Name: Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer gelijktijdige meting van vesiculaire en cytosolische pH in levende cellen met behulp van confocale microscopie en fluorescerende probes. Deze methode biedt inzicht in intracellulaire pH-dynamica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Gilles Dupuis voor het kritisch lezen van het manuscript.
Financiering
Dit werk werd ondersteund door de Canadian Institutes for Health Research, subsidie # MOP-126173. C.M.D is lid van het door Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) gefinancierde Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

1. Bereiding van oplossingen voor Cellulaire pH kalibratie <ol><li> De volgende verbindingen vijf afzonderlijke 50 ml conische buizen 5 oplossingen worden gebruikt voor kalibratie bereiden: <ul><li> NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g in 10 ml H2 0) </li><li> KCl (6,75 ml van 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g in 10 ml H2 0) </li><li> Glucose (1 ml 1 M D-glucose) (1 M D-glucose = 1,80 g in 10 ml H2 0) </li><li> MgS0 4 (0,05 ml 1 M MgSO4) (1 M MgSO4 = 1,20 g in 10 ml H2 0) </li><li> 20 mM HEPES (1 ml 1 M HEPES) (1 M HEPES = 2,38 g in 10 ml H2 0) </li><li> CaCl2 (0,05 ml 1 M CaCl2) (1 M CaCl2 = 1,47 g in 10 ml H2 0) Bereid alle oplossingen met tweemaal gedestilleerd H 2 O (DDH 2 O). </li></ul></li><li> Voltooi elke oplossing met 35 ml van DDH 2 O en meng met een magneetroerder tot zolutie wordt bereikt. </li><li> Stel de pH van elke oplossing met 1 N KOH of 1 N HCl tot pH-waarden van 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 en 7,5 te verkrijgen. Pas vervolgens het volume met gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 50 ml. </li><li> Maatregel 5 mg nigericine toevoegen aan 670 ul van absolute EtOH een 10 mM bereiden nigericine stamoplossing. Let op: nigericine is zeer giftig en moet met grote zorg (handschoenen, een veiligheidsbril en masker) worden behandeld. Meng de oplossing door omkeren totdat de nigericine volledig is opgelost. </li><li> Voeg 0,05 ml 10 mM nigericine (eindconcentratie 10 uM) aan elk van de ijkoplossingen. Nigericine een ionofoor die celmembraan permeabiliteit verhoogt en veroorzaakt equilibratie van intracellulaire en extracellulaire pH in de aanwezigheid van een depolariserende concentratie extracellulair K +. </li><li> Kalibratieoplossingen kan worden opgeslagen tot 1 maand bij 4 ° C </li></ol> 2. Celpreparaat <ol><li> Onder een biologische Safety kap zaad cellen in 35 mm x 10 mm kweekschalen in 2 ml kweekmedium gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum en antibiotica. Gebruik de hoeveelheid cellen die nodig is om ongeveer 50% confluentie waarborgen na 24 uur. OPMERKING: In onze experimenten gebruiken we de HT-1080-cellijn en plaat 1 x 10 5 cellen per cultuur schotel. </li><li> Bepaal het aantal kweekschalen nodig voor het experiment en plaat 5 extra kweekplaten worden gebruikt voor kalibratie. </li><li> Plaats kweekschalen in een 37 ° C / 5% CO2 incubator gedurende ten minste 24 uur. </li></ol> 3. Bereiding van pH-gevoelige probes <ol><li> Bereid een 1M voorraad oplossing van het fluorescerende pH sonde 8-hydroxypyreen-1, 3,6 trisulfonzuur, trinatriumzout (HPTS / pyranine) in DDH 2 0. Deze oplossing moet worden bewaard bij kamertemperatuur en beschermd tegen licht. </li><li> Bereid een voorraadoplossing van 1 mM 5 - (en-6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethylester acetaat (C-SNARF-01:00; genoemd thereafter SNARF-1) door het oplossen van 1 mg SNARF-1 in 1,76 ml DMSO. Meng grondig door herhaald pipetteren. SNARF-1 oplossing moet worden bewaard bij -20 ° C en beschermd tegen licht. </li></ol> 4. Cell Labeling <ol><li> Zestien uur voor levende cellen beeldvorming, voeg 2 pl 1 M HPTS stamoplossing (eindconcentratie 1 mM) aan elke kweekschaal met 2 ml compleet medium. </li><li> De terugkeer van de cultuur schalen in de broedstoof. De HPTS sonde cel-impermeant, dus label organellen de sonde moet door pinocytose worden genomen. Deze voorwaarde vereist dat de mobiele incubaties met HPTS worden uitgevoerd in-serum aangevuld kweekmedium. </li><li> Na incubatie met HPTS Was de cellen tweemaal met steriele PBS en voeg 2 ml serumvrij medium gedurende minstens 2 uur. Incubatie met SNARF-1 heeft in serumvrij medium worden uitgevoerd omdat serum de opname van de probe kan voorkomen. </li><li> Voeg 10 ul van een 1 mM SNARF-1 stock oplossing af te verkrijgenspronkelijke concentratie van 5 uM en laat cellen geïncubeerd gedurende 20 min bij 37 ° C, bij schemering. C-SNARF-1 concentratie en incubatietijd kan variëren afhankelijk van celtype. </li><li> Aan het einde van de incubatie, wassen cellen tweemaal in steriel PBS en voeg 2 ml serumvrij medium. </li></ol> Toevoeging van pH modulatoren 5. <ol><li> Om te beoordelen of de methode pH veranderingen kan detecteren in cellen kunnen verschillende reagentia die intracellulaire pH moduleren worden gebruikt: <ul><li> Bafilomycine A1, een specifieke remmer van V-ATPase 5 </li><li> Na + / H + exchanger isovorm 1 (NHE-1) 6 </li><li> NH4Cl, een zwakke base die intracellulaire pH 7 verhoogt </li></ul><ol><li> Bereid voorraadoplossingen van de bovengenoemde reagentia: <ul><li> Bafilomycine A1: voeg 10 ug bafilomycine A1 tot 160 pl van DMSO om een ​​voorraad oplossing van 100 urn </li><li> EIPA: voeg 25 mg van het EIB naar 1,67 ml methanol aan obtaina eindconcentratie van 50 mM </li><li> NH4Cl: Los 0,53 g ammoniumchloride in 10 ml DDH 2 O tot een eindconcentratie van 1 mM te verkrijgen. </li></ul> Opmerking: Alle stockoplossingen moeten bij 4 ° C bewaard behalve bafilomycine A1 die moeten worden opgeslagen bij -20 ° C en beschermd tegen licht. </li><li> In afzonderlijke kweekschalen, voeg een van de reagentia zoals hieronder beschreven: <ul><li> 2 ui 100 uM bafilomycine A1 (eindconcentratie 100 nM) </li><li> 1 ui 50 mM EIB (eindconcentratie 25 uM) </li><li> 40 gl 1 M NH4CI (eindconcentratie 20 mM) </li></ul></li><li> Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. </li></ol></li><li> Ga verder met beeldopname. </li></ol> 6. Specificaties van de live-cell imaging microscoop en Acquisitie Instellingen <ol><li> Live-cell imaging met behulp van een 40x objectief gemonteerd op een spectrale omgekeerde scanning confocale microscope uitgerust met een gemotoriseerde XY podium, een kamer die glazen bodem cultuur gerechten biedt in een gecontroleerde omgeving (temperatuur, luchtvochtigheid, CO 2) stage incubator. </li><li> De confocale instrument (Olympus FV1000) die hier gebruikt is uitgerust met: <ul><li> Een diodelaser 405 nm </li><li> Een 40 mW argon laser (458 nm, 488 nm, 515 nm) </li><li> Een helium neon laser (543 nm) </li><li> Fluoriet 10x objectief, NA0.4 </li><li> Een LUCPLFLN 40X objectief, NA0.60 </li><li> Een PLAPONSC PLAN APO 60x olie doelstelling, NA1.4 </li><li> Een dichroïsche spiegel DM 405/458/488/543 </li><li> Een SDM 560 en een SDM 640 koudlichtfilters </li><li> Een BA655-755 barrièrefilter </li><li> Een beam splitter BS20/80 </li><li> Data analyse software voor het verwerven en analyseren, </li></ul></li><li> Zodra het podium couveuse opgewarmd is tot 37 ° C en de microscoop is ingesteld, plaats een cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1 in de confocale fase beeldvorming kamer. </li><li> Eenfter lokaliseren van een gebied van belang, past u de aanschaf van software instellingen Figuur 1. <ul><li> Instellen van twee virtueel kanaal sets. </li><li> Inleiding van de eerste fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 405 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 570-600 nm. </li><li> Inleiding van de tweede fase die overeenkomt met HPTS excitatie bij 458 nm en emissie collectie bij 505-525 nm en SNARF-1 excitatie bij 543 nm en emissie collectie van 640-650 nm. </li><li> De confocale diafragma wordt ingesteld op 175 urn standaard en optimale diafragma moet handmatig worden ingesteld op 300 pm. </li><li> Neem Afbeelding door het stapelen van seriële horizontale optische secties (800 x 800 pixels) van 0,4 micrometer dik. </li></ul></li></ol> OPMERKING: Een 40X doelstelling is handig om meerdere cellen tegelijk te observeren en werkt goed voor organel bekijken. Echter, ruimtelijke resolutie en de intensiteit van het signaal zijn better bereikt door een 60X objectief olie. Bovendien is er geen excitatie of emissie overspraak tussen de twee kleurstoffen. 7. Kalibratie van pH-sensing Probes <ol><li> Alvorens te kalibreren, verwijder medium van de cultuur schotel eerder geïncubeerd met HPTS en SNARF-1, twee keer wassen met steriele PBS en voeg vervolgens 2 ml van een van de vijf ijkoplossingen. </li><li> Plaats de cultuur schotel in de confocale fasekamer. </li><li> Ga verder met time-lapse beeldacquisitie volgens de volgende instellingen: <ol><li> Stel het aantal beelden en intervalduur tijden voor het experiment. OPMERKING: We gebruiken meestal een 1 min interval tussen opnamen maximaal 30 minuten. </li><li> Programmeer de sluiter te sluiten tussen de verwerving van elk beeld. </li></ol></li><li> Noteer de fluorescentie-intensiteit per min in een spreadsheet software en bepaalt het tijdstip waarop fluorescentie-intensiteit is stabiel. Intracellulaire pH meestal stabiel na 15 - 20 minuten. </li><li> Repeat stappen 7,1-7,4 met behulp van een nieuwe cultuur schotel voor elke resterende kalibratie-oplossing. </li></ol> 8. Data Acquisition <ol><li> Na kalibratie is uitgevoerd verkrijgen voorbeeldgegevens 4-5 willekeurige velden met 15-20 cellen per veld. Twee beelden worden verkregen voor elk veld: een voor HPTS etikettering (blaasjes) en de tweede voor SNARF-1 etikettering (cytosol). </li><li> Achtergrond fluorescentie (extracellulair gebied) wordt digitaal afgetrokken van fluorescerende beelden van beide sondes. Gelabelde blaasjes en cytosol van hun opgeslagen beelden worden geselecteerd met een binair masker. Voor elke pH-sonde, worden fluorescentie-intensiteiten gemeten op een numerieke schaal (0-4,095 grijswaarde schaal). Een gemiddelde intensiteit voor pixels in het organel of cytoplasma wordt berekend en de waarden worden gebruikt om fluorescentie ratio te berekenen. </li></ol> 9. Data Analysis <ol><li> Verschillende software pakketten zijn commercieel beschikbaar voor data-analyse. DwzFluoView Software. </li><li> In een spreadsheet plaat waarden en berekent fluorescentie verhoudingen als volgt: Bij HPTS, R = (V 458 nm / 405 nm F) en, bij SNARF-1, R = (V 644 nm / 584 nm F ). </li><li> Plot de gegevens met behulp van wetenschappelijke grafische software zoals GraphPad Prism. De curve moet fluorescentie ratio&#39;s (Y-as) te beelden als functie van de pH (X-as). Curve fitting wordt bereikt met behulp van niet-lineaire regressie. </li><li> Verzamel fluorescentie-intensiteiten van de monsters zoals beschreven in stap 8.2 en bereken fluorescentie ratio. Gebruik kalibratiecurven verhoudingen transformeren tot pH-waarden. </li></ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflict gedeclareerd.

Kwantitatieve meting van de pH in levende cellen beeldvorming van verschillende cellulaire compartimenten nodig pH variaties in celreacties op externe uitdagingen te meten. Een van de belangrijkste hindernissen die overblijft is gemakkelijk en specifiek richten cellulaire compartimenten. In dit verband hebben enkele studies gewezen op het gebruik van HPTS als intracellulaire pH indicator geïntroduceerd in cellen door elektroporatie of microinjectie 8-10. Deze technieken lijden aan ernstige nadelen, namelijk e...

<table><tbody><tr><td>Oplossingen voor kalibratie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose (dextrose)</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloridedihydraat</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nigericine</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>Toxisch bij inademing of bij contact met de huid</td></tr><tr><td colspan="4">Beschermd houden tegen licht bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Kweekschotels &empty; 35mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>pH-sensor sondes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuur (HPTS)</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>Uit de buurt van licht houden bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>5-(en-6)-Carboxy SNARF&reg;-1, Acetoxymethyl Ester, Acetaat</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>Uit de buurt van licht en vocht houden bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Dimethyl sufoxide (DMSO)</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&nbsp;</td><td>Schadelijk</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Breng tot 1 L</td></tr><tr><td>Autoclaveer en pas pH aan tot 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40.5 g</td></tr><tr><td>Gedeïoniseerd water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Breng tot 5 L</td></tr><tr><td>pH modulatoren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bafilomycine A1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchloride</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

gelijktijdige meting van de ph in endocytische en cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellulair pH wordt strikt geregeld en er zijn verschillen in pH tussen het cytoplasma en organellen gemeld1. Regulering van cellulair pH is cruciaal voor homeostatische controle van fysiologische processen die omvatten: eiwit-, DNA- en RNA-synthese, vesiculair transport, celgroei en celdeling. Veranderingen in cellulaire pH-homeostase kunnen leiden tot schadelijke functionele veranderingen en de progressie van verschillende ziekten bevorderen2. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het meten van intracellulair pH, maar zeer weinig hiervan staan gelijktijdige meting van pH in het cytoplasma en in organellen toe. Hier beschrijven we in detail een snelle en nauwkeurige methode voor de gelijktijdige meting van cytoplasmatisch en organellair pH door gebruik te maken van confocale microscopie op levende cellen3. Dit doel wordt bereikt met behulp van twee pH-gevoelige ratiometrische kleurstoffen die selectieve celcompartiment-verdeling hebben. SNARF-1 bijvoorbeeld is gecompartimentaliseerd binnen het cytoplasma, terwijl HPTS gecompartimentaliseerd is binnen endosomale/lysosomale organellen. Hoewel HPTS gewoonlijk wordt gebruikt als een cytoplasmatische pH-indicator, kan deze kleurstof specifiek vesiculen langs de endosomale-lysosomale route markeren na opname door pinocitose3,4. Met behulp van deze pH-gevoelige sondes is het mogelijk om tegelijkertijd pH binnen de endocytische en cytoplasmatische compartimenten te meten. De optimale excitatiegolflengte van HPTS varieert afhankelijk van de pH, terwijl voor SNARF-1 de optimale emissiegolflengte varieert. Na belasting met SNARF-1 en HPTS worden cellen gekweekt in verschillende pH-gekalibreerde oplossingen om een pH-standaardcurve voor elke sonde te construeren. Celbeeldvorming door confocale microscopie maakt het mogelijk om artefacten en achtergrondruis te elimineren. Vanwege de spectrale eigenschappen van HPTS is deze sonde beter geschikt voor meting van het licht zure endosomale compartiment of om alkalinisering van de endosomale/lysosomale organellen te demonstreren. Deze methode vereenvoudigt data-analyse, verbetert de nauwkeurigheid van pH-metingen en kan worden gebruikt om fundamentele vragen te beantwoorden met betrekking tot pH-modulatie tijdens celresponsen op externe uitdagingen.

Voor de gelijktijdige meting van pH in zowel intracellulaire en endosomale / lysosomale compartimenten cel, werden de ratiometrische fluorescentie pH-sensing probes Snarf-1 en HPTS gebruikt. SNARF-1 is beperkt tot de cytosolische compartiment terwijl HPTS laat ratiometric pH-meting van de endosomale / lysosomale compartiment. Cel laden met HPTS 16 uur laat zijn selectieve lokalisatie in endosomes / lysosomen 4. Een typisch voorbeeld van fluorescentie opgenomen van HT-1080 cellen opgeladen met de pH-gevoelige ...

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om intracellulaire pH te meten, maar zeer weinig van deze laten gelijktijdige meting van cytoplasmatisch en organellair pH toe. Hier beschrijven we in detail een snelle en nauwkeurige methodologie om gelijktijdig cytoplasmatisch en vesiculair pH te meten door middel van ratiometrische beeldvorming van levende cellen.

Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om gelijktijdig de pH van vesicles en het cytosol in levende cellen te meten met behulp van confocale microscopie. Dit wordt bereikt door de cellen eerst te incuberen met de pH-sensoren HPTS en SNF F1, die respectievelijk de endosomale en lysosomale compartimenten en het cytosol labelen. Vervolgens worden de cellen in een gecontroleerde milieukamer onder een confocale microscoop geplaatst, en wordt de software ingesteld om de fluorescentie van de probes in de kamer te meten.De cellen worden geïncubeerd met verschillende pH-gekalibreerde oplossingen. Er wordt een pH-standaardcurve opgesteld met behulp van een niet-lineaire regressie. Voor beide probes worden exponentiële vergelijkingen bepaald, die vervolgens worden gebruikt om fluorescentie-intensiteiten van monsters om te zetten in pH-waarden.Deze methode maakt de bepaling van de vesiculaire en cytosolische pH uit monsters na diverse behandelingen mogelijk en kan de studie naar de regulatie van de intracellulaire pH tijdens biologische processen faciliteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor het meten van de intracellulaire pH is dat onze methode de meting van intracellulaire pH-dynamiek in levende cellen mogelijk maakt, terwijl artefacten en achtergrondruis tijdens de beeldvorming worden geëlimineerd. De procedure zal worden gedemonstreerd door fess lucier, de promovendus die deze methode heeft ontwikkeld. Voor de cellulaire pH-kalibratie is het noodzakelijk om een reeks van vijf oplossingen van 50 milliliter te maken, variërend van pH 5,5 tot 7,5 in stappen van 0,5.Voeg druppelsgewijs een normale kaliumhydroxide- of zoutzuuroplossing toe om de pH-waarden in te stellen. Voeg vervolgens aan elke pH-gekalibreerde oplossing 0,05 milliliter IOR gersin toe. Bij 10 millimolar voor een eindconcentratie van 10 micromolar zal risin de celmembraanpermeabiliteit verhogen in aanwezigheid van depolariserende concentraties extracellulair kalium; zaai onder een zuurkast cellen uit in 35 millimeter kweekschalen met twee milliliter medium dat 10% foetaal runderserum en antibiotica bevat, met als doel een confluentie van 50% te bereiken na 24 uur incubatie bij 37 graden Celsius.Nadat alle benodigde platen voor het experiment zijn gezaaid, worden er vijf extra platen gezaaid voor de kalibratie. Incubeer deze platen gedurende 24 uur, 24 uur later, en 16 uur voor de beeldvorming. Voeg de volgende ochtend, ongeveer drie uur vooraf, twee microliter van de organelmarker HPTS met een concentratie van 1 M toe voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM HPTS in de oplossing.Vóór de beeldvorming. Verwijder de HPTS door twee keer te wassen met PBS. Voeg vervolgens twee milliliters serumvrij medium toe en laat de cellen nog ten minste twee uur incuberen.Incubeer de cellen vlak voor de beeldvorming met 5 µM snf door 10 µL van 1 mM snf toe te voegen, gevolgd door één incubatieperiode met SNF. Was de cellen twee keer met PBS en voeg 2 mL serumvrij medium toe, en ga vervolgens over tot de beeldvorming van de cellen.De beeldvorming van de cellen dient te worden uitgevoerd met een spectrale inverterende scanning confocale microscoop, uitgerust met een gemotoriseerde tafel en een omgevingskamer. Bij gebruik van plastic petrischalen is een 40x objectief het meest geschikt. De software moet worden ingesteld op twee virtuele kanaalsets, waarbij de excitatiegolflengte en emissiegolflengten worden aangepast.Voor HPTS en SNF 1 staat de confocale apertuur standaard ingesteld op 175 micron, maar de optimale apertuur moet handmatig worden ingesteld op 300 micron. Zodra de kamer is opgewarmd tot 37 °C, start u de kalibratie, wast u een plaat met cellen nog twee keer met PBS en vervangt u vervolgens het medium door de eerste kalibratieoplossing. Plaats nu de cellen in de kamer en kalibreer beide pH-gevoelige kleurstoffen; neem tot 30 time-lapse beelden op met intervallen van één minuut.Elke beeldstapel kan worden verzameld met een dikte van 0,4 micron en 800 vierkante pixels. Tussen de beelden door moet de sluiter zo worden geprogrammeerd dat deze gesloten blijft. Noteer elke minuut de fluorescentie-intensiteit, die gewoonlijk na ongeveer 20 minuten stabiliseert.Zodra de fluorescentie is gestabiliseerd, worden er beelden genomen van vier of vijf velden die 15 tot 20 cellen en beide probes bevatten. Deze beelden worden gebruikt voor de berekeningen van de curve. Herhaal dit proces voor elke kalibratieoplossing.Ga vervolgens over tot het afbeelden van de platen van de experimentele conditie waarvoor geen wasstappen nodig zijn. Trek bij de analyse van elke afbeelding eerst digitaal de achtergrond van de extracellulaire fluorescentie af. Selecteer vervolgens gelabelde blaasjes en cytosol uit de opgeslagen beelden met behulp van een binair masker. Voor elke pH-sensorprobe worden de fluorescentie-intensiteiten gemeten op een schaal van 0 tot 4.095.Bereken de gemiddelde intensiteit voor alle pixels in het organel of het cytoplasma. Gebruik deze waarden om de fluorescentieverhoudingen voor HPTS en voor snf te berekenen. Zet voor de kalibratiecurven de verkregen fluorescentieverhoudingen voor elke kalibratieoplossing uit als functie van de pH; de fitting van de kalibratiecurve moet worden uitgevoerd met een exponentiële vergelijking.Gebruik tot slot de kalibratiecurves om de ratio's om te zetten in pH-waarden en verkrijg zo de cytosolische en organelspecifieke pH-waarden in levende cellen onder experimentele omstandigheden. Er werd duidelijk bewijs gevonden dat HPTS zowel endosomale als lysosomale compartimenten labelt door middel van co-kleuring met Alexa 546-geconjugeerd transferrine om endosomen te kleuren of met een fluorescente lysotropische probe, LysoTracker.Deep red time-lapse beelden werden verzameld voor elke probe zoals beschreven in HT 10 80 cellen. Vijf kalibratie-oplossingen werden getest op fluorescentiestabiliteit na 15 minuten in de oplossingen, zoals met oplossingen van pH 6 en pH 7,5. In de kalibratiecurve voor een bepaalde pH representeren de gegevens de ratio van fluorescentie-intensiteiten bij 558 en 405 nanometer voor HPTS of 644 en 584 nanometer voor SNF 1. Beide curves werden gefit met een exponentiële vergelijking.De efficiëntie van de methode in live HT 10 80 werd geëvalueerd met behulp van ammoniumchloride, een zwakke base die de intracellulaire pH verhoogt. De base verhoogde de pH van zowel het cytosol als de vesikels. De methode werd daarnaast geëvalueerd met B mycin, A one, een inhibitor van va a TPAs bamy, A one induceerde alkalinisatie van zowel de endosomale als de lysosomale compartimenten, maar veranderde de cytosolische pH niet.Ten slotte werd EIPA, een remmer van NHE1, getest. Dit veroorzaakte verzuring van het cytosol tot een pH van 6,62, maar had tot nu toe geen effect op de pH.De studie naar cellulaire pH-homeostase werd beperkt door zowel de snelle pH-veranderingen die binnen cellen plaatsvinden, als door een gebrek aan instrumenten om de pH binnen cellen te bestuderen. We beschrijven vandaag een eenvoudige stapsgewijze aanpak om gelijktijdig zowel de cytosolische als de endosomale pH in individuele levende cellen te meten. Dit is vooral belangrijk voor de studie naar cellulaire pH-homeostase in cellen waarbij mutaties of geneesmiddelen de instroom en uitstroom van protonen binnen het endosomale compartiment kunnen beïnvloeden.

simultaneous-ph-measurement-endocytic-cytosolic-compartments-living

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

The video demonstrates the simultaneous measurement of intracellular calcium levels and changes in membrane potential in endothelial cells of mouse cerebral artery segments. The isolated endothelial tube is loaded with a fluorescent calcium indicator and treated with a drug that induces intracellular calcium release, resulting in a change in membrane potential. The indicator's fluorescence enables the measurement of calcium levels, and a recording electrode is inserted into a cell to measure...

Simultaneous Measurement of Intracellular Calcium and Membrane Potential in a Mouse Cerebral Endothelium

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Phagosomale pH beïnvloedt fagosoombeschikking, oxidatiemiddelproductie, fagosomale doding en ook antigeenpresentatie. Hier beschrijven we een ratiometrische methode voor het meten van tijdsverloop en eindpunt-pH-veranderingen in individuele fagosomen in levende fagocyten met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Meten phagosome pH door Ratiometrische fluorescentie microscopie

Dit manuscript beschrijft een eenvoudige methode om de pH en phagosomal gebied en het cytoplasmatische pH van mens en muis neutrofielen via de ratiometrische indicator seminaphthorhodafluor (SNARF) -1 of S-1 te meten. Dit wordt bereikt met behulp van levende cellen confocale fluorescentie microscopie en beeldanalyse.

Beeldvorming van de neutrofielen phagosome en cytoplasma Met behulp van een Ratiometrische pH Indicator

Mitochondriën kan de elektrochemische potentiaal over hun binnenste membraan (Δ Ψm) te gebruiken om calcium sekwestreren (Ca 2+), waardoor ze vorm te geven cytosolische Ca 2+ het signaleren binnen de cel. We beschrijven een werkwijze voor het gelijktijdig meten van mitochondriën Ca2 + opname en ΔΨ m in levende cellen met fluorescerende kleurstoffen en confocale microscopie.

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Labelen van de extracellulaire domein van een membraaneiwit met een pH-gevoelige fluorofoor, superecliptic pHluorin (SEP), maakt lokalisatie, expressie en mensenhandel worden bepaald. Imaging september-gemerkte eiwitten met totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) maakt de kwantificering van eiwitniveaus in de perifere ER en plasmamembraan.

Gebruik makend van pHluorin-gelabeld receptoren Monitor subcellulaire lokalisatie en handel

Dit protocol wordt een nieuwe methode voor de kwantitatieve visualisatie van complexe vorming van SNARE-eiwitten, gebaseerd op Förster resonance energie-overdracht en levensduur van de fluorescentie microscopie imaging waardoor beschreven.

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Hier gedemonstreerd zijn protocollen voor het isoleren van (1) vers intact cerebrale endothelial "buizen" en (2) gelijktijdige metingen van endothelial calcium en membraanpotentiaal tijdens endotheel afkomstige hyperpolarisatie. Verder, deze methoden toestaan voor farmacologische tuning van endothelial cel calcium en elektrische signalering als individuele of interactieve experimentele variabelen.

Gelijktijdige metingen van intracellulair Calcium en membraanpotentiaal in vers geïsoleerd en Intact muis cerebrale endotheel

Hier gepresenteerd is het protocol van de Conpokal techniek, die confocale en atomaire kracht microscopie combineert in een enkel instrument platform. Conpokal biedt dezelfde cel, dezelfde regio, in de buurt van gelijktijdige confocale beeldvorming en mechanische karakterisering van levende biologische monsters.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Dit protocol beschrijft een confocale beeldvormingstechniek om drie fusiemodi in boviene bijnierchromaffinecellen te detecteren. Deze fusiemodi omvatten 1) close-fusion (ook wel kiss-and-run genoemd), waarbij fusieporiën worden geopend en gesloten, 2) stay-fusion, waarbij fusieporie wordt geopend en de geopende porie wordt gehandhaafd, en 3) krimpfusie, waarbij gesmolten blaasjeskrimp betrokken zijn.

Confocale microscopie om drie modi van fusieporiëndynamiek in bijnierchromaffinecellen te meten

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Leer gelijktijdige meting van vesiculaire en cytosolische pH in levende cellen met behulp van confocale microscopie en fluorescerende probes. Deze methode biedt inzicht in intracellulaire pH-dynamica.

Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie (Video) | JoVE Journal

Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Meer video's verkennen