Name: Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer een in vivo cross-linking methode om eiwitcomplexen te isoleren uit Drosophila embryo's. Deze techniek vangt tijdelijke eiwitinteracties met formaldehyde en maakt analyse via Western blot mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler en Jimiao Zheng voor hun technische hulp bij deze studie. Dit werk werd ondersteund door NSF CARRIERE verlenen MCB-1054962 om ALA

1. Het bereiden van grote Appelsap-agar platen <ol><li> Om 4 borden, voeg 375 ml H 2 O, 11,25 g fly agar en een roerstaaf een 1000 ml fles. Dit is Mix A. Autoclaaf Mix A met de kolf deksel losjes afgedekt op een 30 min-sterilisatie cyclus voor vloeibare producten. </li><li> Voeg 125 ml appelsap, 12,5 g tafelsuiker en een roerstaafje in een bekerglas van 500 ml. Dit is Mix B. Heat Mix B op een verwarmde platform roeren en de temperatuur te handhaven op ongeveer 70 ° C tot de autoclaaf van Mix A is voltooid. </li><li> Na de voltooiing van Mix A autoclaaf, transfer Mix B naar Mix A. Blijf roeren het gecombineerde mengsel zachtjes en laat het afkoelen gedurende 15 minuten. Vermijd over-koeling en het resulteerde agar stollen vóór de toevoeging van conserveermiddel. </li><li> Voeg 10% (gewicht / volume) methyl 4-hydroxybenzoaat opgelost in ethanol. Deze zal fungeren als conserveermiddel. Voeg 3,75 ml van de oplossing voor de hierboven appelsap agar-mengsel. Blijf roeren another 5 min. </li><li> Giet 125 ml appelsap-agar mengsel met conserveringsmiddel in elk 300 cm 2 plastic of piepschuim plaat. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur en stollen. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het gieten. Opmerking: Het appelsap-agar platen zijn klaar om direct te gebruiken. Bedek ongebruikte platen met heldere wraps en bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal een week. </li></ol> 2. Drosophila Embryo Collection en Pre-verknopingsbehandeling <ol><li> Laad een bevolking kooi met ongeveer 40.000 tot 50.000 vliegen van waaruit embryo&#39;s worden verzameld. </li><li> Maak twee platen die elk 125 ml standaard maïsmeel-melasse medium 12 en strooi ongeveer 4 g gist gedroogde bakkersgist op elk bord. Plaats deze platen in de kooi bevolking in een 25 ° C incubator gedurende 48 uur om de vliegen vet te mesten. </li><li> 2 warme appelsap-agar platen tot 25 ° C. Strooi ongeveer 1 g gist gedroogde bakkersgist op elkeplaat. Plaats de 2 platen in de kooi bevolking te beginnen met het verzamelen 0-1 hr-oude embryo&#39;s. </li><li> Haal de platen aan het einde van de 1 hr collectie. Vervangen door 2 nieuwe platen als een nieuwe ronde van de collectie nodig. </li><li> Voeg genoeg water om de platen te bedekken en resuspendeer de embryo&#39;s voorzichtig met een fijn penseel. Giet de geresuspendeerd embryo&#39;s door middel van een twee lagen zeef gemaakt van roestvrij staal gaas. Opmerking: De bovenste laag is gemaakt van middelgrote poriegrootte (850 micrometer) gaas waarin grote fly-onderdelen verzamelt terwijl het laten door embryo&#39;s. De onderste laag is gemaakt van fijn gaas (75 micrometer), die embryo&#39;s verzamelt terwijl het laten van door gist en water. </li><li> Gebruik de fijne kwast om de verzamelde embryo&#39;s te zetten in een verzameling mand gemaakt met een 50 ml buis en fijne nylon mesh. Spoel de embryo kort met water en vervolgens dep de maas op keukenpapier te drogen. </li><li> Dompel de embryo&#39;s in 50% bleekwater met zachte wervelende gedurende 3 minuten. Spoel grondigly met water om alle resterende bleekmiddel te verwijderen. Dep het gaas op keukenpapier te drogen. </li><li> Dompel de dechorionated embryo in isopropanol onder zacht schudden gedurende 15 seconden of totdat de afbraak van multi-embryo klonten (dit moet langer dan 30 seconden niet nemen). Dep het gaas op keukenpapier drogen. </li><li> Dompel de embryo&#39;s in heptaan voor 5 min tijdens het gebruik van een pipet om heptaan streamen over de embryo&#39;s om ze geresuspendeerde houden. Dep het gaas op keukenpapier te drogen. </li><li> Spoel de embryo&#39;s met stromen van fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS) die 0,1% Triton X-100 (PBST) gedurende 3 minuten. </li><li> Demonteer de opvangbak en de overdracht van de embryo&#39;s, samen met de mesh om een ​​15 ml buis met 10 ml PBST. Keren de buis voorzichtig om de embryo&#39;s wassen de mesh. </li><li> Verwijder het gaas van de buis. Zet de buis in een verticale positie en laat de embryo zinken naar de bodem van de buis door de zwaartekracht. Opmerking: Ongeveer 100-300ul van embryo&#39;s wordt verwacht voor een 1 uur collectie van de ene kooi. </li><li> Verwijder de PBST en blijven presteren onmiddellijk verknopen. </li></ol> 3. In vivo verknoping van verzamelde embryo <ol><li> Bereid 0,2% formaldehyde in PBST onmiddellijk voor gebruik. Voeg 10 ml formaldehyde fixatief om de embryo&#39;s en incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 10 minuten. Gooi ongebruikte fixatief aan het eind van de dag. </li><li> Doof de crosslinkingsreactie <ol><li> Aan het einde van de verknoping, laat de embryo zinken naar de bodem van de buis. </li><li> Verwijder de formaldehyde oplossing. Voeg onmiddellijk 10 ml 0,25 M glycine in PBST de crosslinking reactie te blussen. Incubeer bij 25 ° C onder zacht schudden op een rondschudapparaat gedurende 5 minuten. </li><li> Laat het embryo naar de bodem van de buis. Verwijder de demping oplossing. Was de embryo&#39;s met 10 ml PBST driemaal. </li><li> Volledig verwijderen van de PBST was-oplossing met een pipet. WINKEL embryo bij -80 ° C tot gebruik. </li></ol></li></ol> 4. Eiwitmonster Voorbereiding en Immunoprecipitatie <ol><li> Meng 500 ul verknoopte embryo met een Dounce homogenisator in 2 ml lysisbuffer (0,5 M ureum, 0,01% SDS, 2% Triton X-100, 2 mM fenylmethaansulfonylfluoride [PMSF] en protease inhibitor cocktail in PBS). Opmerking: Voer deze en de volgende stappen bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. </li><li> Breng de lysaat tot 1,5 ml centrifuge buizen en schud op een roterend platform voor 15 min om een ​​grondige afbraak zorgen. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg gedurende 5 minuten om celresten neer te slaan. Sla de bovenstaande vloeistof in een schone 15 ml buis. </li><li> Voeg 40 ul anti-HA agarose korrels suspensie de supernatant en incubeer op een roterend platform gedurende 2,5 uur. </li><li> Pellet de kralen door centrifugering bij 2500 g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande vloeistof, maar laat passendebatterijvak ongeveer 250 pi in de buis. Resuspendeer de kralen in de resterende supernatant en overbrengen in een 1,5 ml spinkolom met 10 urn poriën filter. </li><li> Centrifugeer de spin kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en de stroom gooi door. </li><li> Was de kralen door het toevoegen 200 ul wasbuffer (0,1 M glycine, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20 in PBS). Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 sec en de was gooi. Herhaal de wasbeurt twee keer. </li><li> Voeg 40 ul elutiebuffer (2 mg / ml HA-peptide in PBS) aan de kralen en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden om de 5 minuten. Centrifugeer de kolom bij 12.000 xg gedurende 10 seconden en vang het eluaat. </li><li> Bevestig elutie van het complex door Western-blotanalyse met anti-HA antilichaam 13. </li></ol>

<ol><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li>
<li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mass+spectrometry+%3A+JMS%22%5BJournal%5D)">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li>
<li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li>
<li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li>
<li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li>
<li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification%2C+but+not+for+posterior+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li>
<li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+RNA-protein+granules%3A+insight+from+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li>
<li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+organelles%3A+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).</li>
<li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+%28U%29-rich+motif+in+its+3%5BTitle%5D)+AND+%22UTR.+Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).</li>
<li>Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthews%2C+KA+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li>
<li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li>
<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694(2006).</li>
<li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Formaldehyde is vaak gebruikt als een verknopende reagens voor het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties. De goede oplosbaarheid en celmembraan permeabiliteit, alsmede de verenigbaarheid met stroomafwaartse massaspectrometrie procedures maken formaldehyde een ideale kandidaat middel voor verknoping intracellulaire toepassingen 3,15-17. In het bijzonder werd met succes gebruikt om mRNA&#39;s geassocieerd met Vasa, een kritische kiemcel RNA helicase in Drosophila 11...

Isolatie van multisubunit verzamelingen van eiwitten en DNA-of RNA-eiwitcomplexen wordt uitgevoerd om eiwitcomplexen, genomische loci die door DNA-bindende regulatorische eiwitten of RNA doelwitten RNA-bindende eiwitten te identificeren. Verschillende methoden is het mogelijk genoom-brede identificatie van DNA-sites herkend door transcriptiefactoren of chromatine-eiwitten (ChIP-seq) 1 en RNA targets gekoppeld aan een bepaalde RNA-bindend eiwit (CLIP-volgende) 2. De bibliotheken van RNA afkomstig cDNA of DNA doelen worden vervolgens diep sequentie. Deze methoden gebruiken chemische of UV geïnduceerde verknoping de complexen gevolgd door immunoprecipitatie (IP) stabiliseren met een antilichaam tegen een eiwit component van het onderzochte complex. Tijdens de ontwikkeling van een organisme, veel eiwitcomplexen vormen transiënt. Daarom is het cruciaal om de samenstelling en functie van deze complexen in vivo analyse om de moleculaire mechanismen die dev beheersen begrijpeneling. Een dergelijke in vivo analyse superieur in vitro benadering is want het is vrijwel onmogelijk om natieve concentraties van de interagerende componenten en cellulaire biochemische omgeving vitro reproduceren. Hier laten we een in vivo benadering die we met succes gebruikt om grote eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo&#39;s. In deze werkwijze worden eiwitcomplexen in levende embryo verknoopt met een lage concentratie van formaldehyde en vervolgens eiwitcomplexen plaats worden geïsoleerd door IP met een antilichaam tegen een bekende component van de complexen gevolgd door gel zuivering van de complexen en massaspectrometrie analyse identificeren onbekende complexe componenten. Aangezien formaldehyde kan de celmembraan doordringen en heeft een verknopende bereik van 2,3-2,7 A 3 kunnen eiwit complexen worden verknoopt in vivo en complexe componenten waarschijnlijk dicht bij elkaar bevinden. In dit artikel gaan webeschrijven deze werkwijze met de isolatie van Tudor (Tud) eiwitcomplex als voorbeeld. Tud een kiemlijn eiwit dat essentieel is voor kiembaan ontwikkeling 4-7. Dit eiwit bevat 11 Tud domeinen bekend om te interageren met brandspiritus arginines of lysinen van andere polypeptiden 8-10. Eerder hebben we een transgene Drosophila lijn die uitdrukt HA-tag functionele Tud 5 en daarom wordt specifieke anti-HA-antistoffen gebruikt om pull-down Tud complex na verknoping gegenereerd. Naast de eiwit-eiwit verknopingen kunnen formaldehyde nucleïnezuur-eiwit crosslinks genereren en wordt gebruikt ChIP-seq experimenten. Verder in Drosophila, in vivo verknoping met formaldehyde kon de identificatie van een RNA-doel van Vasa RNA helicase-eiwit 11. Terwijl in dit artikel beschrijven we een methode voor in vivo verknoping en purcatie van eiwitcomplexen van Drosophila embryo, kan deze methode worden aangepast voor andere organismen en weefsels.

<table><tbody><tr><td>Drosophila agar</td><td>Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td><td>FLY-8020-1</td><td>Bewaar het water en agar mengsel niet te lang in de autoclaaf omdat dit ervoor zorgt dat de appelsap platen broos worden</td></tr><tr><td>Methyl 4-hydroxybenzoaat</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>H5501</td><td>Andere naam: TEGOSEPT</td></tr><tr><td>Populatiekast</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>59-104</td><td></td></tr><tr><td>Fijn nylon gaas</td><td>Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td><td>57-102</td><td>Snij het gaas iets groter dan de opening van de falcon tube kap bij het maken van de opvangbak om een strakke afdichting te garanderen</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>D8938-1SET</td><td>Koel de homogenisator op ijs en spoel voor gebruik voor met koude lysis buffer om eiwitdegradatie te voorkomen</td></tr><tr><td>Protease remmer cocktail&nbsp;</td><td>Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td><td>4693132001</td><td>PBS kan worden gebruikt om een geconcentreerde protease remmer stock oplossing te bereiden</td></tr><tr><td>Anti-HA agarose kralen</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>De kit bevat ook HA-peptide en spin kolommen</td></tr><tr><td>HA-peptide</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Bereid tot 2 mg/ml met PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Spin Kolom</td><td>MBL international (http://www.mblintl.com/)</td><td>561-8</td><td>Spin kolommen zijn opgenomen als onderdeel van de kit</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Heptaan</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>H350-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td><td>AM9625</td><td>Verdun van 10X naar 1X met nanopure water voor gebruik</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0724</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>BioRad (www.bio-rad.com/&lrm;)</td><td>161-0730</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>P7626-1G</td><td>Bereid een 200 mM stock oplossing in isopropanol en verdun vervolgens tot werkconcentratie van 2 mM in lysis buffer</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>15-ml buizen</td><td>USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Clorox merk</td><td></td><td>Verdun met gelijk volume nanopure water om 50% bleekmiddel te maken</td></tr><tr><td>50-ml buizen</td><td>BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Bovenste laag zeef</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1AK</td><td></td></tr><tr><td>Onderste laag zeef</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com/&lrm;)</td><td>04-884-1BA</td><td></td></tr></tbody></table>

een in vivo crosslinking aanpak eiwitcomplexen te isoleren van drosophila embryo&#39;s

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Vele cellulaire processen gestuurd door multisubunit eiwitcomplexen. Veel van deze complexen tijdelijk en vereisen natuurlijke omgeving te monteren. Daarom, om deze functionele eiwitcomplexen identificeren, is het belangrijk om stabilisatie in vivo voor cellysis en daaropvolgende zuivering. Hier beschrijven we een methode om grote bonafide eiwitcomplexen van Drosophila embryo&#39;s te isoleren. Deze methode is gebaseerd op embryo permeabilisatie en stabilisatie van de complexen in de embryo&#39;s door in vivo verknoping met een lage concentratie van formaldehyde, die gemakkelijk de celmembraan kan oversteken. Vervolgens wordt het eiwitcomplex plaats immuungezuiverd gevolgd door gel zuivering en geanalyseerd door massaspectrometrie. We illustreren deze methode gebruik zuivering van een Tudor eiwitcomplex, dat essentieel is voor kiemlijn ontwikkeling. Tudor is een groot eiwit, die meerdere Tudor domeinen bevat - kleinmodules die samenwerken met gemethyleerd arginines of lysinen van target eiwitten. Deze methode kan worden aangepast voor isolatie van natieve eiwitcomplexen van verschillende organismen en weefsels.

De effectiviteit van de verknoping en de succesvolle zuivering van het verknoopte Tud eiwit complex werden geanalyseerd door SDS-PAGE op een 3% - 7% stap gel (in figuur 1), gevolgd door Western blot (figuur 2). Het doel van het gebruik van de 3% - 7% stap gel is gebaseerd op de effectieve scheiding van verknoopte Tud eiwitcomplex van de resterende niet-verknoopte Tud eiwit en concentratie van het complex. Onder onze in vivo verknoping bovengenoemde ...

Multi-component eiwitcomplexen spelen een cruciale rol tijdens de cellulaire functie en ontwikkeling. Hier beschrijven we een methode die wordt gebruikt voor de inheemse eiwitcomplexen isoleren van Drosophila embryo&#39;s na in vivo verknoping gevolgd door zuivering van het verknoopte complexen voor de volgende structuur-functie analyse.

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo&#39;s

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om proteïnecomplexen uit levende drosophila-embryo's te verkrijgen met behulp van een in vivo cross-linking methode. Dit wordt bereikt door eerst duizenden vliegen in een populatiekooi te plaatsen en vroege embryo's te verzamelen. Vervolgens worden de proteïnen in vivo gecrosslinkt met formaldehyde, wat hun interne proteïnecomplexen stabiliseert.Vervolgens worden eiwitextracten bereid uit de gecrosslinkte embryo's, zodat de eiwitcomplexen kunnen worden immunoprecipiteerd. De resultaten identificeren de geïsoleerde eiwitcomplexen middels Western blot-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele isolatie van eiwitcomplexen met in vitro-benaderingen, is dat deze in vivo-benadering ons in staat stelt om transiënte maar functioneel significante eiwit-eiwitinteracties vast te leggen, die mogelijk niet met traditionele in vitro-methoden kunnen worden gedetecteerd.De techniek zal worden gedemonstreerd door Dr. Min Gao, een postdoc uit mijn laboratorium. Meng eerst water en vliegagar met een roerstafje. Autoclaveer dit mengsel tijdens de autoclaafcyclus.Meng sucrose in appels

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een gestroomlijnde protocol voor het genereren van "filet" bereidingen van Drosophila embryo's van bepaalde genotypen. Dit protocol maakt een efficiënte uitvoering van een variëteit van genetische screens. Het maakt ook een uitstekende visualisatie van structuren in de late embryo.

Live-dissectie van Drosophila Embryo&#39;s: Gestroomlijnde methoden voor het screenen Mutant Collections door antilichaam kleuring

De cel permeabele crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionaat)] stabiliseert van voorbijgaande aard en labiele...

Isolatie van labiele Multi-eiwit-complexen door In vivo Gecontroleerde Cellulaire Cross-Linking and Immuno-magnetische affiniteitschromatografie

We beschrijven een methode om aparte organellen door de dichtheid in het...

In-vivo Centrifugeren van Drosophila embryo&#39;s

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Dit protocol toont hoe Proximity Ligatie Assay kunnen worden toegepast voor aantonen in situ eiwit-eiwit interacties bij de Drosophila larven neuromusculaire junctie. Met deze techniek worden Schijven grote en Hu-li tai Shao aangetoond dat een complex in het postsynaptische gebied, een associatie eerder geïdentificeerd door middel co-immunoprecipitatie vormen.

Detectie van In Situ Eiwit-eiwit complexen in de Drosophila Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Dit protocol toont het gebruik van de nabijheidsligatietest om te sonde voor eiwit-eiwitinteracties in situ in de C. elegans kiembaan.

In Situ Detectie van Ribonucleoprotein Complex Assembly in de C. elegans Germline met behulp van Proximity Ligation Assay

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Leer een in vivo cross-linking methode om eiwitcomplexen te isoleren uit Drosophila embryo's. Deze techniek vangt tijdelijke eiwitinteracties met formaldehyde en maakt analyse via Western blot mogelijk.

Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo's

Meer video's verkennen