Urineblaas Uitzetting Evoked visceromotorische Responses als een model voor de pijn in de blaas in Muizen
27 april 2014
Ongeveer 3-8.000.000 mensen in de Verenigde Staten heeft last van interstitiële cystitis / pijn in de blaas syndroom (IC / BPS), een invaliderende aandoening die gekenmerkt wordt voor een deel door bekkenpijn. Om zenuwstelsel bijdragen aan de toestand te bestuderen, is een fysiologisch model urineblaas pijn in muizen en ratten.
Het algemene doel van deze procedure is het vaststellen van een fysiologisch model van nociceptieve blaaspijn bij muizen gedurende de gehele procedure. De lichaamstemperatuur wordt behouden met een warmtemat en een bovenliggende stralingsverwarmer. De eerste stap van de operatie is het inbrengen van een katheter in de urethra van de geanestheseerde muis.
De tweede stap is het maken van een incisie om de linker buikspier bloot te leggen. De derde stap is het nemen van een stukje spierweefsel met een naald van 21 gauge. Vervolgens wordt een gebogen zilverdraadelektrode in de naald gevoerd.
De naald wordt vervolgens teruggetrokken door de spier, waarbij de draad in de spier achterblijft. Dit proces wordt herhaald voor een tweede zilverdraad-elektrode. De vierde stap is het plaatsen van een aardingsdraad in de borstkas van de muis.
De vijfde stap nu de operatie is voltooid, is het oprekken van de blaas en het registreren van de EMG-responsen. Dit gebeurt door eerst de drie zilverdraadelektroden aan te sluiten op een versterker en digitaliseerder om de viscerale motorische respons (VMR) te registreren. Vervolgens wordt de blaascatheter aangesloten op een tijddrukregelaar en luchttank om specifieke stimuli toe te dienen die de blaas oprekken met verschillende drukken van 15 millimeters kwik.
Er is geen VMR geregistreerd. Echter, bij 30, 45 en 60 millimeter kwik neemt de VMR toe bij een stijgende druk. Wanneer dit wordt uitgezet, is een graduele stapsgewijze toename van de genormaliseerde VMR zichtbaar bij toenemende drukken.
Deze procedure kan helpen bij het verkrijgen van inzicht in viscerale blaaspijn. In het bijzonder kan men, met behulp van het model van blaasdistensie, het gehele zenuwstelsel onderzoeken in de context van nociceptieve viscerale stimulatie. Dit omvat het registreren en onderzoeken van de perifere zenuwen zelf, secundaire neuronen in het ruggenmerg en hogere neuronen in de hersenstam en de hersenen.
Bovendien kunnen nieuwe therapeutische middelen voor de behandeling van blaaspijn bij mensen worden getest in dit fysiologische model van blaaspijn. Wek een anesthetische toestand op door de muis in een inductiekamer te plaatsen met 2 tot 3% isoflooraan. Haal de muis uit de inductiekamer nadat deze zijn rechtreflex heeft verloren.
Plaats de muis in de neuskegel bij 2 tot 2,5% isofluraan. Draai de muis vervolgens om zodat de dorsale zijde naar beneden is gericht. Controleer na het omdraaien de diepte van de anesthesie door in de teen te knijpen met een pincet.
Er mag geen reactie van het dier zijn. Houd vervolgens de urethrale opening met een pincet voorzichtig loodrecht op het lichaam van de muis en voer de punt van de katheter in de urethra in. Breng de katheter naar beneden zodat deze parallel loopt aan het lichaam van de muis, en voer de katheter voorzichtig in het lichaam van de muis in.
Druk voorzichtig op de onderbuik om eventuele urine uit de blaas te verdrijven. Neem dit op met een stuk keukenpapier. Breng alcohol aan op de onderbuik om het gebied te desinfecteren.
Maak een incisie van één tot twee centimeter in het gesteriliseerde gebied om de linker buikspier bloot te leggen. Gebruik de schaar om de huid te spreiden en het fascia los te maken, zodat de musculus obliquus externis abdominalis wordt blootgelegd. In deze afbeelding bevindt de buikspier zich nabij de bovenkant van de chirurgische opening en de lug-spier aan de onderkant.
Gebruik een naald van 21 gauge om een klein stukje spierweefsel af te nemen. Duw de naald door de spier. Het is belangrijk om tijdens dit proces bloedvaten te vermijden.
Voer vervolgens één uiteinde van de zilverdraad door de naald. Trek de naald terug door de spier om de zilverdraad in de spier te trekken; de draad moet vlak liggen tegen het stuk spier. Herhaal dit proces.
Implanteer een tweede zilverdraad, ongeveer 0,5 centimeter vanaf de eerste draad. Implanteer vervolgens een derde zilverdraad in de borstkas. Deze draad dient als aarding.
Breng warme minerale olie aan op de blootgelegde buikspieren om deze vochtig te houden. Positioneer de muis opnieuw zodat deze in een comfortabele houding op zijn zij ligt. Sluit vervolgens de elektrodeklemmen aan op de zilverdraadelektroden.
Positioneer de drie klemmen zodanig dat de draden elkaar niet raken. Verlaag de anesthesie naar 1,5% zodra de operatie is voltooid. Verlaag vervolgens het anesthesieniveau elke 15 minuten met 0,125% totdat de muis een flexierespons op de teen vertoont.
Knijp zonder vocalisatie of ambulatie. Sluit de blaascatheter aan op de luchtslang die is verbonden met de tijd-drukregelaar. Dit wordt gebruikt om de lengte van het interval vóór de druktoepassing, de drukreksproef en het interval na de druktoepassing te regelen.
Voer een distensie uit bij 60 millimeter kwik om de reactie van de muis op de distensie te testen. Er moet een sterk EMG-signaal van meer dan 0,5 volt zichtbaar zijn. Indien dit het geval is, voer dan nog twee distensies uit om de respons te bevestigen.
Als de passende respons niet wordt waargenomen, moet het isofluraan-niveau worden verlaagd. Als de muis begint te vocaliseren of mobiel wordt tijdens de distentieproef, moet het isofluraan-niveau worden verhoogd. In het huidige voorbeeld is een sterke EMG-respons te zien.
Dit zou worden beschouwd als een goede bimo-respons op blaasdistensie en een aanpassing van het isofluorine-niveau zou niet nodig zijn. Veel studies maken gebruik van graduele distensies die beginnen bij lage drukken, zoals 15 mmHg, en opbouwen naar meer noxiouse drukken. De gegevens zijn nu verzameld.
Het moet worden verwerkt en geanalyseerd. De eerste stap is het rectificeren van de gehele dataset door de absolute waarde van elk punt te nemen. Dit kan het eenvoudigst worden gedaan met data-analyse software, maar kan ook handmatig worden uitgevoerd.
Nu de gegevens zijn gecorrigeerd, bepaalt u de gemiddelde EMG-respons tijdens het achtergrondgedeelte van het experiment. Trek deze achtergrond-EMG-respons af van elk datapunt in het experiment om de achtergrondgecorrigeerde dataset te verkrijgen. Bepaal vervolgens de oppervlakte onder de curve voor het interval vóór de druktoepassing, gevolgd door de oppervlakte onder de curve voor een proef met drukdistensie.
Dit proces wordt herhaald voor alle intervallen vóór de druktoename en alle proeven met drukdistensie. Hier is een screenshot van een set geanalyseerde gegevens. De grafieken zijn van boven naar beneden geordend: de ruwe EMG, de druk geregistreerd door een druksensor, het stimulussignaal en tot slot de grafiek van het oppervlak onder de curve.
In dit voorbeeld moet men, om de niet-genormaliseerde VMR voor de eerste drukdistensieproef te bepalen, simpelweg de berekende oppervlakte onder de curve aan het begin van de proef aftrekken van de oppervlakte onder de curve aan het einde van de proef. Ten slotte wordt de oppervlakte onder de curve van elke drukdistensieproef genormaliseerd ten opzichte van de laagst gemeten proef in het interval vóór de druktoename. Dit gebeurt door elke drukdistensieproef te delen door de laagste proef in het interval vóór de druktoename om de genormaliseerde VMR in volts per seconde te verkrijgen.
Hier is een grafiek die de genormaliseerde VMR laat zien voor één set distensies variërend van 15 tot 75 millimeters kwik. Er is een geleidelijke toename van de VMR op de Y-as zichtbaar bij toenemende druk op de X-as. Bovendien is over drie sets van geleidelijke distensies variërend van 15 tot 75 millimeters kwik te zien dat de totale VMR van deze muis consistent is tussen de sets.
De stabiliteit van deze techniek maakt het mogelijk om manipulaties uit te voeren die meerdere uren kunnen duren. Ten slotte wordt hier het belang geïllustreerd van het zorgvuldig bewaken van de lichaamstemperatuur tijdens de VMR-procedure voor blaasdistensie. Hier is een set gegevens die aantoont dat een daling van de lichaamstemperatuur van 37.5 naar 33.5 °C leidt tot een significante afname van de VMR bij een blaasdistensie van 60 mmHg.
Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u chirurgisch draadelektroden en een blaascatheter implanteert voor gebruik in het model van blaasdistensie voor visceraal pijnonderzoek. U zou nu ook een beter inzicht moeten hebben in hoe de door deze assay gegenereerde gegevens worden geanalyseerd. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie vestigt een fysiologisch model van nociceptieve blaaspijn bij muizen. Het model is bedoeld om de bijdragen van het zenuwstelsel aan interstitiële cystitis/blaaspijnsyndroom (IC/BPS) te onderzoeken, een aandoening die miljoenen mensen treft.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Fysiologie
- Urologie
Achtergrond
- Interstitiële cystitis/blaaspijnsyndroom (IC/BPS) treft 3-8 miljoen mensen in de VS.
- IC/BPS wordt gekenmerkt door bekkenpijn en urinaire symptomen.
- Het begrijpen van de onderliggende mechanismen is cruciaal voor de ontwikkeling van behandelingen.
- Diermodellen zijn essentieel voor het bestuderen van pijnmechanismen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar model te creëren voor het bestuderen van blaaspijn.
- Om de rol van het zenuwstelsel bij IC/BPS te onderzoeken.
- Om toekomstig onderzoek naar pijnbehandelingsstrategieën te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het handhaven van de lichaamstemperatuur met een warmtemat en een stralingsverwarmer.
- Het inbrengen van een katheter in de urethra van geanestheseerde muizen.
- Het maken van een incisie om de linker buikspier bloot te leggen.
- Het gebruik van een naald van 21 gauge om een stukje spierweefsel te nemen en het inbrengen van een gebogen zilverdraad-elektrode.
Belangrijkste Resultaten
- Het model induceert succesvol blaaspijn bij muizen.
- Fysiologische reacties op blaaspijn kunnen worden gemeten.
- Dit model kan worden gebruikt voor verdere studies naar IC/BPS.
- Bevindingen kunnen leiden tot een beter begrip en betere behandelopties.
Conclusies
- Er is een fysiologisch model van blaaspijn vastgesteld.
- Dit model zal helpen bij het begrijpen van de mechanismen van IC/BPS.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om de patiëntenzorg te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit model biedt een fysiologisch relevant systeem voor het bestuderen van de mechanismen van viscerale pijn die ten grond liggen aan interstitiële cystitis/blaespijnsyndroom (IC/BPS), een aandoening met een aanzienlijke onvervulde medische behoefte. Door gegradeerde, kwantificeerbare visceromotorische responsen (VMR) op blaasdistensie mogelijk te maken, ondersteunt het de targetvalidatie en het mechanistische de-risking in vroege discovery-fasen. De reproduceerbaarheid van de assay en de readout over het gehele zenuwstelsel faciliteren translationele continuïteit van targetidentificatie naar preklinische validatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & doelvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door nociceptieve responsen te meten in perifere, spinale en supraspinale compartimenten van het zenuwstelsel.
- Operationele waarde: Biedt een betrouwbare, dosisafhankelijke uitkomstmaat (VMR) die studies naar target engagement en padmodulatie ondersteunt.
- Strategische waarde: Ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van targets door de menselijke fysiologie van blaaspijn te modelleren in een muissysteem.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve, genormaliseerde VMR-outputs die vergelijking van blaaspijnreacties over verschillende experimentele condities mogelijk maken.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde chirurgische en stimuleringsprotocollen waarborgen de reproduceerbaarheid tussen laboratoria en tijdspunten.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare screening van nieuwe therapeutica voor blaaspijn mogelijk met gebruik van een fysiologisch gevalideerd eindpunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Modelleert pijn door blaasvulling die relevant is voor de ziekte, in overeenstemming met de klinische symptomen van IC/BPS.
- Operationele waarde: Ondersteunt longitudinale studies dankzij een stabiele VMR-respons over meerdere uren bij een juiste temperatuurregeling.
- Strategische waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door mechanistisch inzicht te bieden in de analgesicum-effectiviteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay voor blaasdistensie-VMR past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische efficiëntietests, in het bijzonder voor op het CZS werkende analgetica en blaasgerichte modulatoren.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing van de bijdragen van het zenuwstelsel aan viscerale pijn door registratie mogelijk te maken vanuit primaire afferenten, het ruggenmerg en hersengebieden.
- Screening: Levert kwantitatieve, drukafhankelijke VMR-uitlezingen die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van verbindingen op de signalering van blaaspijn.
- Analytics: Biedt genormaliseerde area-under-curve VMR-metingen die statistische vergelijking tussen behandelingsgroepen en drukgradiënten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Modelleert klinisch relevante pijn bij het vullen van de blaas, wat de continuïteit naar preklinische validatie van blaaspecifieke therapeutica ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Vormt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van viscerale pijnmechanismen over meerdere therapeutische programma's en doelwitklassen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in pijnpaden van de blaas door read-outs van het perifere, spinale en centrale zenuwstelsel te integreren.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde elektrodenimplantatie, drukgestuurde distensie en VMR-analyse waarborgen de reproduceerbaarheid van de assay.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de ontdekkingsfase objectieve, kwantificeerbare gegevens over pijnmodulatie te verschaffen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van therapeutica voor blaaspijn mogelijk op basis van dosis-responsprofielen en target engagement-profielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Ervaring met knaagdierchirurgie, implantatie van elektroden en blaascatheterisatie is vereist.
- De instrumentatie omvat drukregelaars, versterkers, digitaliseerders en temperatuurmonitoringsystemen.
- Standaardisatie van de chirurgische techniek, de diepte van de anesthesie en de parameters voor blaasdistensie is essentieel voor de vergelijkbaarheid van de gegevens.
- Aanpassing aan verschillende muizenstammen of pijnmodellen kan validatie van de baseline VMR en druk-responscurven vereisen.
- Het handhaven van normothermie is cruciaal, aangezien hypothermie de VMR aanzienlijk afzwakt en de integriteit van de gegevens in gevaar brengt.
