Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van plantmetabolieten die antimicrobiële eigenschappen hebben tegen anaerobe bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst een plantextract te scheiden middels dunne-laagchromatografie of TLC. Vervolgens wordt het chromatogram gesneden in zones die één of meer verbindingen bevatten.

De zones worden vervolgens geplaatst op agar die is geïnoculeerd met anaerobe bacteriën en geïncubeerd. Na de incubatie worden de zones verwijderd en worden de platen gekleurd om verbindingen te identificeren die de bacteriële groei remmen. De resulterende gegevens onthullen de aanwezigheid of afwezigheid van antimicrobiële plantmetabolieten.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van herkauwervoeding, zoals wat de effecten zijn van secundaire plantenmetabolieten op de nutriëntenbenutting door specifieke micro-organismen. Hoewel deze methode plantenverbindingen onthult die remmend werken op pensbacteriën, kan zij ook worden toegepast om verbindingen te identificeren die remmend werken op andere bacteriën of schimmels.

In dit protocol worden fenolische verbindingen uit rode klaver gebruikt om de identificatie van antimicrobiële verbindingen via contactbiografie te demonstreren. Begin met het reinigen van de dunlaagchromatografie- of TLC-platen in een zuurkast. Bereid voldoende reinigingsoplosmiddel voor om de bodem van de TLC-ontwikkelkamer en de onderrand van een TLC-plaat te bedekken.

Terwijl dit in de kamer wordt geplaatst, wordt een mengsel van ethylacetaat en methanol in een verhouding van twee op één bereid. Draag vervolgens handschoenen en werk in een zuurkast. Gebruik een schaar om flexibele silica-platen met een aluminium- of plastic achterzijde op maat te knippen voor de ontwikkelkamer.

Plaats de platen in de kamer, waarbij de bovenkanten tegen de wanden van de kamer leunen. De platen mogen elkaar niet raken. Dek de kamer af en laat het oplosmiddel door capillaire werking langs de platen omhoog trekken.

Wanneer het oplosmiddel de bovenkant van de platen heeft bereikt, worden deze uit de kamer gehaald en rechtop geplaatst in de zuurkast totdat het oplosmiddel is verdampt. Zodra de platen droog zijn, wordt gecontroleerd of onzuiverheden naar de bovenkant van de TLC-platen zijn gemigreerd. Deze zijn zichtbaar als een gele band onder zichtbaar licht of als een fluorescerende band onder ultraviolet licht.

Als het grootste deel van de plaat nog steeds een gelige tint heeft, herhaal dan het reinigingsproces in dezelfde TLC-kamer met hetzelfde oplosmiddel. Gooi het oplosmiddel weg nadat de TLC-platen uit de kamer zijn verwijderd. Laat het resterende oplosmiddel volledig verdampen voordat de kamer wordt gebruikt voor het volgende deel van het protocol.

Om vervolgens resterend vocht te verwijderen dat de migratie van verbindingen op silica kan beïnvloeden, worden de platen rechtop in een droogoven bij 100 °C geplaatst gedurende 10 tot 15 minuten voor een plaat van 20 bij 20 centimeter, en vijf minuten voor platen van 7 bij 10 centimeter. Zodra de platen droog zijn, laat u ze afkoelen tot kamertemperatuur voordat u ze vult met extracten. Om de kamers voor de scheiding van extracten voor te bereiden, gebruikt u een schaar om een stuk filterpapier uit te snijden dat iets lager is dan de hoogte van de kamer en ongeveer de helft van de omtrek van de kamer breed is.

Dit papier dient als lont om oplosmiddelen langs de wand van de kamer omhoog te trekken en de kamer met oplosmiddelpapieren te verzadigen, waardoor de reproduceerbaarheid van de scheidingen wordt verbeterd. Meng de oplosmiddelen hier in een zuurkast. De gebruikte oplosmiddelen zijn ethylacetaat en methanol in een volume-per-volumeverhouding van vier op één. Giet het oplosmiddelmengsel in de kamer en sluit deze af.

Gebruik een potlood om de oorsprong lichtjes te markeren op een punt op de TLC-plaat dat boven het oppervlak van het ontwikkelingsoplosmiddel in de kamer zal liggen. Als het absorptiemiddel van de TLC-plaat zacht is en gemakkelijk beschadigt, maak dan markeringen aan de randen zoals hier getoond. Los vervolgens de extracten op in voldoende organisch oplosmiddel om een geconcentreerde oplossing te verkrijgen in plaats van een troebele suspensie.

In dit geval is methanol het gebruikte oplosmiddel. Door capillaire micropipetten of een microliterspuit te gebruiken, worden standaarden en monsters als smalle banden aangebracht, waarbij aan de zijkanten van de plaat een rand van één centimeter vrij blijft; het waaieren van de plaat of het plaatsen ervan in een zuurkast helpt om de banden sneller te laten drogen. Zodra de banden zijn opgedroogd, worden de monsters opnieuw op dezelfde plek aangebracht of overgespot.

Indien een hogere concentratie van het monster op de plaat nodig is, herhaal deze stap dan naar behoefte in de TLC-kamer. Zorg ervoor dat de gehele lont verzadigd is met oplosmiddel. Plaats vervolgens de platen met een pincet of tang in de TLC-kamer.

De platen mogen de lont niet raken. Dek de kamer af en laat de platen ontwikkelen voordat het oplosmiddelfront de bovenkant van de plaat bereikt. Haal de platen uit de TLC-tank en markeer de hoogte van het oplosmiddelfront met een potlood.

Laat de plaat drogen. Ontwikkel in een zuurkast eventuele overgebleven TLC-platen in dezelfde TLC-kamer, die over het algemeen een hele dag bruikbaar is als deze gesloten wordt gehouden. Als de hoeveelheid oplosmiddel in de kamer merkbaar afneemt, maak dan meer oplosmiddelmengsel nadat de platen droog zijn.

Visualiseer de banden onder zichtbaar of UV-licht. Een kijkkamer met een draagbare UV-lamp is handig, vooral als de lamp verbindingen kan detecteren bij zowel 254 nanometer kortgolvig UV als 365 nanometer langgolvig UV. Gebruik een potlood om de banden af te bakenen en maak met een gel-fotodocumentatiesysteem, uitgerust met bovenlichting, UV- en/of zichtbaar licht, afbeeldingen van de platen.

Ten slotte, om te helpen bij het karakteriseren van de banden, berekent u de retentiefactor of RF-waarden door eerst de afgelegde afstand van de verbinding te meten, vervolgens de afgelegde afstand van het oplosmiddel te meten en de eerste door de laatste te delen. Zodra de posities van de banden zijn gemarkeerd, kunnen de platen worden bewaard voor later gebruik in de bioassay.

Wikkel de platen in plastic en bedek ze met aluminiumfolie. Bewaar de platen bij -20 °C. De maximale bewaartijd is afhankelijk van de stabiliteit van de verbinding, aangezien silica niet neutraal is.

Sommige verbindingen kunnen degraderen terwijl ze zich op de TLC-plaat bevinden. Ter voorbereiding op de contactbiografie-assay worden hyper-ammoniakproducerende bacteriën of HAB-medium klaargemaakt en geïnoculeerd onder anaerobe omstandigheden. De cultuur die in dit geval wordt gebruikt, is Clostridium stickland eye strain sr.

Kweek de cultuur tot de exponentiële of stationaire fase bij 39 °C. Gebruik steriele anaerobe technieken bij het werken met anaerobe micro-organismen. Bereid een oplossing van 0,75% w/v.

Voeg agar toe aan hetzelfde medium dat is gebruikt voor de kweek van de bacteriën nadat de temperatuur van de agar is gedaald tot minder dan 60 °C. Inoculeer de gesmolten agar met 1% volume per volume van de cultuur, meng voorzichtig, plaats het mengsel onmiddellijk in een anaerobe kamer en giet het met behulp van scharen in plastic Petri-schalen van 15 bij 100 millimeter. Snijd de TLC-plaat in zones die de band of banden van belang bevatten.

Markeer de achterkant van de platen met een watervaste stift. Plaats een ongebruikte TLC-strip op de agarplaat als controle. Plaats vervolgens de banden met de actieve zijde naar beneden op de agarplaat.

Incubeer de platen met de agarzijde naar beneden in de incubator van de anaerobe kamer gedurende 24 uur bij 39 °C met behulp van een pincet. Verwijder de TLC-banden van de agaplaat terwijl deze zich in de anaerobe kamer bevinden.

Voeg tetra oleum red druppelsgewijs toe aan de oppervlakken van de agarplaatjes. Laat de kleur gedurende ten minste 20 minuten ontwikkelen. Wanneer het controleplaatje volledig rood kleurt, worden de plaatjes uit de anaerobe kamer gehaald.

Clostridium stick Landi is een anaerobe bacterie, waardoor de levensvatbaarheid onmiddellijk na verwijdering uit de anaerobe kamer zal afnemen, maar de kleur is meer dan 24 uur stabiel. Fotografeer de platen met een digitale camera onder zichtbaar licht tegen een achtergrond die voldoende contrast biedt. Een helderrode kleur zal zichtbaar zijn wanneer levende cellen zijn gekleurd.

Dode cellen kleuren niet. Hier worden representatieve silica-TLC-scheidingen van rode klaver-extracten met fenolische verbindingen getoond. Scheiding in ethylacetaat-hexaan negen op één over 8,5 centimeters resulteerde in vijf banden, waarvan één volledig gescheiden was van de oorsprong.

De geladen standaarden waren Formin Bio Canon A en Genine. Vier banden van deze plaat werden gedurende 24 uur aangebracht op culturen met Clostridium stick Landi, een ruminale hyper-ammoniak-producerende bacterie, en gekleurd met tetra oleum red zoals hier beschreven. Incubatie met band één Bio Canon A en een deel van band twee vier Monon nein op agar gezaaide bacteriën resulteerde in een duidelijk gedefinieerde inhibitiere zone.

Echter remde de incubatie van het resterende deel van band twee, samen met band drie en vier, de bacteriële groei niet. Deze resultaten toonden aan dat bio Canon A remmend werkte op de groei van see stickland eye, maar form aone Nein niet. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de techniek flexibel is.

Andere testmicro-organismen kunnen worden gebruikt, mits er geschikte media worden geselecteerd en er controles worden opgenomen om te waarborgen dat de scheidingschemie en de detectiemethode compatibel zijn bij het volgen van deze procedure. Andere technieken, zoals hogedrukvloeistofchromatografie en massaspectrometrie, kunnen worden ingezet om te helpen bij het karakteriseren van de antimicrobiële verbindingen die in een bioassay zijn geïdentificeerd.