Transcript en Metabolite Profiling voor de Evaluatie van de Boom en Poplar Tabak als grondstof voor de bio-gebaseerde industrie
16 mei 2014
Plantaardige biomassa biedt een hernieuwbare grondstof voor meerdere producten, waaronder brandstof, diervoeders, levensmiddelen en een verscheidenheid aan materialen. In deze paper onderzoeken we de eigenschappen van de boom tabak (Nicotiana glauca) en populier als geschikte bronnen voor een bioraffinage pijplijn.
Het algemene doel van deze procedure is om metaboliet- en RNA-sequentiegegevens van tabakboombladmateriaal vast te stellen en te optimaliseren voor op systemen gerichte schattingen. Dit wordt bereikt door eerst het biologische materiaal van een ontwikkelingsreeks bladeren te verzamelen. De tweede stap is het uitvoeren van de extractie van het materiaal met behulp van de juiste oplosmiddelen, afhankelijk van de volgende analyse.
Vervolgens worden metabolieten en koolwaterstoffen gemeten met behulp van gaschromatografie, massaspectrometrie of GCMS en worden de transcripten geanalyseerd met behulp van RNA-sequentiegegevensverwerving. Uiteindelijk wordt de combinatie van metabolietprofilering en transcriptionele profilering via RNA-sequentie gebruikt om te laten zien hoe tabakboombladeren lange koolwaterstoffen en andere belangrijke verbindingen ontwikkelen. Deze methode kan worden gebruikt om belangrijke bruikbare metabolieten die in de bladeren van de tabakboom worden gemaakt te identificeren en te kwantificeren.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in het metaboloom van de tabakboom. Het kan ook worden gebruikt voor andere systemen zoals tabak of verwante soorten. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij die methode worstelen omdat tabakboombladeren moeilijk zijn om goed RNA uit te extraheren.
In deze multi Bioo PRO video zie je leden van de FERNA-groep metabolieten extraheren en profileren. Met behulp van GCMS zie je ook een lid van de Fraser Group koolwaterstoffen extraheren en ook een lid van mijn eigen groep die RNA voor RNA-sequentie zal extraheren. Begin met het kweken van neko Oceana Glauca planten in potten met een diameter van 30 centimeter die M twee professioneel kweekmedium bevatten, zoals beschreven in het tekstprotocol om de primaire metabolieten voor te bereiden, oogst de bladeren en stengels van de plant en bevries het materiaal onmiddellijk. Lyofiliseer de bevroren plantmaterialen door drie dagen lang te vriesdrogen, maal vervolgens de lyofilisaatmonsters met een mixermolen met metalen ballen, verdeel de resulterende fijngemalen droge materialen in een twee milliliter centrifugeerbuis of glazen vial. Verdeel vervolgens 10 milligram blad of 20 milligram stengel gedroogd plantaardig materiaal in twee milliliter rondbodembuizen met schroefdop.
Voeg 1,4 milliliter 100% methanol toe en schudden gedurende 10 seconden. Voeg vervolgens 60 microliters rib atol toe als interne kwantitatieve standaard voordat u schudden. Gedurende nog eens 10 seconden, voeg een roestvrijstalen kogel toe en homogeniseer het materiaal met een mixermolen gedurende twee minuten bij 25 hertz, gevolgd door centrifugatie gedurende 10 minuten.
Bij 11.000 keer de zwaartekracht, breng de supernatant over in een glazen vial. Voeg 750 microliter chloroform en 1,5 milliliter water toe voordat u de mix gedurende 10 seconden schudden. Breng vervolgens 150 microliter van de bovenste fase over in een nieuwe 1,5 milliliter centrifugeerbuis.
Droog vervolgens de monsters met behulp van een speed vac. Het is van cruciaal belang dat de monsters gedurende drie tot 24 uur worden gereduceerd tot droogheid totdat er geen restvloeistof meer aanwezig is. Eenmaal droog, voeg 40 microliter methin hydrochloride toe.
Schud vervolgens het mengsel gedurende twee uur op 37 graden Celsius in een horizontale hitteblokschudder. Voeg 70 microliter M-S-T-F-A-mengsel toe voordat u opnieuw schudden gedurende twee uur op 37 graden Celsius. Spin de druppels op het deksel kort voordat u het vloeibare materiaal overbrengt in glazen vialen geschikt voor GC MS-analyse.
Volgend GCMS analyseer data door software te configureren voor de analyse van massaspectrometriegegevens en selecteer de te verwerken data-analyse. Bereid een tabel voor met gedetecteerde pieken van belang in overeenstemming met de verbindingsklasse. Identificeer de pieken door coalitie van standaardverbindingen, annoteer vervolgens gedetecteerde pieken met behulp van massaspectrometrieanalyse, structurele karakteriseringsalgoritmen, literatuuronderzoek en metabolietdatabase zoeken voor koolwaterstofextractie.
Dompel ongeveer 200 milligram vers geoogste ncoa glauco-bladeren in een oplosmiddel gedurende twee tot 20 minuten, verwijder de bladeren en droge oplosmiddelen volledig door middel van rotatievevaporatie. Resuspendeer vervolgens de monsters in een milliliter HPLC-kwaliteit hexaan. Ga door met het uitvoeren van GCM s-analyse van de monsters met behulp van de parameters die in het tekstprotocol worden beschreven.
Verwerk in eerste instantie de componenten van het chromatogram met behulp van een geautomatiseerd MS.Deconvolution en identificatiesysteem en de NIST 98 MS.Library. Bevestig de identificatie van verzadigde lange keten acan koolwaterstoffen door de retentietijd en klassieke fragmentatiepatronen te vergelijken met bekende authentieke standaarden. Bepaal vervolgens koolwaterstoffen kwantitatief door geïntegreerde piekgebieden te vergelijken met dosisresponscurven.
Berekend uit authentieke standaarden, bereken gemiddelden en standaard fouten van de gemiddelden met behulp van Excel-software. Dit protocol combineert TRIOL RNA-extractie met een RN easy-kit om hoogwaardig RNA te verkrijgen. Maal 100 milligram bevroren plantmateriaal in twee milliliter centrifugeerbuizen met een metalen bal door een mixermolen. Na homogenisatie van het monster, voeg na centrifugatie van het materiaal gedurende 10 minuten bij 12.000 keer de zwaartekracht en vier graden Celsius een milliliter triol toe.
Breng de supernatant over in een nieuwe reactiebuis. Voeg 200 microliter chloroform toe en draai de buis vervolgens enkele keren om en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur. Na centrifugatie van het mengsel gedurende 15 minuten.
Zoals eerder, breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe reactiebuis. Voeg ongeveer 2,5 volumes ethanol toe. Draai de buis vervolgens enkele keren om en incubeer gedurende 30 minuten bij minuus 80 graden Celsius.
Verplaats vervolgens het monster inclusief eventueel neerslag naar een spinkolom. Centrifugeer de kolom gedurende 15 seconden bij 8.000 keer de zwaartekracht en gooi de flow-through weg. Voeg 700 microliter wasbuffer RW een, die wordt geleverd in de extractiekit, toe aan de spinkolom en centrifugeer.
Overzicht
Deze studie onderzoekt de eigenschappen van de tabaksboom (Nicotiana glauca) en populier als potentiële bronnen voor een bioraffinage-pijplijn. De focus ligt op het optimaliseren van metaboliet- en RNA-sequencinggegevens van bladeren van de tabaksboom.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Plantbiologie
- Bioraffinageprocessen
- Metabolomics
Achtergrond
- Plantenbiomassa is een hernieuwbare bron voor diverse producten.
- Bladeren van de tabaksboom worden onderzocht op hun metabole eigenschappen.
- Inzicht in metabolietprofielen kan biorefinery-toepassingen verbeteren.
- RNA-sequencing helpt bij het analyseren van genexpressie die gerelateerd is aan de productie van metabolieten.
Doel van de studie
- Het vaststellen van een methode voor het extraheren en profileren van metabolieten uit bladeren van de tabaksboom.
- Het optimaliseren van RNA-sequencing voor transcriptionele analyse.
- Het identificeren en kwantificeren van nuttige metabolieten in bladeren van de tabaksboom.
Gebruikte methoden
- Verzamelen van bladmateriaal van de tabaksboom uit ontwikkelingsseries.
- Extractie van metabolieten met behulp van oplosmiddelen voor daaropvolgende analyse.
- Meting van metabolieten en koolwaterstoffen via gaschromatografie en massaspectrometrie.
- RNA-extractie en sequencing voor transcriptprofilering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en profilering van metabolieten uit bladeren van de tabaksboom.
- Identificatie van lange-keten koolwaterstoffen en andere belangrijke verbindingen.
- Inzichten in het metaboloom van de tabaksboom en de potentiële toepassingen ervan.
- Methode die toepasbaar is op andere verwante soorten.
Conclusies
- De studie biedt een robuuste methode voor de extractie van metabolieten en RNA.
- De bevindingen verbeteren het begrip van de bladontwikkeling van de tabaksboom.
- Potentiële implicaties voor bioraffinageprocessen met gebruik van plantenbiomassa.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode maakt systematische profilering van metabolieten en transcripten in bladeren van de tabaksboom mogelijk, wat de identificatie ondersteunt van langketenige koolwaterstoffen en isoprenoïden die relevant zijn voor de ontwikkeling van bio-gebaseerde grondstoffen. Door GC-MS en RNA-sequencing te integreren, biedt het een basis voor het evalueren van de geschiktheid van plantenbiomassa in duurzame bioraffinaderijprocessen. De benadering helpt bij het verminderen van risico's bij targetvalidatie door metaboliete outputs te koppelen aan transcriptionele activiteit in een ziekterelevant systeem.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk via de correlatie tussen metabolieten en transcripten in de tabaksboom.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het identificeren van functionele routes die betrokken zijn bij de biosynthese van koolwaterstoffen en isoprenoïden.
- Voorspellende waarde: Faciliteert de identificatie van lead-verbindingen door het kwantificeren van bioactieve verbindingen met potentiële industriële relevantie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door reproduceerbare protocollen voor metabolietextractie en -detectie vast te stellen.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie via gestandaardiseerde workflows voor solventextractie, derivatisering en GC-MS-analyse.
- Schaalbaarheid: Maakt hergebruik van het platform bij verwante soorten mogelijk dankzij aanpasbare extractie- en sequenciemethoden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele biomarker-afstemming: Koppelt metabolietprofielen (bijv. lange-keten koolwaterstoffen) aan transcriptionele activiteit, wat de ontdekking van biomarkers in systemen op basis van planten ondersteunt.
- Relevantie voor preklinische modellen: Maakt gebruik van de tabaksboom als ziekterellevant systeem voor het bestuderen van biomassa-accumulatie en stressresponsieve pathways.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Levert kwantitatieve gegevens om go/no-go-beslissingen te informeren bij de selectie van grondstoffen voor bioraffinage-toepassingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode wordt geïntegreerd in vroege discovery-workflows door metabolietprofilering te koppelen aan transcriptionele analyse ter ondersteuning van hypothesegestuurde targetvalidatie en fasen van lead-identificatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door metabolietniveaus te correleren met genexpressiegegevens uit RNA-sequencing.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantificering van metabolieten en koolwaterstoffen via GC-MS met interne standaarden.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve piekoppervlaktegegevens en spectrale outputs die vergelijkende analyse over ontwikkelingsstadia en behandelingscondities mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekkingen met preklinische continuïteit door metaboliet-transcriptrelaties te identificeren die voorspellend zijn voor het nut van biomassa.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor metaboliet- en transcriptprofilering dat toepasbaar is op andere plantensoorten in bioraffinage-pipelines.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via multi-omics correlatie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid via gestandaardiseerde protocollen voor extractie, derivatisering en sequencing.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door kwantitatieve metaboliet- en transcriptgegevens te leveren voor de prioritering van grondstoffen.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogestuurde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van gevalideerde biomarker-achtige outputs in plantensystemen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de extractie van plantmetabolieten, het bedienen van GC-MS en de beoordeling van RNA-integriteit.
- Afhankelijk van toegang tot GC-MS, HPLC, mengmolens, speed vacs en infrastructuur voor RNA-sequencing.
- Vereist standaardisatie tussen teams van oplosmiddelvolumes, centrifugeringsparameters en derivatisatietijden.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan variërende hardheid van plantweefsel en metabolietstabiliteit tussen soorten.
- Beperkt tot goed gekenmerkte metabolieten vanwege de afhankelijkheid van referentiedatabanken voor annotatie, zoals vermeld in de bron.
