Nucleosidetrifosfaten - Van Synthese tot biochemische karakterisering

Het algemene doel van deze video is om de procedure te demonstreren van de synthese van de gemodificeerde nucleoside fosfaten tot hun volledige biochemische karakterisering. Dit wordt bereikt door eerst de geschikt beschermde nucleoside precursor om te zetten in het corresponderende trifosfaat door toepassing van een vierstappen eenpot procedure. De tweede stap is om het resulterende trifosfaat eerst te zuiveren door precipitatie en vervolgens door omkeerfase hoge prestatie vloeistof chromatografie.

Vervolgens wordt het trifosfaat analoog gekarakteriseerd door nucleaire magnetische resonantie en matrix-geassisteerde laser DESORPTIE ionisatie tijd van vlucht of NMR en maloff om hoge zuiverheid te garanderen. De laatste stap is primerverlengingsreacties en terminale deoxy nucleotide transferase of TDT polymerisatiereacties. Uiteindelijk worden de reactieproducten, en dus de substraatacceptantie van het trifosfaat, geanalyseerd door gelelektroforese.

Het voordeel van deze methode vergeleken met andere synthesestrategieën zoals de Borge-aanpak, is dat er minder nevenproducten worden gevormd en dus de zuivering gemakkelijker is. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze techniek worstelen omdat het een vrij langdurige en ingewikkelde procedure is die kennis op meerdere gebieden vereist. We hadden eerst het idee voor deze methode om te worden gefilmd toen we gemodificeerde fosfaten synthetiseerden en vonden het nogal een uitdaging om een gedetailleerde procedure te vinden.

Een ander voordeel van deze methode is dat het kan worden gebruikt om andere vragen op het gebied van gemodificeerde nucleïnezuren aan te pakken. Inderdaad, het kan worden gebruikt om DNA-enzymen te selecteren die een breed scala aan reacties katalyseren. Bovendien kan deze methode worden gebruikt voor functionele tagging van nucleïnezuren.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat synthese- en zuiveringsstappen moeilijk te leren zijn omdat trifosfaten polaire en geactiveerde derivaten zijn die voorzichtig moeten worden behandeld. Om te beginnen moet het geschikte drie-primaire hydroxylbeschermde nucleoside twee keer worden geëvaporeerd met twee milliliter anhydrisch purine voordat het onder vacuüm wordt gedroogd overnacht. Tegelijkertijd droog tribunal ammonium pyrofosfaat onder vacuüm gedurende de nacht de volgende dag, loste het nucleoside op in een minimum van 200 microliters droge pyridine.

Voeg vervolgens 400 microliters droog dioxaan toe als een COS-oplosmiddel. Voeg tenslotte de cyclische fosfor drie-derivaat toe en laat het 45 minuten reageren bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een oplossing van droog butyl ammonium pyrofosfaat in 170 microliters droog dimethylformamide en 58 microliters vers gedestilleerd tri butyl amine.

Voeg de resulterende oplossing toe aan het reactiemengsel en laat het 45 minuten reageren bij kamertemperatuur. Bereid vervolgens een oplossing van 160 micromolar jodium in 980 microliters purine en 20 microliters water. Voeg de oplossing toe aan het reactiemengsel.

Om het alfa-fosforcentrum te oxideren. Laat de resulterende donkere oplossing 30 minuten bij kamertemperatuur roeren. Gebruik een 10% waterige oplossing van natriumthiosulfaat om het overtollige jodium te blussen.

Verwijder het oplosmiddel onder vacuüm. Voeg vervolgens vijf milliliter water toe en laat het mengsel 30 minuten bij kamertemperatuur staan om de cyclische trifosfaat moty te hydrolyseren. In dit stadium worden de beschermende groepen meestal verwijderd.

Voeg vervolgens 30%Imodium hydroxide toe aan het ruwe monster. Roer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur voordat het oplosmiddel onder vacuüm wordt verwijderd. Voeg vervolgens twee milliliter water toe en verdeel het mengsel in buisbuizen.

Voeg 12 milliliter van een 2%oplossing van natriumperchloraat in aceton toe en centrifugeer gedurende 30 minuten voordat de procedure wordt herhaald. Nog een keer. De reagentia die worden gebruikt in de synthese van de trifosfaat zullen uitkristalliseren waardoor een olieachtige residu ontstaat en de scheiding van de oplosmiddelen mogelijk wordt, en waardoor de daaropvolgende omgekeerde fase HPLC-zuivering aanzienlijk wordt vereenvoudigd na het drogen van de olieachtige residu in de lucht.

Neem een P 31 NMR-spectrum van het ruwe monster op volgens standaardprocedures. Na NMR loste het olieachtige residu op in vier milliliter gedistilleerd water. Begin met HPLC-zuivering met bereiding van 50 millimolair triethylammoniumbicarbonaat in ultrapuur water als EENT A en in 50% acetylnitrile als eent B zoals beschreven in het tekstprotocol, Degas beide EENT onder vacuüm en roer gedurende 20 minuten.

Bereid een analytisch monster voor door 10 microliter van de ruwe trifosfaat op te lossen in 300 microliters gedistilleerd water. Gebruik vervolgens een gradiënt variërend van 0%B tot 100%B in 40 minuten. Injecteer het monster in een HPLC-systeem uitgerust met een semi-preparatieve omgekeerde fase C 18 kolom.

Pas het HPLC-programma aan volgens de retentietijd van de trifosfaat en de difosfaat. Zuiver het ruwe mengsel onder deze omstandigheden en door vroege fracties te verwijderen die mogelijk wat difosfaat kunnen bevatten, combineer alle fracties die het product bevatten en vriesdroog. Vervolgens co-evaporeer meerdere keren met ultrapuur water.

Beoordeel de zuiverheid van de trifosfaat door NMR en maloff door toepassing van standaardprotocollen. Typische opbrengsten verkregen door toepassing van dit protocol liggen in het bereik van 30 tot 70%afhankelijk van het substraat voor vijf prime en het labelen van de primer. Meng de primer en reagentia zoals beschreven in het tekstprotocol en incubeer de labelreactie gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius.

Tijdens de labelreactie bereidt u een G 10 cidex kolom voor door een een milliliter pipettetip te stoppen met gesiliceerd glaswol en de tip te vullen met G 10 oplossing. Draai naar beneden en was drie keer met 500 microliters dubbel gedestilleerd water en een laatste was met 50 microliters dubbel gedestilleerd water. Na incubatie van de labelreactie, deactiveer de kinase gedurende 1