Een In vivo Crosslinking Aanpak eiwitcomplexen te isoleren van Drosophila Embryo's

Het algemene doel van het volgende experiment is om proteïnecomplexen uit levende drosophila-embryo's te verkrijgen met behulp van een in vivo cross-linking methode. Dit wordt bereikt door eerst duizenden vliegen in een populatiekooi te plaatsen en vroege embryo's te verzamelen. Vervolgens worden de proteïnen in vivo gecrosslinkt met formaldehyde, wat hun interne proteïnecomplexen stabiliseert.

Vervolgens worden eiwitextracten bereid uit de gecrosslinkte embryo's, zodat de eiwitcomplexen kunnen worden immunoprecipiteerd. De resultaten identificeren de geïsoleerde eiwitcomplexen middels Western blot-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de traditionele isolatie van eiwitcomplexen met in vitro-benaderingen, is dat deze in vivo-benadering ons in staat stelt om transiënte maar functioneel significante eiwit-eiwitinteracties vast te leggen, die mogelijk niet met traditionele in vitro-methoden kunnen worden gedetecteerd.

De techniek zal worden gedemonstreerd door Dr. Min Gao, een postdoc uit mijn laboratorium. Meng eerst water en vliegagar met een roerstafje. Autoclaveer dit mengsel tijdens de autoclaafcyclus.

Meng sucrose in appelsap en verhit dit tot 70 °C op een warmteplaat. Combineer later de mengsels en laat ze 15 minuten afkoelen voordat de agar stolt. Maak verse methylether van p-hydroxybenzoëzuur in ethanol.

Dit is het conserveermiddel. Voeg het toe aan het stollingsmengsel en roer het gedurende vijf minuten door. Giet het mengsel vervolgens in plastic of piepschuim platen van 300 vierkante centimeter zonder luchtbellen te vormen.

Bewaar de platen bij vier graden Celsius en gebruik ze binnen een week. Zorg dat een populatiekooi met 40 tot 50.000 vliegen gereedstaat waaruit embryo's kunnen worden verzameld. Bevestig twee verse, met maïsmeel-melasse gevulde platen, met ongeveer vier gram bakkersgist over het oppervlak gestrooid, aan de populatiekooi.

Laat de vliegen 48 uur lang op deze platen leven bij 25 °C. Na twee dagen wordt ongeveer één gram gist over twee appelsapagarplaten gestrooid, waarna de platen in de populatiekooi worden vervangen door deze platen. Na een uur worden de platen in de kooi vervangen door nog eens twee platen van hetzelfde type.

De twee verzamelplaten die de vliegen gedurende een uur hebben gebruikt, zullen embryo's bevatten. Suspendeer de embryo's en het water op de plaat en gebruik een penseel om ze los te maken. Giet ze vervolgens door een zeef met twee lagen.

De bovenste laag bestaat uit een stalen gaas van 850 micron en de onderste laag uit een stalen gaas van 75 micron. De embryo's zullen zich verzamelen op het fijnere gaas en kunnen met een penseel worden gescheiden van het grove debris. Breng de embryo's over naar een fijn nylon gaasmandje, gemaakt van de bovenkant van een conische buis van 50 milliliter.

Spoel de embryo's af met water en droog ze in het gaas tegen een papieren handdoek. Dompel de embryo's vervolgens gedurende drie minuten onder in een 50% bleekoplossing. Draai ze rond in de bleek, spoel ze daarna grondig af met water en dep ze droog.

De embryo's worden vervolgens ongeveer 15 seconden ondergedompeld in isopropanol. Door te draaien worden de klonten embryo's opgebroken; dit mag niet langer dan 30 seconden duren. Dep de embryo's droog en breng ze vervolgens vijf minuten over naar een heptaanoplossing.

Pipette regelmatig heptaan over de embryo's om te voorkomen dat ze samenklonteren, dep de embryo's droog en spoel ze met PBST. Nadat de embryo's drie minuten zijn gespoeld, worden ze op het gaas overgebracht naar een buis van 15 milliliter met 10 milliliter PBST. Verwijder het gaas zodat de embryo's in de oplossing achterblijven en neem een volume van tussen 100 en 300 microliters aan embryo's.

Laat de embryo's naar de bodem zakken, aspireer de PBST en ga onmiddellijk over tot cross-linking om de embryo's te fixeren. Voeg eerst 10 milliliters vers bereide 0,2% formaldehyde in PBST toe aan de embryo's. Laat deze 10 minuten incuberen bij 25 °C onder milde agitatie.

Laat de embryo's na 10 minuten reactietijd zinken en verwijder de oplossing. Vervang de oplossing vervolgens snel door 10 milliliters 0,25 molar glycine in PBST om de reactie te stoppen. Laat de buis nog vijf minuten schudden. Verwijder na het stoppen van de reactie de oplossing en spoel de embryo's drie keer af met telkens 10 milliliters PBST.

Verwijder de resterende PBST via pipetaspiratie en bewaar de embryo's bij -80 °C tot ze nodig zijn. Homogeniseer 500 µL crosslinked embryo's met een homogenisator en 2 mL lysisbuffer. Dit vereist ongeveer 15 slagen met een nauwsluitende stamper.

Breng het lysaat over naar een microcentrifugebuisje en laat dit 15 minuten zachtjes schudden op een rocker. Centrifugeer het lysaat vervolgens 5 minuten bij 16, 000 GS. Breng het supernatant over naar een buis van 15 milliliter.

Het pellet kan worden weggegooid. Voeg nu 40 µL van de anti-HA agarose-bead slurry toe aan het supernatant. Zet dit ongeveer 2,5 uur op de rocker totdat de bead-conjugatie voltooid is.

Centrifugeer de beads bij 2.500 G gedurende vijf minuten om een pellet te vormen. Laat ongeveer 250 µL supernatant in de buis achter en resuspendeer de beads hierin. Breng de gesuspendeerde beads over naar een 10 micron filter op een spincolumn.

Verwijder de oplossing door tien seconden te centrifugeren bij 12.000 Gs. Was de beads op de kolom met 200 µL wasbuffer gevolgd door een centrifugationstap. Herhaal dit in totaal drie keer. Voeg vervolgens 40 µL elutiebuffer toe aan de beads en incubeer deze 15 minuten bij 37 °C.

Schud de buis tijdens deze periode elke vijf minuten voorzichtig om het eluaat op te vangen. Centrifugeer de kolom nogmaals kortstondig bij 12, 000 GS gedurende 10 seconden. De effectiviteit van de crosslinking en de zuivering van crosslinked twee-proteïnecomplexen werd geanalyseerd via SDS-PAGE op een 3-7% stapgel, gevolgd door een western blot. Embryo's die HA-tag en GFP-proteïne tot expressie brachten, werden gebruikt om de mate van crosslinking te monitoren en verschillende formaldehydeconcentraties voor het protocol te testen.

Het grootste deel van het GFP in de behandelde embryo's vertoonde geen crosslinking, waardoor dit niet voorkomt. Willekeurig gecrosslinkte complexen van twee eiwitten werden vergeleken met een niet-gecrosslinkte controle. Twee eiwitten die niet gecrosslinkt zijn, zijn zichtbaar als een band van 285 kilodalton die vrij migreert.

Gecrosslinkt twee is zwaarder en migreert minder in ruw proteinelysaat. Ongeveer de helft van de twee proteïnen was in vivo gecrosslinkt. Interagerende partners die werden geëlueerd met HA-peptide bevatten in vergelijking zowel complex als vrij tube-proteïne in de elutiefractie, na het wassen van de beads.

Nu het SDS is verwijderd, bevindt het grootste deel van de proteïnen zich in vrije vorm in de buis, met minimale vorming van complexen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals massaspectrometrie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de identificatie van proteïnecomponenten in de geïsoleerde complexen.