eiwit-eiwitinteracties in realtime te testen. Deze methode kan echter ook inzichten geven in de kinetiek van eiwit-eiwitinteractie. Het kan ook worden toegepast op verschillende combinaties zoals eiwitbinding aan geïmmobiliseerd DNA of RNA of liposoombinding aan een geïmmobiliseerd eiwit. Begin dit experiment door het BLI-instrument in te stellen zoals beschreven in het tekstprotocol.
Stel vervolgens het experimentele ontwerp in de data-acquisitiesoftware in. Selecteer nieuwe kinetiekexperiment in het tabblad experimentwizard. Dit presenteert een tabbladmenu met alle stappen die op tabblad één moeten worden gedefinieerd.
Definieer de te gebruiken kolommen. Op de 96-well monsterplaat. Wijs kolommen toe om buffer, het te immobiliseren eiwit of de bindingspartner te bevatten.
Voer voor elke associatie de concentratie van de bindingspartner in die zal worden gebruikt. Op tabblad twee definieert u alle stappen die nodig zijn voor de assay. Deze omvatten baseline, belasting, associatie en dissociatie van de bindingspartner.
Individuele assaystappen worden gekoppeld aan kolommen van putjes op de monsterplaat door de assaystap te selecteren en vervolgens dubbel te klikken op de betreffende kolom. Dit programmeert de sensoren om van de ene kolom van putjes naar de volgende te worden verplaatst. Tijdens de assay begint u met een korte baselinestap gekoppeld aan de eerste kolom van putjes met assaybuffer om de initiële BLI-signalen in de 96-wellplaat vast te stellen.
Koppel vervolgens de laadfase aan putjes die het gebiotineerde eiwit zullen bevatten. Gebruik de drempelfunctie om een vooraf bepaald niveau van binding te bereiken. Stel de drempeloptie zo in dat alle sensoren naar de volgende kolom van putjes worden verplaatst.
Wanneer een van de sensoren de drempel bereikt, voegt u een andere baselinestap in buffer toe om niet-geïmmobiliseerde gebiotineerde eiwitten van de sensoren te wassen en nieuwe stabiele baselinesignalen vast te stellen voor basisassays om globale bindings- en dissociatiesnelheidsconstanten te bepalen, inclusief een extra baselinestap met sensoren in een nieuwe kolom met bufferputjes vóór de associatie. Stap vervolgens, koppel de associatiestap naar de kolom met putjes die verschillende concentraties van de bindingspartner bevatten.
Pas de staptijd aan zodat ten minste een verzadigde concentratie van de bindingspartner een evenwichtsbindingssignaal zou moeten bereiken. Voor de dissociatiestap, wijst u de sensoren aan om terug te keren naar kolom vier, dezelfde bufferputjes zoals gebruikt voor de extra baseline vóór associatie. De tijden voor associatie- en dissociatie-stappen kunnen tijdens het experiment worden aangepast als de snelheden langzamer of sneller zijn dan verwacht.
Op tabblad drie, geef locaties in de sensorlade aan die geprewette sensoren voor de assay zullen bevatten. Tabblad vier biedt grafische beoordeling van het programma. Op tabblad vijf, voer de nodige details in, inclusief locatie van databestanden en de gewenste temperatuur.
Voor het experiment. Bevochtig de streptavidine-gecoate sensoren minimaal 10 minuten. Om hun beschermende sucrosecoating te verwijderen, verwijdert u de sensorbevattende rek uit de sensorlade en plaatst u een 96-wellplaat op de bodem van de lade door een hoek van de plaat in de oriënterende inkeping op de lade te schuiven.
Voor de kolom sensoren die zal worden gebruikt, voeg 200 microliter assaybuffer per put toe. In die kolom van de 96-wellplaat, plaatst u de sensorrek terug in de lade in de juiste oriëntatie zoals toegewezen. Tijdens het programmeren, vult u de putjes van de monsterplaat met assaybuffer of de juiste eiwitverdunningen. Vermijd het inbrengen van luchtbellen omdat deze ruis in het optische signaal kunnen veroorzaken.
Neem een of meer referentieputjes op die ofwel gebiotinyleerd eiwit ofwel bindingspartner weglaten. Open de deur van het instrument en noteer de lichtuitvoer van de sensorarm. Plaats de sensorlade op het podium met de tabbladen van de laden in de sleuven van het podium.
Plaats de monsterplaat in de platenhouder. Zorg ervoor dat de plaat vlak zit en in de juiste oriëntatie zoals aangegeven op de platenhouder. Sluit de deur en start de assay vanuit het data-acquisitieprogramma.
Als sensoren nog steeds voorbevochtiging vereisen, selecteert u de optie om het starten van het experiment te vertragen. Ten slotte, zodra alle monstervoorbereiding voltooid is en zowel de monsterplaat als de sensorlade in het instrument zijn geladen, klikt u op de startknop om de assay uit te voeren. Nadat de assay is uitgevoerd, opent u de data-analysesoftware en laadt u de map met de gegevens.
Klik op het verwerkingstabblad om een stapsgewijze verwerkingsmenu en de ruwe kinetiekgegevens te zien, waarbij elke sensor een andere kleur krijgt toegewezen onder dataselectie. Klik op de sensorselectieknop op de monsterplaatkaart. Wijs de putjes voor een of twee controlesensoren aan als referentieputjes op het verwerkingsmenu.
Vink het aftrekvakje aan en selecteer referentieputjes om het referentiesignaalverwijderen uit elk
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert protocollen voor het meten van eiwit-eiwit interacties met behulp van Bio-layer Interferometry (BLI). De focus ligt op de interactie tussen F-type ATP synthase en zijn ε subeenheid, die een rol speelt in energiemetabolisme in bacteriën.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Eiwit Interacties
Achtergrond
- F-type ATP synthase is cruciaal voor cellulaire energieproductie.
- De ε subeenheid kan de activiteit van ATP synthase remmen.
- Het begrijpen van deze interacties is belangrijk voor inzichten in metabolische regulatie.
- Bio-layer Interferometry maakt real-time meting van deze interacties mogelijk.
Doel van Studie
- Om de kinetica van eiwit-eiwit interacties te meten.
- Om de allosterische effecten van kleine liganden op deze interacties te onderzoeken.
- Om BLI aan te passen voor het bestuderen van het katalytische complex van ATP synthase.
Gebruikte Methoden
- Preparatie van eiwitten met biotin voor immobilisatie.
- Gebruik van streptavidin-gecoate biosensoren voor bindingsassays.
- Real-time meting van binding en dissociatie met behulp van optische interferentie.
- Analyse van eiwitcomplexen gevormd tijdens de interactie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle meting van bindingskinetica tussen ATP synthase en zijn ε subeenheid.
- Real-time data over de dissociatie van eiwitcomplexen.
- Inzichten in de allosterische regulatie van ATP synthase activiteit.
- Demonstratie van BLI als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van eiwitinteracties.
Conclusies
- BLI is effectief voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties.
- De interactie tussen ATP synthase en zijn ε subeenheid is cruciaal voor het begrijpen van metabolische controle.
- Toekomstige studies kunnen op deze methoden voortbouwen om andere eiwitinteracties te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Bio-layer Interferometry (BLI) enables real-time kinetic analysis of protein-protein interactions and allosteric ligand effects, supporting target validation in antibacterial drug discovery. By measuring binding and dissociation rates of the ε subunit with ATP synthase catalytic complexes, BLI provides quantitative data to de-risk mechanistic hypotheses and prioritize lead compounds. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking ligand-induced conformational changes to functional inhibition of a clinically relevant target.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how ligands shift ε subunit conformation between active and inhibitory states.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding kinetics without label interference, reducing assay variability.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating ligand binding with functional outcomes in bacterial energy metabolism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Measures association and dissociation rate constants to characterize binding affinity under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Tolerates varying buffer compositions, allowing screening of diverse ligand libraries without signal artifacts.
- Scalability: Compatible with 96-well formats for parallel evaluation of multiple ligand concentrations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro binding data to bacterial-specific auto-inhibition mechanisms relevant to antibiotic development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies allosteric regulation of ATP synthase, reducing ambiguity in target engagement strategies.
- Preclinical Alignment: Supports disease-relevant modeling by focusing on a validated antibacterial target (FDA-approved for tuberculosis).
Pipeline & Workflow Integration
BLI fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for antibacterial programs targeting energy metabolism.
- Discovery Biology: Tests target validity by measuring real-time kinetics of protein-protein interactions and ligand-induced conformational shifts.
- Screening: Delivers quantitative KD, kon, and koff values to support hit-to-lead progression and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides sensor-based optical interference readouts that enable global fitting and residual analysis for robust kinetic modeling.
- Translational Research: Connects biochemical mechanism to antibacterial phenotype through inhibition of a clinically validated target.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying protein-protein interactions across multiple targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by detecting allosteric effects of small ligands on protein complex stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through reference subtraction, baseline alignment, and inter-step correction during data processing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing kinetic thresholds for target engagement and ligand efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on binding kinetics and conformational selectivity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biotinylation, streptavidin biosensor handling, and BLI instrument setup.
- Depends on access to multi-well plate readers with temperature control and real-time optical monitoring capabilities.
- Necessitates standardized workflows for sensor regeneration, reference well inclusion, and data subtraction to minimize noise.
- Involves optimization of association and dissociation timing based on ligand binding kinetics and complex stability.
- Limited by the need for immobilized binding partners, which may affect native protein conformation or accessibility.
