Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina
13 oktober 2014
Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.
Het algemene doel van deze procedure is om selectief retinale ganglioncellen te labelen in de gehele preparaatvoorbereiding via een injectie van een calciumindicatorkleurstof in een opticusnerfstomp. Dit wordt bereikt door eerst een calciumindicatorkleurstof met zeer hoge affiniteit, zoals flow four, in de opticusnerfstomp te injecteren. Vervolgens wordt de retina geïsoleerd van de oogbeker en verdeeld in kwadranten om op een glasplaatje te worden gemonteerd. In een opnamekamer ingesteld om fysiologische omstandigheden na te bootsen, kunnen de bijdragen van voltage-gereguleerde calciumkanalen aan het calciumsignaal worden gemeten.
Bij retinale ganglioncellen kunnen in gedepolariseerde cellen met behulp van kanaalblokkers metingen worden uitgevoerd. Uiteindelijk kunnen de resultaten semi-kwantitatieve metingen opleveren van de bijdrage van de voltage-gereguleerde calciumkanalen aan een signaal, zoals een door hoog kalium opgewekte calciumsignaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektroporatie en bulkloading, is de mogelijkheid om selectief retinale ganglioncellen en hun axonen te labelen in een gehele preparaatvoorbereiding. Bewaar, verzamel en slaap rad ogen in een aims-medium of een vergelijkbare oplossing in.
Als u van plan bent calciumbeeldvormingsexperimenten uit te voeren, vult u de retinale ganglioncellen met flow four. Injecteer 0,5 microliters van 40 millimolair flow four pentakaliumzout, gereconstitueerd in water, in de opticusnerfstomp, ongeveer een millimeter achter het oog. Breng het oog over naar een zoogdier-ringers.
Belucht met 95% zuurstof, 5% kooldioxide, of een uur op kamertemperatuur. Houd de voorbereiding in het donker. Snijd de ogen onder een microscoop met gecontroleerde lichtomstandigheden uit.
Maak met behulp van een scheermesje een kleine insnijding aan de voorkant van het oog en verwijder het hoornvlies. Verwijder vervolgens het lensje van de binnenkant van de retina met behulp van een pincet. Houd de sclera stevig vast.
Tijdens het verwijderen van het glasvocht, pelt u voorzichtig de basis van het glasvocht naar het centrum van de retina. De resulterende voorbereiding, de I-beker genaamd, kan worden verwerkt voor immunohistochemische gehele preparaatvoorbereiding, calciumbeeldvormingsvoorbereiding of worden voorbereid voor transversale retinale secties om een immunohistochemische gehele preparaatvoorbereiding te maken. Maak eerst vier sneden in de retina zodat deze plat ligt.
Plaats de retina op de glazen dekplaat met de ganglioncellaag naar beneden. Voeg vervolgens een druppel oplossing toe aan de retina en bedek deze indien nodig met cellulosefilterpapier, vlakleggen van de retina met een borstel of pincet. Plaats vervolgens de retina, wanneer deze volledig plat is en loslaat van het filterpapier, terug in de oplossing.
Om de voorbereiding te verwerken, brengt u deze eerst over in 4% paraformaldehyde gedurende 10 tot 15 minuten. Was vervolgens de retina's drie keer in 0,1 molair fosfaatbuffer met een pH van 7,4 gedurende 30 minuten per wasbeurt voor een totaal van 90 minuten. Incubeer vervolgens de retina's gedurende een nacht op vier graden Celsius in 500 microliters blokkerende oplossing.
Deze oplossing bestaat uit 5% normaal geitenserum of ezelsserum in fosfaatbuffer met 0,3% tritton en 0,1% natriumaziet. Gedurende de volgende vijf tot zeven dagen, incubeer de retina's in de primaire antilichaamoplossing op vier graden Celsius. De samenstelling van deze oplossing moet empirisch worden bepaald. Was de primaire antilichaamoplossing af, net zoals het fixeermiddel werd afgewassen.
Incubeer vervolgens de retina's in secundair antilichaam met een concentratie van één op duizend gedurende een nacht op vier graden Celsius. Verwijder het secundaire antilichaam met drie extra wasbeurten en fosfaatbuffer. Monteer vervolgens de retina's voor visualisatie en verzegel ze met nagellak.
Deze platen moeten in het donker worden bewaard op vier graden Celsius. Begin met het maken van een calciumbeeldvormingsgehele preparaatvoorbereiding van de I-beker in ringers. Snijd eerst het retinale weefsel in kwadranten.
Plaats één kwadrant plat op de opnamekamer met de ganglionlaag naar boven, en dus de fotoreceptorlaag naar beneden. Droog het omliggende gebied voorzichtig af met een Kim-doek en plaats voorzichtig de ingevet harp op het weefsel. Laad nu de retinale voorbereiding op de rig en rond het opzetten van het achtkanaals zwaartekrachtgedreven superfusiesysteem af.
Als de gemonteerde retina zich beweegt nadat de harp is geplaatst, verwijder en reinig de harp zorgvuldig. Droog het gebied rond de retina en monteer de harp opnieuw. Versmelt de opnamekamer met zoogdier-ringersoplossing en houd de oplossing continu borrelend met 95% zuurstof, 5% kooldioxide.
Voer als controle zonder geneesmiddelen eerst twee gepaarde hoge kaliumpulsen uit van drie millimolair tot 60 millimolair gedurende 33 seconden. Bij depolarisatie zouden de RGC de voltage-gereguleerde calciumkanalen moeten activeren als de voorbereiding werkt. Ga nu door met de experimenten.
Nifedipine en L-type voltage-gereguleerde calciumkanaalblokker worden vaak gebruikt om de bijdrage van L-type voltage-gereguleerde calciumkanalen aan het door depolarisatie opgewekte calciumsignaal te beoordelen. Een niet-specifieke calciumkanaalblokker kan worden gebruikt om voltage-gereguleerde calciumkanalen niet-selectief te blokkeren. Scan de voorbereiding elke vijf seconden om de fluorescente rgc te visualiseren en afbeeldingen te verkrijgen van de fluorescente rgc.
Gebruik zo laag mogelijk laservermogen. De excitatie moet worden ingesteld op 488 nanometer en de emissie moet worden verzameld met een 505 nanometer LP-filter. Met behulp van de beschreven protocollen werd immunolabeling uitgevoerd tegen het ganglioncelproteïne R-B-P-M-S, een RNA-bindend proteïne met meerdere splicingflow.Vier.
De kleuring was inderdaad beperkt tot ganglioncellen op basis van de antilichaamspecificatie. Vervolgens werd de bijdrage van de voltage-gereguleerde calciumkanalen aan het calciumsignaal in de R GC's bestudeerd met behulp van de fluorescente intensiteitswaarden die van de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een procedure voor het selectief labelen van retina-ganglioncellen met behulp van een calciumindicatorkleurstof via injectie in de stomp van de oogzenuw. De techniek maakt het mogelijk om de calciumdynamiek in deze cellen en hun axonen te bestuderen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Calcium-imaging is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire dynamiek.
- Retinale ganglioncellen spelen een sleutelrol in de visuele verwerking.
- Bestaande methoden voor het labelen van cellen hebben beperkingen.
- Deze techniek biedt een selectievere benadering.
Doel van de studie
- Om retinale ganglioncellen in whole-mount preparaten te labelen.
- Om calciumdynamiek in deze cellen te meten.
- Om de bijdragen van spanningsafhankelijke calciumkanalen te evalueren.
Gebruikte methoden
- Injectie van een calciumindicator-kleurstof met een hoge affiniteit in de stomp van de oogzenuw.
- Isolatie en kwadrantverdeling van het netvlies voor montage.
- Gebruik van kanaalblokkers om calciumsignalen in gedepolariseerde cellen te beoordelen.
- Registratie in een kamer die fysiologische omstandigheden nabootst.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van retinaire ganglioncellen en hun axonen.
- Meting van calciumsignalen als reactie op depolarisatie.
- Kwantitatieve beoordeling van de bijdragen van spanningsafhankelijke calciumkanalen.
- Demonstratie van de voordelen ten opzichte van traditionele methoden.
Conclusies
- De techniek biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van retinale ganglioncellen.
- Het vergroot het inzicht in de calciumdynamiek in deze neuronen.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode voor verdere inzichten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt selectieve labelen van retinaire ganglioncellen in whole-mount preparaten mogelijk, waarmee een belangrijk probleem bij de validatie van targets in de neurowetenschappen wordt aangepakt, waarbij aspecifieke labeling de mechanistische interpretatie bemoeilijkt. Door de bijdragen van calciumsignalering vanuit spanningsafhankelijke calciumkanalen te isoleren, ondersteunt deze aanpak het voorspellende vertrouwen bij het beperken van risico's in signaalpaden voor de ontdekking van neurotherapeutica. De techniek biedt een ziekterelevant systeem voor het evalueren van target-engagement en functionele read-outs in retinaire ganglioncelmodellen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door selectief retinale ganglioncellen te labelen om doelspecifieke calciumsignalering te isoleren.
- Operationele waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door aspecifieke belading van verplaatste amacrinecellen in de ganglioncellaag te omzeilen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de betrouwbaarheid van het doelwit via semi-kwantitatieve meting van de bijdrage van spanningsafhankelijke calciumkanalen aan depolarisatie-opgewekte signalen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door retinaal ganglioncellen en hun axonen te isoleren in een whole mount-preparaat.
- Kwantitatieve resultaten: Maakt fluorescentie-intensiteitsmetingen mogelijk vanuit regio's van belang op de somata en axonen van ganglioncellen voor compound-screening.
- Reproduceerbaarheid: Standaardiseert de preparatie via kwadrantverdeling en montage op glasplaatjes onder fysiologisch nagebootste condities.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Biedt een model van retinale ganglioncellen dat is afgestemd op visuele verwerkingspaden voor translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Preklinische continuïteit: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door calciumdynamiek te meten in reactie op depolarisatie door hoog kalium en de toepassing van kanaalblokkers.
- Mechanistische risicoreductie: Verduidelijkt de rol van L-type en niet-specifieke spanningsafhankelijke calciumkanalen in calciumsignalering met behulp van nifedipine en kobalt.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het continuüm van ontdekkingen, van targetvalidatie tot preklinische evaluatie, door selectieve cellulaire labeling en functionele calcium-readouts te genereren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en het verduidelijken van pathways via injectie van een calciumindicator-kleurstof met hoge affiniteit in de oogzenuwstomp.
- Screening: Maakt assay-gereedheid en kwantitatieve fluorescentie-outputs mogelijk door middel van gecontroleerde depolarisatie en imaging in een registratiekamer.
- Analytics: Maakt vergelijking van condities mogelijk met behulp van fluorescentie-intensiteitswaarden die zijn verkregen vóór en na toepassing van kanaalblokkers.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door middel van ziekterelevante systeemmodellering van de functie van retinale ganglioncellen.
- Enterprise Reuse: Creëert een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van calciumdynamiek in neuronale preparaten over meerdere experimentele condities.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in studies naar calciumsignalering.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van whole mount retina-preparaten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij neurotarget-programma's.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en voortgangsbeslissingen op basis van kwantitatieve beoordelingen van calciumsignalering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie voor injectie in de oogzenuwstomp en retinale dissectie.
- Afhankelijk van fluorescentiemicroscopie-infrastructuur met 488 nm excitatie en 505 nm LP emissiefiltering.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van oplossingen, waaronder mammalia Ringer-oplossing en blokkeringsmiddelen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie tussen modelsystemen vanwege soortspecifieke retinale anatomie en de efficiëntie van de kleurstofbelading.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in de kleurstofbelading en de noodzaak van donkere bewaring bij 4°C om de signaalintegriteit te behouden.
