Name: Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Leer de orofaryngeale intratracheale LPS-toediening en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons in muizen te evalueren. Deze methode maakt nauwkeurige dosering en longdeposities mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de VA-MD Regional College of Veterinary medicine voor het verstrekken van de kern en technische ondersteuning voor dit project. Dit werk wordt ondersteund door een NIH Career Development Award (K01DK092355).

Alle studies werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van de Institutionele Zorg en gebruik Comite (IACUC) voor Virginia Tech en in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Intratracheale (it) Enten van LPS behulp Oropharyngeal Administration <ol><li> Zorg ervoor dat elk dier uniek wordt geïdentificeerd met behulp van een oor punch, oormerk, of andere institutioneel goedgekeurde methode. </li><li> Noteer de basislijn lichaamsgewicht en lichaamstemperatuur voor elk dier. </li><li> Bereid de werkvoorraad van LPS. Elke muis wordt een 50 pl dosis van 1 mg / kg LPS ontvangt 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Mock behandelde dieren wordt een 50 pl dosis 1x PBS ontvangen. </li><li> Bereid een geschikte kamer voor de toediening van isofluraan met de volgende neerzetten. Institutionele richtlijnen verschillen betreffende het gebruik van isofluraan en andere anesthetica en vóór initiating studies, moeten personen contact Vakgroep Dierlijke Care / welzijn van hun instelling te verzekeren de alle richtlijnen adequaat tegemoet wordt gekomen. Als neerzetten isofluraan is geen optie, andere anesthetica zijn aanvaardbare alternatieven. <ol><li> In een geschikte veiligheidskast, gelden ongeveer 3 ml isofluraan een gevouwen absorberende papieren handdoek en plaats in de bodem van een bekerglas van 500 ml. </li><li> Leg een klein stukje aluminiumfolie op de top van de papieren handdoek en dek het bekerglas af met een transparante deksel. </li></ol></li><li> Bereid de instrumenten en reagentia die tijdens de het inenting zal worden gebruikt. Plaats de rubberen band die zullen zorgen de dieren hoofd op de intubatie stand. Deze procedure zal een paar rechte tang, een paar schuine of gebogen pincet en een p200 pipet tips vereisen. </li><li> Load 50 ul van LPS in de pipet tip en plaats in een gemakkelijk bereikbare locatie naast de intubatie stand. </li><li> Verdoven van de muisdoor het plaatsen van de dieren in de isofluraan kamer en die de kamer met het transparante deksel. Observeer het dier ademhaling, die snel en oppervlakkig zal zijn als eerst geplaatst in de kamer. Het dier zal voldoende worden verdoofd bij het ademhalen tarieven benaderen 1 adem / 2 sec, die meestal binnen 30 seconden na het plaatsen in de kamer wordt bereikt. De muis moet worden verdoofd, zoals vermeld in het goedgekeurde protocol met behulp van dierlijke druppel methode isofluraan. </li><li> Verwijder de verdoofde muis uit de kamer en hang het dier op de intubatie vasthouden aan haar voorste snijtanden. Verzekeren dat het dier veilig wordt vastgehouden en de mond en tong zijn toegankelijk. </li><li> Voorzichtig zet de tong met de rechte tang. Pak de tong met de schuine pincet en trek het voorzichtig uit de mond totdat een lichte weerstand voelt. Deze actie is voldoende om de epiglottis blokkeren en toegang tot de luchtpijp krijgen. </li><li> Terwijl u de mond te houden in deuitgestrekte positie, dienen de 50 ul dosis LPS in de achterkant van de keel en meteen daarna neusgaten van het dier met een gehandschoende vinger. De LPS is zichtbaar in de achterkant van de keel tot de muis inhaleert. </li><li> Blijf de neusgaten bedekken en houd de tong verlengd voor 5-10 extra adem. </li><li> Verwijder de muis uit de intubatie stand en plaats het dier terug in een nieuwe kooi totdat deze herstelt van de narcose. </li><li> Monitor surrogaat markers ziekteprogressie. Lichaamsgewicht en lichaamstemperatuur worden gecontroleerd om de 4-8 uur gedurende de duur van het onderzoek. Ook evalueren gedragskenmerken en klinische symptomen geassocieerd met verhoogde morbiditeit. </li><li> Tot ziekteprogressie, oogst muizen evalueren op specifieke tijdstippen na de blootstelling aan LPS. Typische tijdstippen voor oogst na LPS-blootstelling zijn 0, 6, 12, 18, 24 en 48 uur. Om herstel en overleving te evalueren, evalueren de muizen gedurende 7 days post-inenting. </li></ol> 2. Serum en Bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) Collectie <ol><li> Offer de muis met behulp van een institutioneel goedgekeurde methode. </li><li> Leg het dier op zijn rug en zet het om een ​​necropsie boord, ideaal 0.5 inch (1,27 cm) in hoogte. </li><li> Bevochtig de hele muis met 70% ethanol. </li><li> Met behulp van een 1 ml spuit met een 27 G naald, voeren een hartpunctie alvorens tot een incisies. Het moet mogelijk zijn om 500-800 gl volbloed trekken uit een enkele muis. </li><li> Verwijder de naald uit de injectiespuit en het volbloed dragen aan een prelabeled 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor serum verzamelen, zodat het bloed te stollen gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Naast serum verzameling kan deze procedure ook worden gemodificeerd door het opnemen van een anti-coagulant in de buis en spuit vóór verzamelen volbloed, studeren circulerende immuuncellen. </li><li> Maak een horizontale incisie eenkruis van de lengte van de peritoneale holte en een verticale insnijding van de peritoneale holte van de onderkaak van de muis. </li><li> Met behulp van een tang, Pak beide zijden van de incisie en trek de huid weg van de onderliggende peritoneale en thoracale holtes. </li><li> Voeg een grote incisie langs de lengte van de peritoneale holte van de genitaliën het borstbeen en zorg ervoor zaag het membraan. Voorzichtig verschuiven de darmen in de buikholte om de toegang tot een van de nieren mogelijk. </li><li> Snijd de renale ader die naar de nieren te dienen als een afvoerpunt voor perfusie. </li><li> Nick het membraan met een schaar, zorg ervoor dat de longen en het hart te voorkomen, aan de linkerkant van het hart bloot te leggen. </li><li> Handmatig perfuse het hart met behulp van een 10 ml spuit met een 27 G naald en 1x PBS-oplossing. Oefen overmatige kracht tijdens de perfusie zodat de zoutoplossing niet in de longen wordt gedwongen. De overige bloed moet worden afgevoerd uit de poortader incisie.</li><li> Knip de ribbenkast langs het borstbeen met behulp van stompe / botte schaar, zorg om te voorkomen dat het snijden van het hart en de longen. Ongeluk snijden van de longen tijdens deze procedure zal de hoeveelheid BALF verzameld aanzienlijk verminderen en leidt tot een onvermogen om goed opblazen van de longen met fixeermiddel. </li><li> Voorzichtig isoleren hart en longen verwijderd van de ribbenkast behulp van een tang. Snijd zorgvuldig elke sectie van de ribbenkast gebruik stomp / stomp schaar zo dicht bij de wervelkolom mogelijk en volledig te verwijderen beide secties. </li><li> Scheid de speekselklieren met behulp van een tang of verwijder ze met een schaar, om de luchtpijp bloot. </li><li> Snijd voorzichtig de spieren die de luchtpijp bedekken met een schaar. Het is essentieel dat de trachea niet tijdens dit proces worden gesneden. </li><li> Met een schaar, scheiden het sleutelbeen bovenop de luchtpijp. </li><li> Voorzichtig pakt u de thymus behulp van een tang en til het weefsel van het hart. Verwijder de thymus met een schaar, terwijl de zorg voorzaag het hart of de longen. </li><li> Maak een kleine horizontale incisie in de luchtpijp 1-2 ringen onder het strottenhoofd met behulp van schuine schaar (45-90 º hoek, scherp / scherp). De incisie moet groot genoeg zijn om stevig vast de canule zijn. </li><li> Plaats de canule, zodat het taps toelopende einde strekt 2-3 tracheale ringen onder de incisie en zet de canule op zijn plaats met behulp van een zijden hechtdraad. Zorg ervoor dat de hechting verstrijkt tussen de luchtpijp en de slokdarm en wordt strak getrokken op de canule. </li><li> Vul een spuit 1 ml met 1 ml Hanks gebufferde zoutoplossing (HBSS) en breng dan de luer in de canule. </li><li> Met behulp van een langzame, maar constante beweging, injecteer ~ 900 ul in de luchtpijp, het opblazen van de longen, en onmiddellijk in te trekken de HBSS. Plaats de herstelde BALF in een 15 ml conische buis. </li><li> Herhaal deze spoeling 2 extra keer tot ongeveer 3 ml BALF voor toekomstige analyse verzamelen. Bewaar de BALF op ijs of bij 4 º C tot klaar voor gebruik. </li></ol><ol><li> Plaats een spuit 10 ml in de longen inflatie stand. Monteer de slang aan de luer de luer de kraan en de kraan op de spuit. Controleer de kraan in de gesloten stand. De spuit 10 ml zal dienen als een zwaartekracht reservoir. Het reservoir moet worden gehecht aan de inflatie staan ​​4.75 hierboven het dier en de bovenkant van het reservoir moet 10,5 breiden boven het dier. </li><li> Vul de spuit met een neutraal gebufferde formaline-oplossing. Zorg ervoor dat de spuit volledig is gevuld met het fixeermiddel. </li><li> Een absorberende handdoek onder het open uiteinde van de buis en open de kraan om het fixeermiddel om de slang te vullen. Zodra het fixeermiddel begint stroomt uit de slang, onmiddellijk sluit de kraan en vul de spuit aan de top met een fixatief. Het is belangrijk dat de spuit volledig gevuld om de juiste hoeveelheid druk voor long inflatie. </li><li&gt; Langs voorzichtig een tweede stuk hechtdraad onder de luchtpijp, ongeveer 1-2 tracheale ringen onder de rand van de canule. </li><li> Maak een enkele losse knoop in de hechtdraad; echter, de knoop strak niet trekken. </li><li> Steek de slang van de muis inflatie staan ​​in de canule. </li><li> Open de kraan en laat de longen te vullen door de zwaartekracht inflatie. </li><li> Zodra de longen hun maximale inflatie niveau te bereiken, trek de hechtdraad strak en leg een tweede knoop. </li><li> Sluit de kraan en verwijder de slang van de canule. </li><li> Verwijder voorzichtig de canule van de luchtpijp door grijpen de hechtdraad met een pincet en houdt de canule met de vingers. Trek stevig aan de hechtdraad naar beneden richting de borstholte en de canule terug naar de neus van de muis. </li><li> Voorzichtig grijpen de luchtpijp of de hechtingen met een tang en til de luchtpijp van de hals holte. </li><li> Sever de luchtpijp caudaal van de bond hechtdraad behulp botte schaar. </li><li> Zodra de trancheeen vrij is van de onderliggende weefsels, begint de luchtpijp van het muis trekken. Til de longen uit de borstholte. </li><li> Stuurde de bindweefsel die de longen in de borstholte voorzichtig. Trek net de luchtpijp van het lichaam van de muis en breng gestage opwaartse kracht tijdens het snijden van de onderliggende verbindingen. Let er op dat het snijden van de longen. Merk op dat de linker hart moet worden gehecht aan de longen met deze methode. </li><li> Nadat de longen zijn verwijderd, plaats ze in 10 ml gebufferde formaline. </li><li> Verwijderen van een gedeelte van de muis staart voor genotypering. </li><li> Gooi de muis karkas volgens de toepasselijke institutionele richtlijnen. </li></ol> 4. Cytokine Evaluatie <ol><li> Centrifugeer het bloed, in stap 2.5 verzameld bij 12.000 xg gedurende 5 minuten om het serum te isoleren. Breng het serum een ​​prelabeled 1,5 ml microcentrifugebuis en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Evalueer de serum cytokine niveaus door ELISA of andere soortgelijke assay. Verdun het serum 1:05-1:20 in een geschikte verdunning buffer, afhankelijk van de test volgens de instructies van de fabrikant. Deze verdunningen moeten empirisch worden bepaald voorafgaand aan het uitvoeren van het grootste deel van de monsters. </li><li> Door de geringe omvang van serum verzameld, verminderen het monstervolume op de ELISA-plaat geplaatst met de helft. Bijvoorbeeld, de meeste commerciële ELISA&#39;s gebruiken 100 gl hoeveelheden standaarden en monsters. Specimens, belasting 50 pi van normen en verdund serum per well besparen. </li><li> Centrifugeer de BALF in een gekoelde tafelblad centrifuge bij 200 xg gedurende 5 minuten. Breng de celvrije supernatant in twee prelabeled 1,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C. </li><li> Evalueer BALF cytokinen door ELISA of een andere soortgelijke test zonder verdunnen. </li><li> Bewaar ongebruikte serum en BALF bij -80 ° C. </li></ol> 5. Differentiële kleuring en BAL cellulariteit Evaluatie <ol><li> Na BALF centrifugeren en volledige HBSS verwijdering, lyseren het ingehulde rode bloedcellen met behulp van hypotone zoutoplossing. Resuspendeer de cellen in 900 pl gedestilleerd water. Onmiddellijk toevoegen van 100 ul van 10x PBS. </li><li> Individueel lyseren elk monster. Indien monsters bevatten grote hoeveelheden rode bloedcellen, kunnen de cellen worden gepelleteerd in het tafelblad centrifuge bij 400 xg gedurende 5 minuten en de rode bloedcellen lysis protocol kan worden herhaald. </li><li> Bepaal de totale BALF cellulariteit in de suspensie 1 ml met behulp van een hemacytometer onder 10X of 20 X vergroting met Trypan Blue kleuring. Evalueren en presenteren deze gegevens als cellen / ml. </li><li> Bereid materialen voor de Cytospin en differentiële kleuring. Label standaard microscoop dia&#39;s met behulp van een potlood of solventbestendige pen. Maak de dia&#39;s in een cytospin beugel en trechter. Zet de schuif montage in de cytospin rotor. </li><li> Cytospin 150 ui BALF bij 100 xg gedurende 5 minuten. Als de celdichtheid te groot om effectiefevalueren celmorfologie, het volume afgedraaid op de glijbanen verminderen. Laat de dia&#39;s te drogen &#39;s nachts de lucht. </li><li> Differentiële vlek dia na de vervaardiging protocollen. Laat de dia&#39;s te drogen &#39;s nachts de lucht. Dekglaasje dia met Permount en dia evalueren met een microscoop met een 20X en 40X objectief. </li><li> Oogst de resterende cellen voor verdere analyse, zoals FACS, elektronenmicroscopie, confocale microscopie, RNA extractie genexpressie evaluatie en / of eiwit-extractie voor western blot. </li></ol> 6. Histopathologie Evaluatie <ol><li> Bereid de longen voor histopathologie evaluatie. Na 24-48 uur formaline fixatie, ventraal oriënteren geheel opgeblazen longen en ingebed in paraffine. Snijd de resulterende blokken naar de belangrijkste geleidende luchtwegen bloot. </li><li> Om de nauwkeurigheid scoren te verbeteren, de positie van de longen in dezelfde positie en trim elk blok om de maximale lengte-visualisatie van t opleverenhij intrapulmonale belangrijkste axiale luchtwegen. Vanaf dit punt, snijd 5 micron seriecoupes en vlek met hematoxyline en eosine (H &amp; E). Aanvullende secties kunnen worden gesneden en bereid in situ hybridisatie onder toepassing van standaardprotocollen. </li><li> Evalueer histopathologie met een semi-kwantitatieve scoresysteem gebaseerd op de volgende inflammatoire parameters, die zijn ingelopen tussen 0 (afwezig) en 3 (ernstig): mononucleaire en polymorfonucleaire cel infiltratie; luchtwegepitheelcellen celhyperplasie en de schade; extravasatie; perivasculaire en peribroncheolar cuffing; en het percentage van de long betrokken bij ontsteking. Long histopathologie moeten worden geëvalueerd door een ervaren patholoog. </li><li> Gemiddelde van alle van de parameter scores tot een totaal histopathologie score te genereren of te gebruiken individuele scores van specifieke aspecten van progressie van de ziekte te kwantificeren. Over tot alle scoren in een dubbelblind mode, met reviewers blind voor zowel genotype en behandeling. Dit scoresysteem is previousl geweesty beschreven 6,7,10. </li></ol>

<ol><li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report%3A+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li>
<li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+intratracheal+inoculation+method+for+the+study+of+pulmonary+melioidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Infect.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. 2, 164(2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+NLRP3+in+the+development+of+allergic+airway+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of NLRP3 in the development of allergic airway disease in mice.</a> J. Immunol. 188, 2884-2893 (2012).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+NPSR1%2FGPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 291, 1005-1017 (2006).</li>
<li>Kebaier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+alpha-hemolysin+mediates+virulence+in+a+murine+model+of+severe+pneumonia+through+activation+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus alpha-hemolysin mediates virulence in a murine model of severe pneumonia through activation of the NLRP3 inflammasome.</a> J. Infect. Dis. 205, 807-817 (2012).</li>
<li>Roberts, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+murine+immune+response+to+pulmonary+delivery+of+precisely+fabricated+nano-+and+microscale+particles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Analysis of the murine immune response to pulmonary delivery of precisely fabricated nano- and microscale particles.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Willingham, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+%28NALP3%2C+Cryopyrin%29+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation%2C+necrosis%2C+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li>
<li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Med%22%5BJournal%5D)">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li>
<li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

De meest kritische stappen voor succesvolle evaluatie van de immuunrespons in muizenlongen is als volgt: 1) Kies de juiste muizenstam en geslacht van het model geëvalueerd; 2) optimaliseren PAMP levering aan de longen; 3) correct verzamelen en verwerken de BALF; en 4) goed vast te stellen en voor te bereiden van de longen voor histopathologisch assessments. De keuze van de muis stam is een belangrijke factor bij de evaluatie van de immuunrespons. C57Bl / 6 muizen worden doorgaans beschouwd a...

Longinfecties geassocieerd met pathogene bacteriesoorten zijn een veelvoorkomende oorzaak van de opwarming van morbiditeit en mortaliteit. Het bepalen van de mechanismen die de gastheer immuunrespons op deze pathogenen rijden zal de ontwikkeling van nieuwe preventiestrategieën en therapeutische middelen die het effect van deze infecties verminderen bevorderen. Het algemene doel van het hier beschreven protocol is om de gebruiker te voorzien van een flexibele methode voor de gastheer aangeboren immuunrespons op pathogene infectie te evalueren middels een pathogeen geassocieerde moleculaire patroon (PAMP) als een surrogaat voor levende bacteriën. De meeste eerdere studies die de gastheer aangeboren immuunrespons op bacteriën gericht op peritoneale modellen door het relatieve gemak van uitvoering. Hoewel deze modellen zijn zeer nuttig en hebben geleid tot aanzienlijke vooruitgang op het gebied van gastheer-pathogeen interacties en systemische ontsteking, de uit deze modellen gegenereerd gegevens niet altijd geschikt voor studies involving de luchtwegen. Hier wordt een model van acute pulmonale longontsteking voorgesteld als een praktisch en klinisch relevante uitbreiding van de klassieke intraperitoneale (ip) injectie modellen. Deze techniek maakt lokale beoordeling van de aangeboren immuunrespons in een orgaanspecifieke modelsysteem. De hier beschreven methoden zijn ontworpen om een ​​eenvoudige en robuuste techniek zodat gebruikers de gastheer immuunrespons op LPS, wat een gemeenschappelijk PAMP evalueren. De methoden zijn gebaseerd op intratracheale (it) indruppelen van LPS, die een robuuste aangeboren immuunrespons in de longen van muizen en bootst vele pathofysiologische functies waargenomen bij menselijke patiënten die lijden aan respiratoire infecties en acute longschade 1 induceert. Een primair voordeel van deze techniek is dat het de gebruiker de immuunrespons te evalueren zonder verstorende factoren en veiligheidszorgen verbonden aan het in vivo studiesmet behulp van levende bacteriën. Ook de orofaryngeale het beheer blootstellingsroute beschreven in dit protocol heeft belangrijke voordelen ten opzichte van andere vaak gebruikte technieken, waaronder intranasale (in) administratie en chirurgische het bestuur. Bijvoorbeeld, het orofaryngeale toediening kan relatief nauwkeurig doseren en longafzetting ten opzichte van toediening die typisch lijdt aan verhoogde variabiliteit van longdepositie door het verlies van agenten in de neusholte en sinussen 2-4. Het is toedieningsweg omzeilt deze holten en biedt direct toegang tot de luchtpijp en de luchtwegen. Ook de chirurgische aanpak is het een significant meer morbide administratie methode en vereist uitgebreide training te beheersen. De hier beschreven protocollen tevens een beschrijving van de gebruikte technieken en surrogaat markers gebruikt om ontstekingen progressie te evalueren en eindigen met een protocol waarin de juiste technieken voor het bereiden van de lungs voor histopathologie assessments. Deze protocollen zijn gericht op het minimaliseren van het aantal muizen voor elke studie door maximaal gegenereerd uit elke afzonderlijke diergegevens. De beschreven protocollen zijn zeer flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala PAMPs en schade geassocieerde moleculaire patronen (gedempt) te evalueren. Bovendien met een paar extra aanpassingen deze protocollen kunnen ook worden toegepast op studies die allergische luchtwegen ziekteprogressie of gastheer-pathogeen interacties met levende bacteriën, virussen of schimmels 5-10.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>Compact Scale</td><td>Ohaus Scale Corporation</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>Small Animal Rectal Thermometer</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>Rectal Probe for Rodents</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>Ear Punch</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate Buffered Saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td><td>ICAP Manufacturing</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (blunt/sharp)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>forceps (straight)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>forceps (45&ordm;, curved)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>Scissors (blunt/blunt)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (200 &micro;l Capacity)</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD Medical</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD Medical</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0.5 in Needle</td><td>BD Medical</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Silk Braided Surgical Suture</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>Luer to Tube Connector Kits</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>Luer Stopcock Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Formalin Solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1&beta; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF-&alpha; OptEIA ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer Cover Glasses</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnel Clips</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>Cytology Funnels</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>Filter Cards</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glasses</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quick Staining Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>47733150</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

het gebruik van oropharyngeal intratracheaal pamp administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in muizen evalueer

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

De immuunrespons tegen pathogenen is een complex biologisch proces. De meerderheid van de in vivo studies klassiek gebruikt om karakteriseren gastheer-pathogeen interacties profiteer van intraperitoneale injecties van geselecteerde bacteriën of pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) bij muizen. Hoewel deze technieken enorm gegevens in verband met besmettelijke ziekte pathobiology hebben opgeleverd, intraperitoneale injectie modellen zijn niet altijd geschikt voor de gastheer-pathogeen interactie studies in de long. Gebruik makend van een acute longontsteking model bij muizen, is het mogelijk om een ​​hoge resolutie analyse van de gastheer aangeboren immuunrespons gebruik lipopolysaccharide (LPS) te voeren. Hier beschrijven we de methoden LPS beheren via chirurgische orofaryngeale intratracheale toediening bewaken klinische parameters geassocieerd met de ziekte pathogenese en gebruiken bronchoalveolaire lavage vloeistof naar de gastheer immuunreactie te evalueren. De technieken die worden beschrevenzijn breed toepasbaar voor de studie van de gastheer aangeboren immuunrespons op een breed scala van PAMPs en ziekteverwekkers. Ook met kleine modificaties, deze technieken kunnen ook worden toegepast in studies die allergische luchtwegontsteking en farmacologische toepassingen.

De celwanden van gramnegatieve bacteriën bestaan ​​uit LPS, die zeer overvloedig in het milieu. Inademen van LPS in gevoelige menselijke populaties verergert luchtweg reactiviteit en is in staat van triggering een robuust immuun response11. LPS is ook een gemeenschappelijke PAMP in muismodellen om een ​​robuuste aangeboren immuunrespons opwekken. In de hier beschreven het protocol, ontving de muizen een dosis van het LPS geïsoleerd van E. coli (serotype 0111: B4) met behulp van orofaryngeale het bestuur. In mod...

De gastheer immuunrespons op pathogene infectie een strak gereguleerd proces. Met behulp van een lipopolysaccharide long exposure model in muizen, is het mogelijk om hoge resolutie evaluaties van de complexe mechanismen van pathogenese voeren.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van orofaryngeale intratracheale toediening van LPS en bronchoalveolaire lavage aan te tonen om de immuunrespons van de gastheer bij muizen te evalueren. Dit wordt bereikt door de muis eerst te inoculeren met LPS via orofaryngeale toediening. In de tweede stap wordt een tracheale canule ingebracht, waarna bronchoalveolaire lavagevloeistof via de canule wordt verzameld om de lokale ontstekingsrespons te beoordelen.In de laatste stap worden de longen opgeblazen met formaline voor histopathologische beoordeling. Uiteindelijk kunnen het cytokinenprofiel van de darm en de histopathologie van de long worden geanalyseerd om de immuunrespons van de gastheer op LPS te evalueren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals intranasale toediening en chirurgische intratracheale toediening, is dat deze techniek relatief eenvoudig uit te voeren is en een nauwkeurige dosering en longdepositie mogelijk maakt.Injecteer eerst het LPS intratracheaal. Hang een geanestheseerde muis aan een intubatiebuis. Fixeer de muis bij de voortanden, waarbij u ervoor zorgt dat het dier stevig is vastgezet en dat de mo

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Herhaalde metingen van knaagdieren respiratoire fysiologie en bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen wenselijk zijn, maar over het algemeen niet haalbaar. Hier beschrijven we een herhaalbare methode voor het mondeling intuberen muizen dat herhaalde metingen van de luchtwegen hyperreactiviteit en de bemonstering van de luchtwegen ontstekingscellen vergunningen.

Een reversibele, niet-invasieve methode voor Airway Resistance Metingen en bronchoalveolaire lavage Fluid Sampling in Muizen

We illustreren niet-chirurgische levering van testmateriaal in de longen van verdoofde muizen via de luchtpijp. Deze methode laat long blootstelling aan bacteriële en virale pathogenen, cytokines, antistoffen, kralen, chemicaliën of kleurstoffen. We verder beschrijven oogst en verwerking van de longen en longen drainerende lymfeklieren (LDLNs) voor flowcytometrie.

Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie

We hebben een eenvoudige, betrouwbare en relatief goedkope methode voor endotracheale intubatie bij muizen via directe laryngoscopie behulp van een otoscoop met een 2,0 mm speculum ontwikkeld. Deze techniek is atraumatische en kan worden gebruikt voor herhaalde metingen in chronische experimenten. We vinden het superieur aan tracheostomie of eerder gerapporteerde niet-chirurgische technieken.

Luchtpijpintubatie in Muizen<em&gt; Via</em&gt; Directe laryngoscopie behulp van een otoscoop

Intratracheale intubatie-gemedieerde (IMIT) instillatie van reagentia is een uitstekend invasieve methode voor het bestuderen ademhalingsziekte, alsmede een werkwijze voor het indruppelen therapeutische reagentia direct in de longen. Het is een snelle en zeer reproduceerbare werkwijze die geschikt is voor preklinische proeven.

Intubatie-gemedieerde Intratracheaal (IMIT) Blaasinstillatie: een niet-invasieve, Lung-specifieke Delivery System

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

We demonstreren de procedure voor intra-tracheale inoculatie van Haemophilus influenzae in de onderste luchtwegen van muizen. Dit is een zeer nuttige tool om signaleringsroutes te bestuderen die luchtwegontsteking reguleren in muismodellen.

Intratracheale toediening van<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In muismodellen om te studeren luchtwegontsteking

Wij beschrijven hierin de methodologie die we hanteerden om de beschermende werkzaamheid en longimmuunrespons te vergelijken die werd geïnduceerd door intranasale en subcutane immunisatie met BCG in een muismodel. Onze resultaten tonen de voordelen van longvaccinatie aan en suggereren een rol voor IL17-gemedieerde respons in vaccin-geïnduceerde bescherming.

Beschermende werkzaamheid en Pulmonale immuunrespons na subcutane en intranasale BCG Administration in Muizen

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

De gezondheidsstatus van de long wordt weerspiegeld door het type en het aantal immuuncellen die aanwezig zijn in de bronchiolen van de long. We beschrijven een bronchoalveolaire lavage techniek die de isolatie en studie van niet-adherente cellen en oplosbare factoren uit het onderste luchtwegen van muizen mogelijk maakt.

Bronchoalveolaire lavage van meneuze longen om ontstekingscelinfiltratie te analyseren

Hier presenteren we een elegante protocol voor in vivo evaluatie van vaccin effectiviteit en host immuunrespons. Dit protocol kan worden aangepast voor vaccin modellen die studeren virale, bacteriële of parasitische ziekteverwekkers.

Evaluatie van de Host-Pathogen reacties en werkzaamheid van het vaccin in muizen

Hier stellen we een protocol voor intratracheale lipopolysaccharide (LPS) levering via niet-invasieve orofaryngeale endotracheale intubatie. Deze methode minimaliseert het trauma van de chirurgische procedure voor het dier en levert LPS nauwkeurig af aan de luchtpijp en vervolgens aan de longen.

Niet-invasieve intratracheale lipopolysaccharide-instillatie bij muizen

Leer de orofaryngeale intratracheale LPS-toediening en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons in muizen te evalueren. Deze methode maakt nauwkeurige dosering en longdeposities mogelijk.

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer (Video) | JoVE Journal

Het gebruik van Oropharyngeal Intratracheaal PAMP Administratie en bronchoalveolaire lavage om de immuunrespons van de gastheer in Muizen Evalueer

Meer video's verkennen