Name: Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-27T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Leer hoe je antimicrobiële plantenmetabolieten identificeert met dunne-laagchromatografie en contactbioautografie. Deze methode toont antibacteriële werking tegen anaërobe bacteriën in rode klaverextracten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken wijlen Dr Norm Taylor, Dept Plant and Soil Science aan de Universiteit van Kentucky, voor het mogelijk maken om de monsters van zijn rode klaver percelen voor deze studie. Dit project werd gefinancierd door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

1. Voorbereiding van Plant Extract <ol><li> Zie Kagan en Flythe 10 voor de extractie van fenolische verbindingen van Trifolium pratense cv. Kenland. </li><li> Om andere verbindingen te extraheren in andere planten, controleer dan de fytochemische analyse literatuur voor planten-of metaboliet-specifieke extractie methoden (velen zijn beschreven), of kijk naar protocollen zoals die van Khurram et al.. 7,8 die veel verbindingen te isoleren met een brede waaier van polariteiten. </li></ol> 2. Bereiding van dunne-laagplaten <ol><li> Schoon TLC platen meer door in een of meer polair, neutraal oplosmiddel, teneinde geadsorbeerde verontreinigingen weg van de zone van ontwikkeling bewegen. <ol><li> In een zuurkast bereiden genoeg gebruikte oplosmiddel (bijv. 15-100 ml ethylacetaat-methanol 02:01, v / v) aan de onderzijde van de TLC ontwikkelkamer, en de onderrand van een TLC-plaat als set dekken binnen de kamer. </li><li> Gebruik commerverkrijgbare glazen TLC ontwikkelen van camera&#39;s (verschillende maten verkrijgbaar, met een deksel) of-folie bedekt Pyrex bekers of weckpotten. </li><li> Gebruik een schaar om aluminium-of kunststof-backed (flexibele) silicagel platen, die zijn er in verschillende maten (20 cm x 20 cm en kleiner), de beschikbare ontwikkelkamer pasvorm. (Let op: silica kan longschade veroorzaken bij inademing Werk in een zuurkast, en handvat TLC platen met handschoenen om te voorkomen dat de huid olie op het silica..) </li><li> Plaats de platen in de kamer, met de toppen leunend tegen de wanden. De platen moeten elkaar niet raken. Bedek de kamer en laat het oplosmiddel hoger op de plaat door capillaire werking. </li><li> Als oplosmiddel de bovenkant van de platen heeft bereikt, verwijderen platen uit kamer en schik in een staande positie in de zuurkast tot oplosmiddel verdampt is. </li><li> Controleer of onzuiverheden in de buurt van de bovenkant van de TLC-plaat zijn gemigreerd op zoek naar een gele band onder zichtbaarlicht, of een fluorescerende band onder ultraviolet (UV) licht (zie de &quot;onzuiverheid front&quot; of als in figuur 2B). Als de meerderheid van de plaat heeft nog steeds een gelige tint, herhaal het reinigingsproces. </li><li> Na het verwijderen van TLC-platen uit de kamer, gooi het oplosmiddel. Laat restoplosmiddel volledig verdampt voordat u de kamer voor protocol 2. </li><li> Om restvocht die invloed migratie van verbindingen op silica 16 verwijderen prop de platen rechtop in een droogoven bij 100 ° C (10-15 min bij 20 cm x 20 cm plaat en 5 min bij 7 cm x 10 cm platen ). </li><li> Bij 100 ° C droogoven niet beschikbaar, warmte platen gedurende langere tijd bij lagere temperaturen (bijvoorbeeld 40 minuten bij 60 ° C). </li><li> Nadat de platen droog, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur voordat het laden. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van de ontwikkeling van Chambers voor Extract scheiding <ol&gt; <li> Knip met een schaar een stuk filtreerpapier iets onder kamer hoogte, en ongeveer de helft van de kamer perimeter in de breedte snijden. Dit document dient als een lont te stellen oplosmiddel de kamerwand en verzadigen de kamer met dampen van oplosmiddelen, waardoor het verbeteren van de reproduceerbaarheid van scheidingen 1. </li><li> In een zuurkast, meng oplosmiddelen (ethylacetaat-methanol 4:1, v / v, voor deze studie). Giet oplosmiddel mengsel in de kamer en dekken. Wacht tot de hele lont is nat met oplosmiddel, wat aangeeft kamer verzadiging, om platen in de kamer te zetten. </li></ol> 4. Laden en Ontwikkeling van TLC platen <ol><li> Lichtjes markeren de oorsprong met potlood. Als de TLC-plaat adsorbens is zacht en gemakkelijk beschadigd raken, maken merken randen. Verbindingen moet boven het oppervlak van de ontwikkelvloeistof als platen in de TLC kamer worden geplaatst. </li><li> Los uittreksels voldoende organisch oplosmiddel (in casu methanol) om een ​​geconcentreerde oplossing in plaats van een troebele hebbensuspensie. </li><li> Load monsters en standaarden als smalle banden met een microliter injectiespuit of capillaire micropipetten, waardoor een 1 cm rand aan de zijkanten van de plaat. Laat de banden om te drogen (waaieren de plaat of u het in een zuurkast helpt). </li><li> Als een grotere concentratie van het monster op een bord, &quot;overspot&quot; is nodig door het laden monsters weer op de droge banden. </li><li> Met een pincet of tang, de gemonteerde plaat (s) in de verzadigde TLC kamer. De platen moeten niet de lont aan, aangezien hij op contactpunten oplosmiddel kan leveren aan de platen, waardoor het pad van verbinding migratie veranderen. Bedek kamer en laat platen te ontwikkelen. </li></ol> 5. Voorbereiding van de plaatjes voor Bioassay <ol><li> Verwijder de plaat (s) van TLC tank voordat het oplosmiddel voor de bovenkant van de plaat is gekomen, en markeer de hoogte van het oplosmiddel voorzijde met een potlood. Laat plaat droog in zuurkast. <ol><li> Ontwikkel resterende TLC platen in dezelfde TLC kamer die is generally bruikbaar voor een hele dag als gesloten gehouden. Remake oplosmiddelenmengsel voor TLC kamer als de hoeveelheid oplosmiddel in de kamer daalt met name. </li></ol></li><li> Na platen zijn droog, visualiseren banden onder zichtbaar of UV-licht, en af ​​te bakenen banden met potlood. Een weergave kamer met een draagbare UV-lamp is geschikt, vooral wanneer de lamp verbindingen detecteren zowel 254 nm (korte golf UV) en 365 nm (lange-golf UV). NB: Op dit punt of na de volgende stap kunt platen worden verpakt in plastic folie, bedekt met een folie, en opgeslagen bij -20 ° C. Maximale opslagcapaciteit is afhankelijk van samengestelde stabiliteit. Omdat silica is niet neutraal, kunnen sommige verbindingen terwijl degraderen op de TLC-plaat. </li><li> Fotograferen of tekenen platen. <ol><li> Gebruik een gel photodocumentation systeem als een uitgerust met overhead UV en / of zichtbaar licht beschikbaar is. </li><li> Als er geen commerciële photodocumentation systeem beschikbaar is, foto platen binnenkant van een doos bekleed met donker papier of doek, wiTh Een camera op een statief en een draagbare UV-licht vastgeklemd zit op een ring staan ​​17. Bij het ​​fotograferen van platen die geen fluorescentie-indicator hebben, gebruik dan een blauw licht filter over de lens van de camera om band uiterlijk 17 te verbeteren. </li></ol></li><li> Om te helpen bij het ​​karakteriseren van bands, berekenen retentiefactor (Rf) waarden door het meten van afstanden afleggen verbinding en oplosmiddel voor, en het verdelen van de eerstgenoemde aan de laatstgenoemde (Figuur 2A). </li></ol> 6. Bacteriële Cultuur en Assay <ol><li> Bereiden en te enten media onder anaërobe omstandigheden. De cultuur die in dit geval was Clostridium sticklandii stam SR, die werd verkregen uit de kweek collectie van James B. Russell, Cornell University, Ithaca, NY. <ol><li> Zie Flythe en Kagan 13 en de lijst met materialen voor een beschrijving van HAB media. </li></ol></li><li> Groeien de cultuur tot exponentiële of stationaire fase. Gebruik steriele anaërobe techniques bij het werken met anaërobe micro-organismen. </li><li> Injecteer de (1% v / v) in gesmolten agar nadat de temperatuur van de agar (0,75% w / v) is gedaald tot minder dan 60 ° C. Meng voorzichtig en onmiddellijk brengen in een anaerobe kamer (95% CO 2 -5% H 2 atmosfeer voor HAB media) te gieten. </li><li> Giet het mengsel in 15 mm x 100 mm kunststof petrischaaltjes, en laat stollen. </li><li> Knip met een schaar de TLC-plaat in zones met band (s) van belang. Leg bands gezicht naar beneden op agar-platen, het markeren van banden op de plaat steun voor het bijhouden van de oorspronkelijke oriëntatie op TLC plaat te houden. Leg een ongebruikte TLC strook op een agar plaat als controle. </li><li> Incubeer agarplaten, agar naar beneden, in de anaërobe kamer (24 uur, 39 ° C). </li></ol> 7. Visualisatie van een bioassay Agar Plates <ol><li> Met een pincet, verwijder bands uit agar-platen, terwijl ze in de anaërobe kamer. </li><li> Voeg 1% (w / v) tetrazolium rood, bereid in water, druppelsgewijs op de oppervlakken van de agarplaten. Laat de kleur ontwikkelen gedurende ten minste 20 minuten, of totdat de controle-plaat wordt helemaal rood, voordat u bij de anaërobe kamer. De anaërobe bacteriën beginnen levensvatbaarheid verliezen onmiddellijk na verwijdering uit de anaërobe kamer, maar de kleur is stabiel gedurende meer dan 24 uur. </li><li> Fotograferen onder zichtbaar licht. </li></ol>

<ol><li>Stahl, E., Ashworth, M. R. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStahl%2C+E+%22Thin-layer+chromatography%22">Thin-layer chromatography</a>. , Springer. (1969).</li>
<li>Marston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+with+biological+detection+in+phytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry.</a> J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.</li>
<li>Homans, A. L., Fuchs, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+bioautography+on+thin-layer+chromatograms+as+a+method+for+detecting+fungitoxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Direct bioautography on thin-layer chromatograms as a method for detecting fungitoxic substances.</a> J. Chromatogr. 51, 327-329 Forthcoming.</li>
<li>Lund, B. M., Lyon, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+inhibitors+of+Erwinia+carotovora+and+E.+herbicola+on+thin-layer+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and E. herbicola on thin-layer chromatograms.</a> J. Chromatogr. 110, 193-196 (1975).</li>
<li>Betina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioautography+in+paper+and+thin-layer+chromatography+and+its+scope+in+the+antibiotic+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Bioautography in paper and thin-layer chromatography and its scope in the antibiotic field.</a> J. Chromatogr. A. 78, 41-51 (1973).</li>
<li>Weltzien, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+biologischer+Test+f%C3%BCr+fungizide+Substanzen+auf+dem+Papierchromatogramm%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Ein biologischer Test für fungizide Substanzen auf dem Papierchromatogramm.</a> Naturwissenschaften. 45, 288-289 (1958).</li>
<li>Khurram, M., Khan, A. M., Hameed, A., Abbas, N., Quayum, A., Inayat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activities+of+Dodonaea+viscosa+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activities of Dodonaea viscosa using contact bioautography technique.</a> Molecules. 14 (3), 1332-1341 (2009).</li>
<li>Khurram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticandidal+potential+of+Quercus+baloot+Griff.+using+contact+bioautography+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Afr.+J.+Pharm.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticandidal potential of Quercus baloot Griff. using contact bioautography technique.</a> Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5 (12), 1538-1542 (2012).</li>
<li>Robinson, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+T+%22The+Organic+Constituents+of+Higher+Plants%22">The Organic Constituents of Higher Plants</a>. , Burgess Publishing Co. (1963).</li>
<li>Kagan, I. A., Flythe, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+separation+and+bioactivity+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+extracts+assayed+against+Clostridium+sticklandii%2C+a+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prod.+Commun%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the separation and bioactivity of red clover (Trifolium pratense) extracts assayed against Clostridium sticklandii, a ruminal hyper ammonia-producing bacterium.</a> Nat. Prod. Commun. 7 (12), 1605-1608 (2012).</li>
<li>Mattila, P., Kumpulainen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+and+total+phenolic+acids+in+plant-derived+foods+by+HPLC+with+diode-array+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agric.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of free and total phenolic acids in plant-derived foods by HPLC with diode-array detection.</a> J. Agric. Food Chem. 50 (13), 3660-3667 (2002).</li>
<li>Hamburger, M. O., Cordell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+bioautographic+TLC+assay+for+compounds+possessing+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A direct bioautographic TLC assay for compounds possessing antibacterial activity.</a> J. Nat. Prod. 50 (1), 19-22 (1987).</li>
<li>Flythe, M., Kagan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+effect+of+red+clover+%28Trifolium+pratense%29+phenolic+extract+on+the+ruminal+hyper+ammonia-producing+bacterium%2C+Clostridium+sticklandii%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial effect of red clover (Trifolium pratense) phenolic extract on the ruminal hyper ammonia-producing bacterium, Clostridium sticklandii.</a> Curr. Microbiol. 61, 125-131 Forthcoming.</li>
<li>Rahalison, L., Hamburger, M., Hostettmann, K., Monod, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioautographic+agar+overlay+method+for+the+detection+of+antifungal+compounds+from+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">A bioautographic agar overlay method for the detection of antifungal compounds from higher plants.</a> Phytochem. Anal. 2 (5), 199-203 (1991).</li>
<li>Chomnawang, M. T., Trinapakul, C., Gritsanapan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antigonococcal+activity+of+Coscinium+fenestratum+stem+extract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">In vitro antigonococcal activity of Coscinium fenestratum stem extract.</a> J. Ethnopharmacol. 122, 445-449 (2009).</li>
<li>Stahl, E., Kaldewey, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spurenanalyse+physiologisch+aktiver%2C+einfacher+Indolderivate%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%E2%80%99s+Z.+Physiol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Spurenanalyse physiologisch aktiver, einfacher Indolderivate.</a> Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chem. 323, 182-191 Forthcoming.</li>
<li>Kagan, I. A., Hammerschmidt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+ecotype+variability+in+camalexin+production+and+reaction+to+infection+by+Alternaria+brassicicola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis ecotype variability in camalexin production and reaction to infection by Alternaria brassicicola.</a> J. Chem. Ecol. 28 (11), 2121-2140 (2002).</li>
<li>Kline, R. M., Golab, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+in+developing+thin-layer+bioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique in developing thin-layer bioautographs.</a> J. Chromatogr. 18, 409-411 (1965).</li>
<li>Wedge, D. E., Nagle, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+2D-TLC+bioautography+method+for+the+discovery+of+novel+antifungal+agents+to+control+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nat.+Prod%22%5BJournal%5D)">A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens.</a> J. Nat. Prod. 63 (8), 1050-1054 (2000).</li>
<li>Beck, A. B., Knox, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acylated+isoflavone+glycosides+from+subterranean+clover+and+red+clover%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">The acylated isoflavone glycosides from subterranean clover and red clover.</a> Aust. J. Chem. 24 (7), 1509-1518 (1971).</li>
<li>Kahn, R. A., Bak, S., Svendsen, I., Halkier, B. A., Møller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+reconstitution+of+cytochrome+P450ox+and+in+vitro+reconstitution+of+the+entire+biosynthetic+pathway+of+the+cyanogenic+glucoside+dhurrin+from+sorghum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and reconstitution of cytochrome P450ox and in vitro reconstitution of the entire biosynthetic pathway of the cyanogenic glucoside dhurrin from sorghum.</a> Plant Physiol. 115 (4), (1997).</li>
<li>Peterson, C. A., Edgington, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+estimation+of+the+fungicide+benomyl+using+a+bioautograph+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agr.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative estimation of the fungicide benomyl using a bioautograph technique.</a> J. Agr. Food Chem. 17 (4), 898-899 (1969).</li>
</ol>

Vermelding van handelsnamen of commerciële producten in het artikel is uitsluitend ten behoeve van het verstrekken van specifieke informatie en impliceert niet aanbeveling of goedkeuring door de USDA. De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het scheiden van een extract in deelverzamelingen van verbindingen en het testen van de subsets door contact bioautografie. De methode is vrij gelijkaardig aan degene die door Chomnawang et al.. 15 voor het screenen op plantenmetabolieten remmende to-gonorroe-veroorzakende bacteriën. Het type bioautografie gebruikt om het scherm voor antimicrobiële plantaardige stoffen hangt af van vele factoren, waaronder de test micro-organisme, het laboratorium s...

Testen op antimicrobiële verbindingen in planten vereist het scheiden van de componenten van een plantenextract, blootstellen test micro-organisme die delen, en het bepalen of groei van het micro-organisme wordt geremd door een van de verbindingen. Scheidingen door papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC) zijn handig omdat veel verbindingen kunnen worden gescheiden op een vlak oppervlak. Scheiding is gebaseerd op polariteit met sommige verbindingen binden stevig aan het adsorptiemiddel (cellulose bij pc, en een verscheidenheid van adsorptiemiddelen bij TLC) en het migreren van minder dan anderen 1. Figuur 1 geeft een voorbeeld van de relatieve posities van polaire en niet-polaire fenolen na scheiding op een silica TLC-plaat. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51411/51411fig1.jpg" /> Figuur 1. Diagram verdelingen van verbindingen met verschillende polariteit na scheiding op een silica dunne-laagchromatografie (TLC) plaat. Fenolverbindingen rode klaver (Trifolium pratense L.) dienen als voorbeeld. Polaire verbindingen, zoals clovamide, een sterke affiniteit voor een polair adsorptiemiddel zoals silica en blijft bij de oorsprong (OR), terwijl minder polaire verbindingen, zoals de drie isoflavonen bij vloeistoffront (SF), verdeling gemakkelijker in de oplosmiddelen (die minder polair dan silica tenzij water, zuren, basen of zijn opgenomen) en migreren verder de plaat. Na afscheiding van een extract op een TLC-plaat kunnen micro-organismen in worden blootgesteld aan verbindingen op de plaat, waardoor sneller de identificatie van de actieve componenten van een extract 2. Als een schimmel of bacteriële kweek wordt blootgesteld aan het chromatogram zal microbiële groei overal optreden behalve dan gebieden met groei-inhibitory verbindingen. Remmingszones dan kan worden gevisualiseerd door het observeren van het contrast tussen myceliumgroei en de groei gebieden als fungi zijn aangebracht 3 of door besproeien met verbindingen die van kleur veranderen wanneer verminderd of gehydrolyseerd door levende cellen 4. Hoewel het gebruik van papier of dunne-laag chromatogrammen antimicrobiële assays eerst werd op 5 antibiotica en fungiciden 3,6 worden plantenextracten nu regelmatig onderzocht op antimicrobiële samenstellingen met deze werkwijze vaak aangeduid als bioautografie. De hierin beschreven protocollen toepassing bioautografie dunne-laag chromatogrammen. TLC wordt veel gebruikt omdat het relatief snel en kan worden uitgevoerd op verschillende adsorptiemiddelen (bijvoorbeeld silica, zetmeel, aluminiumoxide), alsmede het verschaffen van goede resolutie en gevoeligheid 1. Plantenextracten kunnen worden voorbereid TLC op vele manieren. Voorkomende methodes zijn extraheren plantmateriaal in alcohol-watermengsel zoals 80% ethanol 7,8, eventueel met toevoeging van zuur of base 9. Na een extractie dergelijke oplosmiddelen, die wat water bevatten en eventueel zure of basische moet extracten worden geconcentreerd zodat ze kunnen worden toegepast op TLC platen in een minimaal volume. De concentratie van alcohol-water extracten worden bereikt door het verdelen van met water mengbare organische oplosmiddelen 8 of een mengsel van dergelijke oplosmiddelen, zoals ethylacetaat-ethylether (1:1, v / v) 10,11. Verschillende plantmetabolieten worden geëxtraheerd in verschillende organische oplosmiddelen, afhankelijk van de polariteit. Om plantaardige organische zuren of basen worden geëxtraheerd in organische oplosmiddelen in dit stadium kan de pH van een alcohol-water extract worden verhoogd of verlaagd met een in water oplosbare zuur of base aan gedissocieerde analyten zetten in hun nondissociated vormen, die vervolgens oplosbaar in neutraal organische oplosmiddelen 9. De organische fase kan dan worden evaporated onder verminderde druk of onder stikstof en op de gewenste volume TLC. De pH van het extract waarschijnlijk dodelijk bioassay microorganismen door de verdeling van analyten in neutrale oplosmiddelen, kleine eindvolume en indampen van het extract op de TLC plaat vóór scheiding zijn. Zowel schimmels en bacteriën werkzaam zijn als proef micro-organismen in bioautografie van plantenextracten 2. Sporen van sommige schimmels, zoals Cladosporium cucumerinum ontkiemen op TLC-platen (met uitzondering van gebieden met remmende verbindingen) of gesproeid op platen in een voedingsoplossing en geïncubeerd in een vochtige omgeving voor meerdere dagen 3. De donkere mycelium van C. cucumerinum op non-inhibitive zones zorgt voor een scherp contrast met zones vrij van myceliumgroei. Hoewel bacteriën zijn toegepast op dunnelaagchromatografie (TLC) platen op dezelfde wijze 4,12, zijn bacteriën ook uitgegoten over TLCplaat oppervlakken in agar overlays 13,14. Gist zoals Candida albicans, kunnen worden toegepast agar overlays en 14. Als alternatief TLC-platen kan worden gezicht naar beneden geplaatst op agar geënt met bacteriën 10,15 of gist 8, een methode die bekend staat als contact bioautografie 2. We beschrijven een methode voor contact bioautografie om te screenen op antimicrobiële fenolen uit rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland). De test micro-organisme Clostridium sticklandii, een pens hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) en obligaat anaërobe. Hoewel de scheidingen die niet alle componenten van het extract lossen, vergemakkelijken ze de identificatie van gebieden van antimicrobiële activiteit, waardoor het verkleinen van de pool van mogelijke antimicrobiële verbindingen. Het protocol maakt gebruik van standaardprocedures voor TLC 1. Het protocol beschrijft ook een aantal van de technieken die nodig zijn voor het kweken obligate anaeroben voor een dergelijke test, een gebruik van contact bioautografie 15 en een visualisatie methode met een tetrazoliumzout, die levende cellen 2,4 vlekken.

<table><tbody><tr><td>Silica F254 TLC-platen, aluminium-ondersteund, dikte 0,2 mm, 20 cm x 20 cm</td><td>EMD Chemicals</td><td>5554/7</td><td>Deze platen zijn bedekt met silica die een indicator bevat die fluoresceert bij 254 nm.&nbsp; Verbindingen die absorberen bij die golflengte, verschijnen donker op een fluorescerend groen achtergrond.&nbsp; Alternatieve bronnen omvatten Analtech, Selecto Scientific, Fluka.&nbsp; Andere adsorbentia dan silica kunnen nodig zijn.&nbsp; Platen met plastic achterkant kunnen geschikt zijn, afhankelijk van de te gebruiken oplosmiddelen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Scherpe, zware schaar&nbsp;</td><td>elke naaibenodigdhedenwinkel</td><td>vergelijkbaar met Fiskars 175800-1002</td><td>Voor het snijden van TLC-platen.&nbsp; Een papiersnijder met een scherp mes kan ook worden gebruikt.&nbsp; Adem geen silicastof in.</td></tr><tr><td>Droogoven bij 100 &deg;C (mechanische convectie)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PR305225M</td><td>Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com); Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)</td></tr><tr><td>TLC-kamer</td><td>Kimble Chase</td><td>416180-0000</td><td>Alternatieve bronnen:&nbsp; Aldrich. Pyrex bekers of conserveringspotten kunnen worden gebruikt voor kleine platen (bijv. 5 cm x 10 cm).&nbsp; Bedek met aluminiumfolie (potdeksels kunnen materiaal bevatten dat kan worden geëxtraheerd door oplosmiddeldampen).</td></tr><tr><td>50 &micro;l-spuit met platte naaldpunt</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td>Voor het laden van hoeveelheden standaard of monster die groter zijn dan 5-10 &micro;l.&nbsp; Alternatieve bronnen zijn gelijkwaardig.</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Drummond</td><td>2-000-001</td><td>Voor het laden van kleine hoeveelheden standaarden of monsters.&nbsp; Alternatieve bronnen:&nbsp; VWR.&nbsp; Ook kunnen Pasteur-pipetten met een butaanbrander worden uitgerekt tot een dunnere diameter.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Filterpapier (#1-kwaliteit)</td><td>Whatman</td><td>1001 917</td><td>Dient als kamerwrik.&nbsp; Andere kwaliteiten filterpapier zijn OK.&nbsp; Deze maat kan worden bijgesneden voor de kamers die platen van 20 cm x 20 cm bevatten.&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolventang</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-186</td><td>Voor het in en uit een grote TLC-kamer zetten van platen.&nbsp; Alternatieve bronnen: VWR&nbsp;</td></tr><tr><td>Pincet met platte rand</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-275</td><td>Voor het in en uit een kleine kamer zetten van platen. Alternatieve bronnen: VWR </td></tr><tr><td>Kleine draagbare UV-lamp met 4 W of 6 W-lampen voor kort- en langgolf UV-lichtverlichting (respectievelijk 254 en 365 nm)</td><td>Ultraviolet Products</td><td>95-0271-01</td><td>Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation (www.spectroline.net)</td></tr><tr><td>Beeldkast voor gebruik met hand-UV-lamp</td><td>Ultraviolet Products</td><td>Chromato-Vue C-10E</td><td>UV-actieve banden zijn gemakkelijker omcirkeld als platen hierin kunnen worden geplaatst.&nbsp; Alternatieve bronnen: Spectronics Corporation.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fotodocumentatiesysteem met overhead UV-lamp en zichtbare lamp</td><td>Kodak</td><td>Gel Logic 200</td><td>&nbsp;Alternatieve bronnen: Ultraviolet Products (www.uvp.com).&nbsp; Zie protocol voor zelfgemaakte alternatief.</td></tr><tr><td>Anaërobe kamer, type A, vinyl</td><td>Coy</td><td>7150000</td><td>Deze kamer is geschikt voor anaërobe bacteriën, zoals Clostridium sticklandii, zoals beschreven. &nbsp;Echter, groeiomstandigheden moeten worden aangepast aan het organisme dat in de test wordt gebruikt.&nbsp; Een bioveiligheidskast en andere voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen als pathogene organismen worden gebruikt. Alternatieve bronnen: Anaerobe Systems, BioRad, Plas Labs, anderen&nbsp;</td></tr><tr><td>Tetrazolium rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td>Alternatieve bronnen: MP Biomedicals, Santa Cruz Biotechnology, Alfa Aesar</td></tr><tr><td colspan="4">Ingrediënten voor HAB-media</td></tr><tr><td>Pyridoxamine &middot; 2HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9380</td><td>Voor dit en voor alle andere reagentia in deze tabel zijn alternatieve bronnen gelijkwaardig.</td></tr><tr><td>Riboflavine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4500</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3902</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3376</td><td></td></tr><tr><td>Calcium D-Pantothenaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>Lipoic Zuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5625</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoëzuur&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9878</td><td></td></tr><tr><td>Foliumzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8798</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Cobalamine&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3607</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9130</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>IJzersulfaat &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>Zinksulfaat &middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0251</td><td></td></tr><tr><td>Manganchloride &middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td></td></tr><tr><td>Borzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Kobaltchloride &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Koperchloride &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459097</td><td></td></tr><tr><td>Nikkelchloride &middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203866</td><td></td></tr><tr><td>Natriummolybdaat &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase (pancreatische digest van caseïne)</td><td>Thermo Fisher</td><td>B11921</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch watervrij</td><td>Thermo Fisher</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat &

thin-layer chromatographic (tlc) scheidingen en bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Een gemeenschappelijke scherm plantaardige antimicrobiële verbindingen bestaat uit het scheiden plantaardige extracten van papier of dunne-laag chromatografie (TLC of PC), waardoor de chromatogrammen microbiële suspensies (bijv. schimmels of bacteriën in bouillon of agar), waarbij tijd voor de microben groeien een vochtige omgeving, en visualiseren zones zonder microbiële groei. De doeltreffendheid van deze screening methode bekend als bioautografie, afhankelijk van de kwaliteit van de chromatografische scheiding en de zorgvuldigheid microbiële kweekomstandigheden. Dit artikel beschrijft standaardprotocollen voor TLC en contact bioautografie met een nieuwe toepassing om-zuur gistende bacteriën aminozuren. Het extract wordt afgescheiden in flexibele (aluminium omlijsting) silica TLC-platen en banden gevisualiseerd onder ultraviolet (UV) licht. Zones zijn uitgesneden en gedurende de voorkant omlaag op agar geënt met de test micro-organisme. Remmende banden worden gevisualiseerd door kleuring van de agar plaats met tetrazolium rood. De methode wordt toegepast op de scheiding van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) fenolen en hun screening op activiteit tegen Clostridium sticklandii, een hyper-ammoniak producerende bacterie (HAB) die is afkomstig uit de runder pens. De TLC methoden toepassen op vele soorten plantenextracten en andere bacteriesoorten (aëroob of anaëroob), evenals schimmels, kan worden gebruikt als testorganismen als cultuuromstandigheden worden aangepast aan de groeivereisten van de soort passen.

Vertegenwoordiger silica TLC scheidingen van rode klaver (Trifolium pratense cv. Kenland) extracten, het bevat fenolische verbindingen, zijn weergegeven in figuur 2. Scheiding van rode klaver extract in ethylacetaat-hexaan (9:1, v / v), meer dan 8,5 cm, resulteerde in vijf banden, een onvolledig gescheiden van de oorsprong (Figuur 2A). Echter, Figuur 2B toont aan dat ongeveer tweemaal zoveel banden werden onthuld wanneer een ander monster van rode klaver extrac...

Methoden worden beschreven voor dunne-laag chromatografie (TLC) scheiding van plantenextracten en contact bioautografie antibacteriële metabolieten te identificeren. De methoden worden toegepast op de screening van rode klaver fenolen remmen hyper-ammoniak-producerende bacteriën (HAB) thuishoren in de runder pens.

Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van plantmetabolieten die antimicrobiële eigenschappen hebben tegen anaerobe bacteriën. Dit wordt bereikt door eerst een plantextract te scheiden middels dunne-laagchromatografie of TLC. Vervolgens wordt het chromatogram gesneden in zones die één of meer verbindingen bevatten.De zones worden vervolgens geplaatst op agar die is geïnoculeerd met anaerobe bacteriën en geïncubeerd. Na de incubatie worden de zones verwijderd en worden de platen gekleurd om verbindingen te identificeren die de bacteriële groei remmen. De resulterende gegevens onthullen de aanwezigheid of afwezigheid van antimicrobiële plantmetabolieten.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van herkauwervoeding, zoals wat de effecten zijn van secundaire plantenmetabolieten op de nutriëntenbenutting door specifieke micro-organismen. Hoewel deze methode plantenverbindingen onthult die remmend werken op pensbacteriën, kan zij ook worden toegepast om verbindingen te identificeren die remmend werken op andere bacteriën of schimmels.In dit protocol worden fenolische verbindingen uit rode klaver gebruikt om de identificatie van

thin-layer-chromatographic-tlc-separations-bioassays-plant-extracts

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Samenstelling van de polaire lipiden extracten en de vetzuursamenstelling van de individuele glycerolipids worden bepaald in een eenvoudige en robuuste lipide profilering experiment. Voor dit doel worden glycerolipids geïsoleerd door dunnelaagchromatografie en onderworpen aan transmethylation van hun acylgroepen. Fatty acyl methylesters worden gekwantificeerd door middel van gas-vloeistofchromatografie.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling door Thin Layer Chromatography (TLC) Samen met de gas-vloeistofchromatografie (GLC)

Natuurlijke producten vormen veelbelovende uitgangspunten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en therapeutische middelen. Vanwege de grote chemische diversiteit is het vinden van nieuwe therapeutische verbindingen van planten echter een uitdagende en tijdrovende taak. We beschrijven een vereenvoudigde aanpak om antimicrobiële en antibiofilmmoleculen te identificeren uit plantenextracten en fracties.

Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen

Het huidige protocol ontwikkelde een methode om de opbrengst van verbindingen op de TLC-plaat te schatten met behulp van de blauw-LED-verlichtingstechniek. De voordelen van deze aanpak zijn dat het veilig, effectief en goedkoop is en de onderzoeker in staat stelt om meerdere monsters tegelijkertijd te meten.

Schatting van de opbrengst van verbindingen op de TLC-plaat via de Blue-LED-verlichtingstechniek

We beschrijven het gebruik van dunne-laagchromatografie, directe bioautografie-assay en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie om microbiële natuurlijke producten te identificeren die antagonisme vertonen tegen schimmelpathogenen, met behulp van de ziekteverwekker Sclerotinia sclerotiorum en biopesticide Bacil-isolaten als modelsysteem.

Bioassay-geleide identificatie van natuurlijke producten voor biologische bestrijding door dunnelaagchromatografie-directe bioautografie

Deze studie ontwikkelde een hoogpresterende vloeistofchromatografie in combinatie met triple quadrupole mass spectrometry (HPLC-QQQ-MS) methode om tropaanalkaloïden (hyoscyamine, anisomine, scopolamine) in Anisodus tanguticus te identificeren en te kwantificeren. De methode bleek snel, nauwkeurig en betrouwbaar voor high-throughput analyse van medicinale planten.

Een efficiënte en snelle HPLC-QQQ-MS-methode voor de kwantificatie van tropaanalkaloïden in medicinale planten

Zoogdieren omhulsel bevat oplosmiddel-extraheerbare lipiden die chemische samenstelling kenmerkend is voor individuele soorten kan bieden. Dit document presenteert een routinemethode voor het scheiden brede lipideklassen Integumentair geïsoleerd uit weefsels met behulp van dunnelaagchromatografie en waarin de triacylglyceride profiel door matrix-geassisteerde laser desorptie / ionisatie time-of-flight massaspectrometrie.

Profilering de triacylglyceride Inhoud in Bat Integumentary Lipids door preparatieve Dunnelaagchromatografie en MALDI-TOF massaspectrometrie

Twee methoden voor het toewijzen van de α- en ε-dimethylamine nucleaire magnetische resonantiesignalen van een reductief 13C-gemethyleerd N-terminaal lysine worden beschreven. De ene methode maakt gebruik van de pH-geïnduceerde selectiviteit van de reductieve methyleringsreactie, en de andere maakt gebruik van aminopeptidase om selectief het N-terminale lysine te verwijderen.

Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Deze video geeft een protocol voor de massaspectrometrische analyse van de vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met elektronimpactionisatie ionisatie. De voorgestelde techniek is bijzonder interessant voor anorganische chemici werken met metaal organyls, silanen of fosfanen die moeten worden behandeld met inerte omstandigheden, zoals de Schlenk-techniek.

Analyse van vluchtige en oxidatie gevoelige verbindingen met behulp van een Cold Inlaat Systeem en Electron Impact Massaspectrometrie

Dit protocol beschrijft de specifieke technieken die worden gebruikt voor de structurele karakterisering van het reducerende einde (RE) en de interne glycosylsequenties van heteroxylanen door het RE te labelen met 2-aminobenzamide voorafgaand aan enzymatische (endoxylanase) hydrolyse en vervolgens analyse van de resulterende oligosacchariden met behulp van massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR).

Sequencing van Plant Muur Heteroxylans Met behulp van Enzymatische, Chemical (Methylering) en fysieke (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Technieken

Werkwijze combineren uitgebreide tweedimensionale gaschromatografie met stikstof chemiluminescentiedetectie is ontwikkeld en toegepast op on-line analyse van stikstofhoudende verbindingen in een complexe koolwaterstof matrix.

On-line analyse van stikstofhoudende verbindingen in Complex Hydrocarbon Matrix

Leer hoe je antimicrobiële plantenmetabolieten identificeert met dunne-laagchromatografie en contactbioautografie. Deze methode toont antibacteriële werking tegen anaërobe bacteriën in rode klaverextracten.

Thin-layer Chromatographic (TLC) Scheidingen en Bioassays van plantenextracten te identificeren antimicrobiële verbindingen

Meer video's verkennen