Name: Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer retinale ganglioncellen selectief labelen met calcium-indicatorkleurstof via injectie in de optische zenuw. Deze methode maakt calciumdynamica-metingen in gehele rattenretina's mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr S. Stella en Helen Vuong voor bijdragen aan het calcium imaging protocol. Wij danken Dr K. Sheets voor het filmen van het interview scènes. Wij danken Dr Arlene Hirano voor haar commentaar op het manuscript. Dit onderzoek en ontwikkeling project werd uitgevoerd door de auteurs aan de David Geffen School of Medicine aan de UCLA en wordt mogelijk gemaakt door een overeenkomst van opdracht die werd toegekend en beheerd door de US Army Medical Research en Materieel Command (USAMRMC) en de Telemedicine &amp; Advanced Technology Research Center (TATRC), in Fort Detrick, MD onder Contract Number: W81XWH-10-2-0077. Ondersteuningsmaatregelen voor deze studies kwam ook uit NIH EY04067 en een VA Merit Beoordeling (NB). NCB is een VA Career Research Scientist.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het welzijn van de proefdieren, uitgegeven door de US Public Health Service Policy on Human Care en gebruik van proefdieren en de Universiteit van Californië-Los Angeles (UCLA) Commissie Animal Research. Mannelijke en vrouwelijke volwassen Sprague-Dawley ratten (Charles River Lab, Wilmington, MA) in de leeftijd van 3-5 weken gebruikt. 1 Animal and Tissue Voorbereiding voor Wholemount Retina en Immunohistochemistry Protocol <ol><li> Bereid de volgende materialen en gereedschappen: Een dissectiemicroscoop, 2 tangen met zeer fijne tips, schaar, cellulose filter papier, plastic pipet en een microscoop glijbaan. </li><li> Euthanaseren de rat in een gesloten kamer door diep verdoven van het dier met 1-3% isofluraan waarna zij werden onthoofd met een guillotine. Verwijder de ogen met een paar iris schaar en in een petrischaal met de extracellulaire oplossing. Hibernate A, Ames Medium of fysiologische oplossingen worden aanbevolen. </li><li> [Optioneel stap als opvulling van RGC met Fluo-4 is gewenst]. Voer de Fluo-4 labeling zoals beschreven in stappen 2.3-2.4. </li><li> Met behulp van de dissectiemicroscoop (lichtintensiteit: 1,6 x 10 8 fotonen / mm 2 ⋅sec), verwijder het hoornvlies door het afsnijden van de voorkant van de oogbol. Verwijder de lens en glasvocht van het binnenoppervlak netvliesoppervlak met een pincet. Om het glasvocht te verwijderen, het stabiliseren van de oogbol door die de sclera stevig vast met een pincet. Haal voorzichtig het glasvocht basisstation naar het midden van het netvlies met de andere pincet. Het preparaat in deze fase wordt de oogschelp, die wordt gebruikt voor vriescoupes. Meer details over vriescoupes zijn te vinden in referenties 14,15. </li><li> Verwijder het netvlies van de oogschelp. Maak dan vier sneden om het netvlies te plat. Voorzichtig monteren het netvlies op een microscoop dia met de fotoreceptor laag boven. Voeg een druppel van oplossing van het netvlies en zet cellulose filtreerpapier op het netvlies. Zodra de retina hecht aan het filterpapier, plaatst het netvlies opnieuw in oplossing. Indien nodig, plat het netvlies met een borstel of een tang. </li><li> Plaats de wholemounted netvliezen in 4% PFA gedurende 10-15 min voor fixatie. </li><li> Was de wholemounted netvlies drie maal gedurende 30 min in 0,1 M fosfaatbuffer (PB), pH 7.4. Blokkeer het netvlies met 5% normaal geit serum of ezel serum in 0,1 PB die 0,3% Triton X-100 en 0,1% NaN3 bij 4 ° C overnacht. We raden een eindvolume van 500 pi voor alle stappen aan blokkerende oplossingen en antilichamen slaan. </li><li> De volgende dag, incubeer de retinae wholemounts met het primaire antilichaam 5-7 dagen bij 4 ° C. Optimale verdunningen moeten worden bepaald door de gebruiker. </li><li> Was de retina 3 x 30 min in 0,1 M PB en incubeer overnacht bij 4 ° C in de overeenkomstige fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichaam dat is gericht tegen de species van het primaire antilichaam (concentratie 1: 1.000). </li><li> Na drie laatste wasbeurten van 30 minuten elk met PB, monteer het netvlies in montage medium. Dicht de dekglaasjes met nagellak voor langdurige opslag. WINKEL monsters bij 4 ° C en beschermd tegen licht. </li></ol> 2 Labeling van ganglioncellen en axonen in Rat Wholemount netvliezen met een Calcium Indicator Dye <ol><li> Bereid 1000 ml zoogdieren Ringer&#39;s bevattende (in mM) 125 NaCl, KCl 3, 2 CaCl2, 1,25 NaH 2PO 4, 1 MgCl2, 25 NaHCO3 en 10 glucose geborreld met 95% O 2/5% CO &#173; 2. </li><li> Voer de dissectie zoals beschreven in stappen 1.2-1.4. </li><li> Retinale ganglioncellen (RGC&#39;s) en hun axonen vullen met een calcium indicator kleurstof, injecteer 0,5 gl Fluo-4 Pentakaliumtrifosfaat zout (40 mM voorraad in H 2 O) in de oogzenuw stomp ongeveer 1 mm achter de oogbol met een injectiespuit . Om de dynamische verhoging van de ganglion cel meten [Ca 2 + </sup&gt;] i indicator met hoge affiniteit, zoals Fluo-4 met een Kd van 345 nM, optimaal. Fluo-4 biedt het extra voordeel van een zeer hoge quantum efficiency resulteert in een emissie toename van&gt; 100-voudig wanneer gebonden aan calcium. </li><li> Plaats de oogschelp in zoogdiercellen Ringers borrelen met 95% O 2/5% CO &#173; 2 voor 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. </li></ol> 3 Calcium Imaging Protocol voor retinale ganglioncellen en axonen. <ol><li> Verwijder het oog, lens en het glasvocht, zoals beschreven in de stappen 1,1-1,4. Isoleer het netvlies van de oogschelp en verdeel het in kwadranten. Mount een kwadrant ganglion cel side up op een glasplaatje en gebruik een harp slice raster om het te stabiliseren. Houd de andere stukken donker aangepaste in zoogdiercellen Ringers borrelen met 95% O 2/5% CO &#173; 2 op ijs voor later gebruik. </li><li> Superfuse de opname kamer met zoogdier Ringer-oplossing enbewaar de oplossing continu doorborrelen met 95% O 2/5% CO 2. </li><li> Afbeelding het weefsel onder de microscoop. Conduct experimenten bij kamertemperatuur (~ 23 ° C) of bereiken fysiologische temperaturen door verwarmen de fase verwarmen van het waterbad onder het monster of het toepassen van warme lucht op het oppervlak van het monster. Opmerking: Het is belangrijk om op te merken dat veel cellulaire functies worden geregeld door de temperatuur, die een belangrijke rol bij het ​​handhaven van de intracellulaire homeostase 16 speelt. Echter, kan introductie van de aarde meet de snelheid van fotobleken, verdamping van het medium en de focus drift veroorzaakt door thermische uitzetting 17 te verhogen. Gebruik van de ruimte temperatuur daalt intracellulaire compartimentering van Fluo-4 18. </li><li> Een controlemeting van twee gekoppelde hoge K + pulsen in afwezigheid van drugs. Depolariseren RGC en RGC axonen door het verhogen van de [K +] o van 3 mm tot 60 mm voor 33 sec tijdens elke puls te activerenVGCCs met een acht kanaals zwaartekracht gedreven superfusie systeem. Verminder Na + door 57 mM tot isosmolarity in de verhoogde K + oplossing leidt. </li><li> Beoordeel de bijdrage van verschillende VGCCs de calcium signaal met gebruik van algemene of specifieke Ca kanaal blokkers. Bijvoorbeeld, de vermindering van calcium signaal na toediening van een niet-specifieke calciumantagonist, kobalt, voorzien in een semi-kwantitatieve maat van de bijdrage van de VGCCs de hoge K + -evoked calcium signaal. </li><li> Verwerven fluorescentie-intensiteitswaarden door een gebied van belang (ROI) rond de RGC plaats (figuur 2). </li><li> Normaliseren van de verandering in fluorescentie-intensiteit door de tweede hoge K + piek tot de verandering door de eerste hoge K + piek. Dan, voor het testen van bepaalde calciumkanaalblokkers toepassing drugs alleen tijdens de tweede hoge K + puls een paar en normaliseren deze piek tegende eerste piekwaarde. Het meten van de invloed van het geneesmiddel op de hoge K + piek, verdelen de amplitude van de tweede K + piek bij die van de eerste. Analyse worden uitgevoerd op deze waarden ten opzichte van hun bijpassende controles verkregen uit gepaarde hoge K + pieken gemeten in afwezigheid van geneesmiddel. </li><li> Acquire beelden op 5 sec intervallen. Om foto-bleken voorkomen, zo laag mogelijk te houden de laser excitatie. Geef excitatie door 488 nm lijn van de argon laser, terwijl de fotovermenigvuldigerbuis verzamelt de fluorescente emissie door een 505 nm LP filter. </li></ol>

<ol><li>Guenther, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+calcium+currents+in+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat.</a> Brain Res. 633, 223-235 (1994).</li>
<li>Farrell, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+voltage-gated+ion+channels+in+rat+retinal+ganglion+cells+mediated+by+somatostatin+receptor+subtype+4%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ganglion cells mediated by somatostatin receptor subtype 4.</a> J Neurophysiol. 104, 1347-1354 (2010).</li>
<li>Caterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+regulation+of+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 16, 521-555 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium--a+life+and+death+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium--a life and death signal.</a> Nature. 395, 645-648 (1998).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+microdomains+Organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium microdomains Organization and function.</a> Cell Calcium. 40, 405-412 (2006).</li>
<li>Dolphin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channel+diversity+multiple+roles+of+calcium+channel+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Calcium channel diversity multiple roles of calcium channel subunits.</a> Curr Opin Neurobiol. 19, 237-244 (2009).</li>
<li>Rottman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribonuclease+protection+assay+a+powerful+tool+for+the+veterinary+pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">The ribonuclease protection assay a powerful tool for the veterinary pathologist.</a> Vet Pathol. 39, 2-9 (2002).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Segev, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+spikes+from+a+large+fraction+of+the+ganglion+cells+in+a+retinal+patch%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recording spikes from a large fraction of the ganglion cells in a retinal patch.</a> Nat Neurosci. 7, 1154-1161 (2004).</li>
<li>Jeon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18, 8936-8946 (1998).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+extrasynaptic+factors+governing+glutamatergic+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and extrasynaptic factors governing glutamatergic retinal waves.</a> Neuron. 62, 230-241 (2009).</li>
<li>Daniels, B. A., Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((d-Serine+enhancement+of+NMDA+receptor-mediated+calcium+increases+in+rat+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">d-Serine enhancement of NMDA receptor-mediated calcium increases in rat retinal ganglion cells.</a> J Neurochem. 112, 1180-1189 (2010).</li>
<li>Weitz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+response+of+the+retina+to+electrical+stimulation+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators.</a> J Neurophysiol. 109, 1979-1988 (2013).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+voltage-gated+calcium+channel+%CE%B1%282%29%CE%B4%284%29+subunits+in+the+mouse+and+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of voltage-gated calcium channel α(2)δ(4) subunits in the mouse and rat retina.</a> J Comp Neurol. 521 (2), 2486-2501 (2013).</li>
<li>Hirano, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP25+expression+in+mammalian+retinal+horizontal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">SNAP25 expression in mammalian retinal horizontal cells.</a> J Comp Neurol. 519, 972-988 (2011).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+dynamics%2C+homeostasis+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling dynamics, homeostasis and remodeling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 517-529 (2003).</li>
<li>Dailey, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+live+cells+and+tissue+slices+in+the+imaging+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+ProtocI%22%5BJournal%5D)">Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup.</a> Cold Spring Harb ProtocI. , 373-379 (2011).</li>
<li>Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+intracellular+calcium+ion+dynamics+in+hair+cell+populations+with+Fluo-4%5BTitle%5D)+AND+%22AM.+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4.</a> AM. PLoS One. 7, e51874(2012).</li>
<li>Kwong, J. M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing+A+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing A new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1052-1058 (2010).</li>
<li>Pérez deSevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505, 177-189 (2007).</li>
<li>Pérez de Sevilla Müller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracer+coupling+of+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+to+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Tracer coupling of intrinsically photosensitive retinal ganglion cells to amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 518, 4813-4824 (2010).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+fluorescent+protein+expression+in+ganglion+and+amacrine+cells+in+a+thy1-CFP+transgenic+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Cyan fluorescent protein expression in ganglion and amacrine cells in a thy1-CFP transgenic mouse retina.</a> Mol Vis. 14, 1559-1574 (2008).</li>
<li>Raymond, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Thy1-CFP+DBA%2F2J+mouse+line+with+cyan+fluorescent+protein+expression+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Thy1-CFP DBA/2J mouse line with cyan fluorescent protein expression in retinal ganglion cells.</a> Vis Neurosci. 26, 453-465 (2009).</li>
<li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeation+and+block+of+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor+channels+by+divalent+cations+in+mouse+cultured+central+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeation and block of N-methyl-D-aspartic acid receptor channels by divalent cations in mouse cultured central neurones.</a> J Physiol. 394, 501-527 (1987).</li>
<li>Ascher, P., Nowak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+divalent+cations+in+the+N-methyl-D-aspartate+responses+of+mouse+central+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The role of divalent cations in the N-methyl-D-aspartate responses of mouse central neurons in culture.</a> J Physiol. 399, 247-266 (1988).</li>
<li>Aizenman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+mediated+by+excitatory+amino+acid+receptors+in+solitary+retinal+ganglion+cells+from+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses mediated by excitatory amino acid receptors in solitary retinal ganglion cells from rat.</a> J Physiol. 396, 75-91 (1988).</li>
<li>Taschenberger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+current+kinetics+in+a+solely+AMPA-receptor-operated+glutamatergic+synapse+formed+by+rat+retinal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic current kinetics in a solely AMPA-receptor-operated glutamatergic synapse formed by rat retinal ganglion neurons.</a> J Neurophysiol. 74, 1123-1136 (1995).</li>
<li>Chen, S., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+released+glutamate+activates+extrasynaptic+NMDA+receptors+on+cells+in+the+ganglion+cell+layer+of+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptically released glutamate activates extrasynaptic NMDA receptors on cells in the ganglion cell layer of rat retina.</a> J Neurosci. 22, 2165-2173 (2002).</li>
<li>Jakobs, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mRNA+for+glutamate+receptor+subunits+distinguishes+the+major+classes+of+retinal+neurons%2C+but+is+less+specific+for+individual+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Expression of mRNA for glutamate receptor subunits distinguishes the major classes of retinal neurons, but is less specific for individual cell types.</a> Mol Vis. 13, 933-948 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., Detwiler, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+mechanisms+generate+maintained+activity+in+ON+and+OFF+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeurosciI%22%5BJournal%5D)">Different mechanisms generate maintained activity in ON and OFF retinal ganglion cells.</a> J NeurosciI. 27, 5994-6005 (2007).</li>
<li>Margolis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+signaling+in+ON+and+OFF+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium signaling in ON and OFF mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 30, 7127-7138 (2010).</li>
<li>Baldridge, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recordings+of+the+effects+of+cholinergic+ligands+on+neurons+in+the+ganglion+cell+layer+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical recordings of the effects of cholinergic ligands on neurons in the ganglion cell layer of mammalian retina.</a> J Neurosci. 16, 5060-5072 (1996).</li>
<li>Hartwick, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+glutamate+clearance+mechanisms+in+a+chronic+rat+glaucoma+model+using+retinal+ganglion+cell+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of glutamate clearance mechanisms in a chronic rat glaucoma model using retinal ganglion cell calcium imaging.</a> J Neurochem. 94, 794-807 (2005).</li>
<li>Badea, T. C., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+neuronal+morphologies+in+the+mouse+retina+visualized+by+using+a+genetically+directed+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter.</a> J Comp Neurol. 480, 331-351 (2004).</li>
<li>Huberman, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+activity-mediated+refinement+of+axonal+projections+from+a+mosaic+of+genetically+identified+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Architecture and activity-mediated refinement of axonal projections from a mosaic of genetically identified retinal ganglion cells.</a> Neuron. 59, 425-438 (2008).</li>
<li>Kim, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identification+of+a+retinal+cell+type+that+responds+to+upward+motion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular identification of a retinal cell type that responds to upward motion.</a> Nature. 452, 478-482 (2008).</li>
<li>Munch, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+sensitivity+in+the+retina+processed+by+a+multifunctional+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Approach sensitivity in the retina processed by a multifunctional neural circuit.</a> Nat Neurosci. 12, 1308-1316 (2009).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen onthullingen.

1) Immunohistochemistry tot Fluo-4 lokalisatie naar het ganglion cellen in het netvlies wholemounts tonen, en 2) Calcium beeldvorming aan calcium dynamiek analyseren in retinale ganglioncellen en hun axonen: In dit artikel hebben we twee verschillende technieken beschreven. Immunohistochemie met wholemounts is gebruikt om de lokalisatie van eiwitten in de retina knaagdier 20-23 onthullen. Er zijn echter een aantal beperkingen. De kwaliteit van de kleuring is sterk afhankelijk van ...

Retinale ganglioncellen (RGC&#39;s) tot expressie L, N, P / Q en T-type VGCC bepaald door farmacologische blokkade van deze onderdelen van de gehele cel Ca kanaalstroom 1,2. VGCC zijn transmembraan multimerische eiwitten die betrokken zijn bij de zender release, gen-transcriptie, cel regulatie en synaptische plasticiteit 3,4,5. Functionele VGCCs bestaan ​​uit ten minste drie onderscheiden subeenheden: grote, α 1 transmembraan porie vormende subeenheden die biofysische en farmacologische eigenschappen van het kanaal, voornamelijk extracellulair hulpstoffen α 2 δ subeenheden en intracellulaire β subeenheden vastgesteld. De laatste twee vormen heteromere complexen met verschillende α 1 subeenheden en verandert de kinetische eigenschappen van en handel van de kanalen naar de plasmamembraan 6. In de afgelopen decennia zijn vele technieken zijn gebruikt om eiwit expre studerensie, zoals immunohistochemie, enzymgekoppelde immunosorbent assay, western analyse en flowcytometrie. Deze technieken vereisen het gebruik van specifieke antilichamen voor de detectie van een bepaald eiwit van interesse en bieden krachtige gereedschappen voor de lokalisatie en verdeling van specifieke eiwitten in verschillende weefsels. Technieken voor mRNA expressieniveaus van een bepaald eiwit detecteren en kwantificeren zoals Northern-blot-analyse, RT-PCR, real-time kwantitatieve RT-PCR, in situ hybridisatie, cDNA microarrays en bescherming ribonuclease assay een alternatieve benadering als antilichamen niet gemakkelijk beschikbaar zijn of expressie van een bepaald eiwit laag 7. Echter, een beperking van het gebruik van dergelijke moleculaire technieken is de vereiste identificatie van de gensequentie. Om eiwitten in het netvlies lokaliseren, immunohistochemie kan worden uitgevoerd op wholemount netvlies. Door de toegankelijkheid van de RGC de wholemountvoorbereiding biedt een uitstekend platform om de lokalisatie van specifieke eiwitten te bestuderen om het RGC somata en hun axonen. Naast hun lokalisatie, kunnen enkele functionele eigenschappen van de VGCCs in RGC worden aangetoond door het gebruik van calcium beeldvormingstechnieken. We beschrijven een calcium imaging protocol selectief labelen RGC met een calcium indicator kleurstof intracellulaire calcium dynamiek meten. De bijdrage van de verschillende VGCCs de calcium signaal in verschillende cellulaire compartimenten kunnen worden geïsoleerd met gebruik van subtype-specifieke Ca-antagonisten. Misschien is een van de meest voordelige aspecten van de calcium beeldvormende techniek die hier beschreven is het vermogen om gelijktijdig en onafhankelijk opnemen van meerdere RGC en hun axonen. Hoewel veel fysiologische technieken, zoals whole cell patch clamp opname, een hoge tijdsresolutie opnames membraan stromen, somatische of axonale bron van these stromen opgenomen kunnen niet worden onderscheiden en opnamen kunnen alleen worden gemaakt uit een neuron tegelijk. Multielectrode (MEA) kunnen gelijktijdig opnemen pieken van vele cellen, maar kan niet detecteren of discrimineren de activatie van, bijvoorbeeld, verschillende subtypen van calciumkanalen. Meas voorkeur opnemen van cellen die zich bevinden in de nabijheid van een bepaalde elektrode 8 en opnemen van cellen die grote spikes 9 genereren. Optical imaging methoden geven een alternatieve strategie voor de gelijktijdige en onafhankelijke opnamen van hele populaties van cellen die kunnen worden geïntegreerd met de resultaten van eencellige micro-elektrode en patch clamp opname en MEA opname informatie mogelijk. Hoewel calcium beeldvormingstechnieken hier beschreven werden gebruikt om de calciumdynamiek RGC bestuderen, kunnen patch clamp en MEA worden gebruikt parallel aan de opheldering van de ionische stromen en additie eigenschappen van RGC. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Sinds ontheemd amacrine cellen maken ongeveer 60% van de neuronale populatie in het ganglion cellaag in de muis netvlies 10, ons doel was om een laad-techniek die selectief etiketten RGC met een synthetische calcium indicator kleurstof in een gebruiken wholemount bereiding. Hoewel synthetische calcium indicator kleurstoffen uitstekend platform voor de studie van intracellulaire calcium dynamiek heeft het wijdverbreide gebruik belemmerd door het onvermogen om effectief ladingsspecifiek populaties van neuronen in een bepaald netwerk. Veel technieken zoals bulkbelading 11 en elektroporatie 8,12 uitgevoerd laden gehele celpopulaties zijn dergelijke technieken geen onderscheid tussen specifieke celtypen. Genetisch gecodeerde calcium indicatoren de mogelijkheid om specifieke celpopulaties selectief labelen, maar dergelijke werkwijzen vereisen het genereren van transgene dieren 13. De techniek beschrijft een method om selectief labelen RGC in de wholemount voorbereiding via oogzenuw stomp injectie van een calcium indicator kleurstof. Samen genomen, de structurele en fysiologische technieken die in dit artikel geven een platform om de lokalisatie en de bijdrage van de VGCCs om de calcium signaal in RGC en hun axonen te bestuderen.

```html
<table><tbody><tr><td>Straight scissors</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>dissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Straight Forceps</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>dissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>curved iris scissors</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>dissectie-instrumenten</td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=A1247501">A12475-01</a></td><td>Media</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td><a href="https://www.google.com/url?sa=t&amp;rct=j&amp;q=&amp;esrc=s&amp;source=web&amp;cd=1&amp;cad=rja&amp;sqi=2&amp;ved=0CC0QFjAA&amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">Bevestigingsmedium voor fluorescentie</a></td></tr><tr><td>Fluo-4 pentapotassium</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Laboratories</td><td>05260-05</td><td>anesthesie</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) objective lens</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Molecular Probes</td><td>A-11034</td><td>Secundair antilichaam</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>Een konijnenpolyklonaal antilichaam&nbsp;werd gegenereerd tegen het N-uiteinde van het RBPMS&nbsp;polypeptide (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, door een commerciële leverancier (ProSci, Poway, CA).</td></tr></tbody></table>
```

immunohistochemische en calcium imaging methods in wholemount rat retina

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In dit artikel beschrijven we de instrumenten, reagentia, en de praktische stappen die nodig zijn voor: 1) succesvol bereiding van wholemount netvliezen voor immunohistochemie en 2) calcium imaging voor de studie van spanningsgevoelige calciumkanalen (VACK) gemedieerde calcium signalering in retinale ganglioncellen. De calcium imaging methode beschrijven we omzeilt kwesties met betrekking tot niet-specifieke belasting van ontheemd amacrine cellen in het ganglion cellaag.

Immunokleuring met specifieke antilichamen verschaft een platform voor de lokalisatie van bepaalde eiwitten van belang in de retina en calcium beeldvormingstechniek Studentenvisums de studie van de bijdrage van de VGCCs de calcium dynamiek in de retinale ganglioncellen en hun axonen. Door een antilichaam tegen het eiwit RBPMS ganglioncellen (RNA bindend eiwit met meerdere splicing) die selectief etiketten RGC 19, konden we aantonen dat de Fluo-4 labeling beperkt tot ganglioncellen...

Immunohistochemie protocollen worden gebruikt voor de lokalisatie van een specifiek eiwit in het netvlies te bestuderen. Calcium beeldvormende technieken worden gebruikt om calcium dynamiek in retinale ganglioncellen en hun axonen te bestuderen.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

In this paper we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of wholemount retinas for ...

Het algemene doel van deze procedure is om retina-ganglioncellen in een whole mount-preparaat selectief te labelen via een injectie van een calciumindicator-kleurstof in de stomp van de oogzenuw. Dit wordt bereikt door eerst een calciumindicator-kleurstof met een zeer hoge affiniteit, zoals flow four, in de stomp van de oogzenuw te injecteren. Vervolgens wordt het netvlies uit de oogbeker geïsoleerd en verdeeld in kwadranten om op een glazen objectglas te worden gemonteerd. In een registratiekamer die is ingericht om fysiologische omstandigheden na te bootsen, worden de bijdragen van spanningsafhankelijke calciumkanalen aan het calciumsignaal onderzocht.In retina-ganglioncellen kan dit worden gemeten in gedepolariseerde cellen met behulp van kanaalblokkers. Uiteindelijk kunnen de resultaten semi-kwantitatieve metingen opleveren van de bijdrage van spanningsafhankelijke calciumkanalen aan een signaal, zoals een door hoog kalium opgewekt calciumsignaal. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals elektroporatie en bulkloading, is de mogelijkheid om retina-ganglioncellen en hun axonen selectief te labelen in een whole-mount preparaat, gediss

immunohistochemical-calcium-imaging-methods-wholemount-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

We beschrijven een protocol om Ca 2+ dynamiek in de axon terminals van de kegel fotoreceptoren met behulp van een ex-vivo slice voorbereiding van de muis netvlies controleren. Dit protocol maakt uitgebreide studies van de kegel Ca 2+ signalering in een belangrijke zoogdieren modelsysteem, de muis.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Het huidige protocol beschrijft het maken van een groot (6 x 3 mm2) schedelvenster met behulp van voedselwikkel, transparante siliconen en afdekglas. Dit schedelvenster maakt in vivo wide-field en twee-foton calcium imaging experimenten in dezelfde muis mogelijk.

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Netvliesprothesen hebben het vermogen om visuele waarnemingen te genereren. Om de ontwikkeling van nieuwe prothesen te bevorderen, zijn ex vivo-methoden nodig om apparaten te testen voordat ze worden geïmplanteerd. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol voor het bestuderen van calciumactiviteit in de retinale ganglioncellaag bij blootstelling aan elektrische stimulatie.

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI) maken een robuuste analyse op populatieniveau van sensorische neuronsignalering mogelijk. Hier hebben we een nieuwe benadering ontwikkeld die in vivo GECI-visualisatie van de activiteit van trigeminusganglia-neuronen bij ratten mogelijk maakt.

In-vivo Calciumbeeldvorming van sensorische neuronen in het trigeminusganglion van de rat

Dit protocol beschrijft de procedure voor het isoleren van het netvlies van de hele muis en het uitvoeren van immunokleuring om alle retinale ganglioncellen (RGC's) te labelen. Het proces wordt gevolgd door het in beeld brengen en automatisch tellen van RGC's met behulp van op AI gebaseerde software, waardoor een eenvoudige, snelle en nauwkeurige methode wordt geboden voor het kwantificeren van RGC's in het hele netvlies van de muis.

Immunokleuring en automatische telling van retinale ganglioncellen van muizen

Leer retinale ganglioncellen selectief labelen met calcium-indicatorkleurstof via injectie in de optische zenuw. Deze methode maakt calciumdynamica-metingen in gehele rattenretina's mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Immunohistochemische en Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

Meer video's verkennen