Name: -Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit Drosophila Tissues voor de analyse van genexpressie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer affiniteitsgebaseerde isolatie van gelabelde kernen uit Drosophila-weefsels voor genexpressieanalyse. Deze methode maakt onderzoek naar specifieke celtypen en chromatine-immunoprecipitatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Janice Fischer voor het verstrekken van de UAS-EGFP :: Msp-300 KASH plasmide. De mAB24B10 antilichaam werd verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Departement Biologie. De repo-GAL4 voorraad (BL7415) werd verkregen uit de Bloomington Stock Center aan de Universiteit van Indiana. Steun van de American Cancer Society Institutioneel Onderzoek Subsidie ​​(IRG # 58-006-53) aan de Purdue University Center for Cancer Research is dankbaar erkend. Jingqun Ma wordt ondersteund door een landbouwkundig onderzoek aan de Purdue-assistentschap in Voedsel-en Landbouworganisatie van de Purdue University.

1. Generatie en karakterisering van EGFP :: KASH Drosophila <ol><li> Cross Gal4 bestuurder vliegt naar UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vliegt. Als alternatief kunnen recombinante vliegen die zowel de Gal4 bestuurder en de UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen worden gegenereerd met behulp van standaard genetische technieken. Deze tweede benadering is voordelig wanneer grote aantallen nakomelingen vereist. </li><li> Karakteriseren uitdrukking van de EGFP :: KASH marker met behulp van standaard microscopische technieken. Opmerking: EGFP expressie kan met standaard microscopische technieken worden waargenomen ontleed, vaste Drosophila weefsels, of geheel larven en maakt gebruik van een antilichaam vereisen. <ol><li> Bepaal het expressie patroon van de EGFP :: KASH marker in het gehele organisme onder een fluorescentie microscoop ontleden (zie Materials PDF). Opmerking: Veel Gal4 chauffeurs, met inbegrip van de repo-GAL4 driver weergegeven in figuur 1, vertonen nonspecific patronen van meningsuiting in andere larvale weefsels zoals de speekselklier (zie resultaten). </li><li> Analyseer de EGFP :: KASH expressie patroon in de ontleed weefsel van belang met behulp van confocale microscopie. <ol><li> Bevestig het weefsel van belang formaldehyde in een eindconcentratie van 4%, en vlek DNA met DAPI bij een uiteindelijke concentratie van 0,1 ug / ml voor de lokalisatie van de EGFP :: KASH tag opzichte DNA te visualiseren. </li><li> Acquire beelden met behulp van een 40x / 1,30 olie-immersie objectief of 20X / 0,75 olie-immersie objectief, afhankelijk van de grootte van het weefsel van belang. De volgende excitatie / emissie omstandigheden kunnen worden gebruikt voor het verwerven: 408 nm/425-475 nm (DAPI), 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Isoleer Kernen van Drosophila larven Tissues <ol><li> Bereid uitrusting voor de larvale weefsel dissectie en daaropvolgende kernen isolement. Letgeheel dechorionated embryo kan ook worden gebruikt als uitgangsmateriaal indien gewenst. Aanbevolen gedeeltelijk ontleed larvale weefsels gebruiken in plaats van gehele larven als het celtype aanwezig in een bepaald weefsel zoals de imaginale schijf. Dit vermindert niet-specifieke binding en elimineert problemen die kunnen worden veroorzaakt door expressie van sommige Gal4 chauffeurs nontarget cellen ook. <ol><li> Bereid twee paar scherpe pincet (zie Materialen PDF), een gesiliconiseerde 9-goed glasplaat (zie Materialen PDF), en PBT (1x PBS, pH 7,4, 0,1% Tween-20). </li><li> Prebind de GFP antilichaam aan de magnetische korrels. Deze stap moet worden gestart voor het begin van de dissectie. Voeg 10 ul van de magnetische korrels (Invitrogen, zie Materialen PDF) en 2 ug GFP antilichaam (Roche, zie Materialen PDF) tot 400 ui wasbuffer (1 x PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl2) in een 1,5 ml buis . De hoeveelheid kralen en antilichaam gebruikt kunnen worden geoptimaliseerd indien nodig op basis van de hoeveelheid doel in de samPLE en de bindingsaffiniteit van het antilichaam aan de beads. </li><li> Incubeer de kralen en antilichamen met rotatie ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Plaats de 1,5 ml buis met de kralen en antilichaam in de magnetische rek (zie Materialen PDF) en laat de korrels te binden aan de magnetische ongeveer 1-2 minuten. Verwijder het supernatant dat het ongebonden antilichaam en wasbuffer met een pipet 1 ml. De beads gebonden aan de wand van de buis van 1,5 ml aan de zijkant naast de magneet blijven. </li><li> Tweemaal Spoel de kralen met 1 ml wasbuffer telkens zoals beschreven in paragraaf 2.1.4. Verwijder de 1,5 ml tube uit de magnetische rek en keer kort aan de korrels te mengen en wassen buffer tijdens elke wasstap. </li><li> Bewaar de-antilichaam gebonden kralen in wasbuffer tot klaar om verder te gaan met stap 2.7. De kralen mag niet uitdrogen in elke fase van het protocol. </li></ol></li><li> Ontleden larvale weefsels in PBT en transfer ontleed weefseleen goed van de 9-goed gerecht. Typisch, dissectie van de optische kwab en oog verbeelding disc uit larven 100 derde instar voldoende informatie bevat om downstream genexpressieanalyse volgende kernen isolement. </li><li> Spoel de geïsoleerde weefsel in nucleaire extractiebuffer (10 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 10 mM KCl) in een 1,5 ml buis. Transfer geïsoleerde larvale weefsels in een 1 ml Dounce Homogenizer (zie ook Materiaal PDF) op ijs dat 1 ml vers nucleaire extractie buffer bevat. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten. Het is niet noodzakelijk proteaseremmers voegen als RNA wordt geëxtraheerd na kernen isolatie. </li><li> Verstoren het weefsel met 20 slagen met de losse stamper en vervolgens incubeer het monster op ijs gedurende 10 minuten om de cellen te zwellen. Pak de kernen van de cellen met behulp van 15 slagen met de strakke stamper. Het aantal slagen met de losse en strakke stampers moet worden geoptimaliseerd voor verschillende weefsels en celtypen overmaat homogenisering kan leidengeschoren kernen, terwijl onvoldoende homogenisatie niet alle kernen zullen halen uit het weefsel. </li><li> Filter de homogenaat, die de kernen en cellulaire puin bevat, door een 40 um poriegrootte zeef (zie Materialen PDF) die is prerinsed met nucleaire homogenisatiebuffer. Verzamel de gefilterde homogenaat in een nieuwe buis. </li><li> Collect pre-isolatie monsters voor verdere analyse kernen opbrengst kernen integriteit bepalen en transcript niveau van doelgenen voor isolatie kernen te bepalen. <ol><li> Breng 50 pl van de gefilterde homogenaat een nieuwe 1,5 ml buisje met een pipet. Dit is de pre-isolatie monster. Voeg 500 ul van Trizol reagens (zie Materialen PDF, LET), keer om te mengen, en bewaar bij -20 ° C voor daaropvolgende RNA isolatie (stap 3.1). </li><li> Breng 20 pl van de gefilterde homogenaat een nieuwe 1,5 ml buis. <ol><li> Voeg DAPI tot een eindconcentratie van 0,1 ug / ml, en meerderUbate monster op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Transfer DAPI gekleurde kernen een polylysine gecoate dekglaasje en plaats op een microscoopglaasje. Dicht de dekglaasje met behulp van duidelijke nagellak. </li><li> Controleer de kernen integriteit, en de aanwezigheid van GFP-gelabelde kernen van belang aan de hand fluorescentiemicroscoop. Opmerking: Het is niet nodig om de kernen vast of kleur wordt GFP indien deze dia redelijk snel geanalyseerd na bereiding (binnen 24 uur). </li></ol></li><li> Breng 10 pl van de gefilterde homogenaat een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 90 ul wasbuffer (1 x PBS, pH 7,4, 2,5 mM MgCl2). Voeg DAPI tot een eindconcentratie van 0,1 ug / ml en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Bepaal de kernen opbrengst in de pre-isolatie monster met behulp van een hemocytometer om de DAPI-positieve kernen rekenen met epifluorescentie onder een 10X objectief lucht. </li></ol></li><li> Plaats de 1,5 ml buis met het antilichaam gebonden korrels (bereid in paragraaf 2.1.6) in een magnetisch rek,en laat de magnetische korrels te binden aan de magneet ten minste 2 minuten zoals beschreven in paragraaf 2.1.4. Verwijder de wasbuffer uit het antilichaam gebonden kralen met behulp van een pipet 1 ml en voeg het gefilterde homogenaat van stap 2.5 de 1.5 ml buisje met een pipet 1 ml. </li><li> Keer de buis een paar keer om te mengen en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min met end-over-end agitatie. Vermijd luchtbellen in de buis, indien mogelijk, omdat deze kunnen leiden tot klonteren van de kernen. </li><li> Plaats de 1,5 ml buis met het antilichaam gebonden kralen en homogenaat in een magnetisch rek en laat de magnetische korrels te binden aan de magneet ten minste 2 minuten zoals beschreven in paragraaf 2.1.4. Verwijder het homogene mengsel met de ongebonden kernen fractie met een pipet 1 ml. </li><li> Was het monster 3x met 1 ml wasbuffer per keer. Verwijder de 1,5 ml buis met de kralen, gebonden kernen en wassen buffer uit het rek en omkeren om meerdere keren te mengen, plaats de buis vervolgens in de magnetische rek zoals beschrevenin stap 2.9 en verwijder het supernatant met een pipet 1 ml. </li><li> Voeg 150 ul wasbuffer aan de korrels, die aan het doel kernen worden gebonden. Dit is het post-isolatie monster. Bereid monsters voor microscopie analyse en daaropvolgende RNA-extractie. <ol><li> Overdracht 20 ul van de post-isolatie monster een nieuwe 1,5 ml buis en vlek met DAPI en analyseren zoals beschreven in paragraaf 2.6.2. Tel de GFP + / DAPI + en + GFP-/DAPI kernen gefotografeerd door magnetische kralen om de zuiverheid van de verrijkte GFP + kernen in de na-isolatie monster. </li><li> Voeg 1 ml van Trizol reagens aan de rest van de na-isolatie monster omkeren te mengen en bewaar bij -20 ° C voor daaropvolgende RNA-isolatie (stap 3.1). Opmerking: Monsters Trizol kan worden opgeslagen gedurende enkele weken eventueel bij -20 ° C. Het is niet noodzakelijk de kernen elueren uit de magnetische korrels voor RNA-extractie met behulp van Trizol reagens because de kralen niet interfereren met de daaropvolgende RNA-isolatie. </li></ol></li></ol> 3. Bepaal transcriptniveaus in Kernen geïsoleerd van larvale Tissues <ol><li> Isoleer RNA uit de pre-isolatie-en post-isolatie monsters bereid in paragrafen 2.6.1 en 2.11.2 met behulp van de standaard protocol beschreven voor Trizol-gebaseerde RNA-extractie (zie Materialen PDF) met de volgende wijzigingen: <ol><li> Na precipitatie van de RNA-pellet, voeg 19,2 ul RNase-vrij water en 0,8 pl RNASecure reagens (zie Materialen PDF) de pellet en incubeer bij 60 ° C gedurende 20 minuten om RNAses inactiveren. </li></ol></li><li> Bepaal de RNA-concentratie met een fluorescente RNA-bindende kleurstof zoals qubit RNA assay kit (zie Materialen PDF) met de QubitR 2,0 Fluorometer volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Samenstel cDNA met een amplificeren reverse transcriptase zoals EpiScript Reverse Transcriptase kit en oligodT primers volgens de instructies van de fabrikant. Opmerking: doorgaans 50 tot 100 ng RNA genereert voldoende cDNA uitvoeren meerdere genexpressie analyses. Equivalente hoeveelheden pre-isolatie en na isolatie RNA worden gebruikt om cDNA te genereren. </li><li> Voeg 180 ul nuclease-vrij water tot 20 ul cDNA monster om deze 10-voudig voor real-time kwantitatieve PCR (qPCR) analyse verdunnen. Deze verdunning is een belangrijke stap, omdat onverdunde cDNA monsters de qPCR kan remmen. </li><li> Bereid een qPCR master mix met polymerase en dNTPs, 4 pmol elk van voorwaartse en achterwaartse primer, opgemaakt met steriel water om het uiteindelijke reactie volume van 20 pl. <ol><li> Ontwerp qPCR primers voor genen die verwacht worden uitgedrukt in het celtype van belang richten, en in het ontwikkelingsstadium waarin het weefsel wordt verzameld. Ontwerp van primers een intron omvatten, indien mogelijk, zodat genomische encDNA PCR producten kunnen worden onderscheiden. Opmerking: Als het genexpressieprofiel van het type doelcel niet bekend, primers tegen eGFP, die specifiek in het gelabelde kernen populatie moet worden uitgedrukt, kan worden gebruikt om het protocol optimaliseren voor een bepaald celtype en weefsels (Tabel 1). </li></ol></li><li> Bepaal de relatieve transcriptniveaus van elk gen van belang in de pre-en post-isolatie isolatie monsters door vergelijking met een verdunningsreeks van cDNA bereid uit de gehele weefsel. Transcriptniveaus van target genen moet worden genormaliseerd naar een referentie-gen zoals Rpl32 (of bij voorkeur meerdere referentie-genen). </li></ol>

<ol><li>Weake, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcription+initiation+function+of+the+ubiquitous+SAGA+complex+in+tissue-specific+gene+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation.</a> Genes Dev. 25, 1499-1509 (2011).</li>
<li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+chromatin+immunoprecipitation+from+multicellular+complex+samples+using+BiTS-ChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific chromatin immunoprecipitation from multicellular complex samples using BiTS-ChIP.</a> Nat. Protoc. 7, 978-994 (2012).</li>
<li>Haenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+C.+elegans+intestinal+gene+expression+and+polyadenylation+by+fluorescence-activated+nuclei+sorting+and+3%27-end-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of C. elegans intestinal gene expression and polyadenylation by fluorescence-activated nuclei sorting and 3'-end-seq.</a> Nucleic Acids Res. 40, 6304-6318 (2012).</li>
<li>Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Vanier, C., Lynch, R. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+contributions+of+the+nuclear+and+cytoplasmic+compartments+to+global+gene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells.</a> BMC Genom. 8, 340 (2007).</li>
<li>Zhang, C., Barthelson, R. A., Lambert, G. M., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+characterization+of+cell-specific+gene+expression+through+fluorescence-activated+sorting+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global characterization of cell-specific gene expression through fluorescence-activated sorting of nuclei.</a> Plant Physiol. 147, 30-40 (2008).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INTACT+method+for+cell+type-specific+gene+expression+and+chromatin+profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana.</a> Nat. Protoc. 6, 56-68 (2011).</li>
<li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+nuclei+purification+from+whole+animals+for+genome-wide+expression+and+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Genom.+Res%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling.</a> Genom. Res. 22, 766-777 (2012).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Henry, G. L., Davis, F. P., Picard, S., Eddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+genomics+of+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+res%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific genomics of Drosophila neurons.</a> Nucleic Acids res. 40, 9691-9704 (2012).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Curr Biol. 21, 414-415 (2011).</li>
<li>Fischer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+klarsicht+has+distinct+subcellular+localization+domains+for+nuclear+envelope+and+microtubule+localization+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila klarsicht has distinct subcellular localization domains for nuclear envelope and microtubule localization in the eye.</a> Genetics. 168, 1385-1393 (2004).</li>
<li>Patterson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functions+of+Klarsicht+and+nuclear+lamin+in+developmentally+regulated+nuclear+migrations+of+photoreceptor+cells+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 600-610 (2004).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KASH+domain+protein+MSP-300+plays+an+essential+role+in+nuclear+anchoring+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The KASH domain protein MSP-300 plays an essential role in nuclear anchoring during Drosophila oogenesis.</a> Dev. Biol. 289, 336-345 (2006).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Kracklauer, M. P., Banks, S. M., Xie, X., Wu, Y., Fischer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+klaroid+encodes+a+SUN+domain+protein+required+for+Klarsicht+localization+to+the+nuclear+envelope+and+nuclear+migration+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Drosophila klaroid encodes a SUN domain protein required for Klarsicht localization to the nuclear envelope and nuclear migration in the eye.</a> Fly. 1, 75-85 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat. Genet. 40, 476-483 (2008).</li>
<li>Sepp, K. J., Schulte, J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+glia+direct+axon+guidance+across+the+CNS%2FPNS+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Peripheral glia direct axon guidance across the CNS/PNS transition zone.</a> Dev. Biol. 238, 47-63 (2001).</li>
<li>Fujita, S. C., Zipursky, S. L., Benzer, S., Ferrus, A., Shotwell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+the+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against the Drosophila nervous system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7929-7933 (1982).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol kan worden gebruikt voor het isoleren of verrijken zeer specifiek gelabeld kernen van gemengde celpopulaties in Drosophila embryonale en larvale weefsels. Met dit protocol kunnen worden geïsoleerd uit kernen ontleed weefsel in ongeveer 1 uur. De zuiverheid en de opbrengst van de geïsoleerde kernen moet proefondervindelijk worden bepaald voor elk type cel. Het kan moeilijk zijn om de kraal gebonden kernen kwantificeren bij de post-isolatie fase van het protocol met behulp van een hemocytometer vanwe...

Drosophila weefsels zoals het centrale zenuwstelsel bevatten een complex mengsel van celtypen. Dus, om cel-specifieke genexpressie profielen van Drosophila weefsels te analyseren, is het eerst nodig om een homogene populatie van specifieke cellen isoleren in voldoende hoeveelheden aan downstream-toepassingen mogelijk te maken. Werkwijzen om cellen te isoleren uit intacte weefsels omvatten laser-microdissectie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) van gehele cellen. Hoewel FACS werd gebruikt om cellen en kernen isoleren van Drosophila embryo&#39;s en van Caenorhabditis elegans voor genexpressie en chromatine profilering 1-3, kan FACS en laser microdissectie moeilijk succesvol presteren in weefsels die sterk vermengd celtypes bevatten of die cellen bevatten met onregelmatige morfologie, zoals neuronen. Om deze moeilijkheid te overwinnen, kan kernen plaats cellen geïsoleerd uit specifieke celtypen en gebruikt voor daaropvolgende gene expressie profilering. Belangrijk microarray gebaseerde mRNA analyse met behulp van RNA monsters nucleaire toont algemeen vergelijkbare resultaten met die uitgevoerd met totaal RNA 4, 5. Bovendien genexpressie analyse met behulp van nucleaire RNA is met succes gebruikt om genexpressie in diverse organismen, waaronder C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila en mensen 4, 5 2, 3. Verschillende benaderingen zijn onlangs beschreven voor het isoleren van specifieke populaties van gemerkte kernen van Drosophila weefsels die geschikt zijn voor genexpressie-analyse en / of chromatine immunoprecipitatie zijn. De partij isolatie van weefsel-specifieke chromatine voor methode immunoprecipitation (bits-chip) maakt gebruik van FACS om vaste kernen isoleren op basis van celtype specifieke expressie van de nucleaire-gelokaliseerde GFP 2. Deze aanpak is successfully gebruikt om de verdeling van histon modificaties en transcriptiefactoren met chromatine immunoprecipitatie van geïsoleerde kernen uit het mesoderm van Drosophila embryo 2 analyseren. Kunnen echter FACS-gebaseerde benaderingen minder geschikt voor het isoleren gemerkte kernen die slechts een klein deel van een gemengde populatie vanwege de toegenomen sorteren tijd nodig om geschikte nummers voor verdere toepassingen vinden vormen. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben verschillende groepen affiniteit gebaseerde isolatietechnieken gebruikt voor kernen die gelabeld zijn met een specifiek epitoop in een bepaald celtype zuiveren. De isolatie van kernen gelabeld in specifieke celtypen (ONBESCHADIGDE) methode ontwikkeld voor Arabidopsis thaliana 6, 7 is onlangs aangepast voor gebruik in Drosophila 8. In deze methode wordt een envelop fusie-nucleair eiwit dat een substraat voor in vivo biotinylering is coexpressed de Escherichia coli biotine ligase BirA in bepaalde celtypes. Biotine gelabelde kernen kan vervolgens worden gezuiverd uit gemengde populaties met streptavidine gebaseerde affiniteit isolatie. Met deze benadering werden kernen succes gelabeld en geïsoleerd van het mesoderm van Drosophila embryo, waarin een envelop fusie-nucleaire eiwit werd tot expressie gebracht onder controle van een mesoderm-specifieke enhancer 8. De auteurs ook gegenereerd nucleaire envelop fusie-eiwitten die kunnen worden uitgedrukt in elk celtype onder controle van de regulerende sequentie Gal4, UAS 9. Deze benadering kan snel isoleren van deelverzamelingen van gemerkte kernen van gemengde populaties, maar vereist drie afzonderlijke transgene constructen en derhalve ongeschikt voor bepaalde genetische toepassingen. Onlangs is een aanpak beschreven waarbij SUN (S AD1 en UN C-84)-domein bevattende eiwitten die lokaliseren naar de binnenmembraan van de nucleaire envelop werden gelabeld metfluorescente eiwitten en expressie onder controle van de Gal4/UAS systeem 10. Kernen werden geïsoleerd in aanwezigheid van ionische detergens aan de buitenste membraan van de kern envelop te verwijderen en affiniteit-gezuiverd via magnetische partikels gekoppeld met anti-GFP antilichamen. Deze aanpak is succesvol gebruikt om kleine populaties van gemerkte kernen van specifieke neuronale subtypes in volwassen hersenen van Drosophila 10 isoleren. Hier is een protocol voor isolatie van gemerkte kernen uit een gemengde populatie van cellen van Drosophila larven weefsel beschreven. Deze methode is onafhankelijk ontwikkeld, maar vergelijkbaar met de werkwijze beschreven door Henry et al.. 10 eerste benadering werden kernen gelabeld met een fluorescerend label dat tot expressie alleen in specifieke celtypen in Drosophila melanogaster de daaropvolgende isolatie van gemerkte kernen van gemengde populaties vergemakkelijken met een affiniteit gebaseerde benadering. Om kernen te etiketteren,de KASH (K larsicht / A nc-1 / S yn h omology) domein werd gebruikt. De KASH domein is een transmembraan domein dat lokaliseert naar de buitenste membraan van de nucleaire envelop, mede door interacties met SUN-domein-bevattende eiwitten in de perinucleaire ruimte 11. De C-terminale domein van KASH eiwitten zoals Drosophila Msp-300 en Klarsicht verankert deze eiwitten aan de buitenste kernmembraan, terwijl hun N-terminale domeinen wisselwerking met cytoskelet eiwitten zoals actine en microtubuli in het cytoplasma 12-14. Constructen werden gegenereerd waarin de KASH domein van Drosophila Msp-300 werd gefuseerd met het C-uiteinde van EGFP, onder controle van de regulerende sequentie Gal4, UAS in de pUAST-attB vector 15, 16. Met phiC31 plaatsspecifieke integratie, werden transgene vliegen gegenereerd waarin de UAS-EGFP :: Msp-300 KASH transgen is in het attP2 loci op chromosoom ingevoegd3L 17. De UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vliegt kan worden gekruist met vliegen die de Gal4 driver drukken in een bepaald celtype, waardoor de gerichte expressie van EGFP op de buitenste kernmembraan in het celtype van interesse. Gemerkte kernen kan vervolgens worden gezuiverd uit gemengde celpopulaties met antilichamen tegen GFP gekoppeld aan magnetische korrels. In deze benadering is het gebruik van ionische detergens niet vereist omdat de EGFP tag gelokaliseerd aan de cytoplasmatische zijde van het buitenste kernmembraan en derhalve toegankelijk voor antilichamen. Het hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt voor het isoleren / verrijken-EGFP gemerkte kernen van specifieke celtypen in Drosophila larvale weefsels, de zuiverheid en opbrengst van geïsoleerde kernen kwantificeren, en nucleaire RNA extract voor kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (qRT -PCR) analyse van genexpressie. De isolatie en zuivering van affiniteit-kernen (exclusief tissue dissectie) kan worden uitgevoerd in minder dan een uur. De resultaten worden weergegeven die gliale kernen succes kan worden geïsoleerd uit het larvale optische kwab en oog verbeelding schijf, en gebruikt voor daaropvolgende analyse van genexpressie. Verwacht wordt dat deze benadering bruikbaar voor de isolatie / verrijking van gemerkte kernen van embryonale en larvale weefsels waarin de doelcellen deze minder dan 5% van de totale bevolking is. Alle Drosophila voorraden en plasmiden die uit dit onderzoek zijn verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.

<table><tbody><tr><td>Anti-chaoptin antibody (muis, monoklonaal)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody (muis, monoklonaal)</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>Dit specifieke antilichaam wordt aanbevolen voor dit protocol. Er kunnen echter ook alternatieve antilichamen worden gebruikt.</td></tr><tr><td>2x Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix met ROX</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride zout)</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer (1 ml)</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet, 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G voor Immunoprecipitatie</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dit specifieke merk magnetische kralen wordt aanbevolen voor dit protocol.</td></tr><tr><td>EpiScript Reverse Transcriptase</td><td>Epicentre</td><td>ERT12910K</td><td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td></tr><tr><td>Falcon celzeefjes, 40 &mu;m poriëngrootte</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>Alternatieve poriëngroottes kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de grootte van de doelcelkernen.</td></tr><tr><td>Magnetische standaard (8 x 1,5 ml buisjes)</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini buisjesrotator</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit starter kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>Vergelijkbare op fluorescentie gebaseerde methoden voor het kwantificeren van RNA-opbrengst kunnen worden gebruikt. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td></tr><tr><td>RNAsecure (Ambion)</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>Het gebruik van dit reagens om RNAsen inactief te maken is optioneel.</td></tr><tr><td>RT-PCR machine Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>Gesiliconiseerde 9-well glazen plaat</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop Fluorescerende Adapter (Royal Blue (440-460 nm) excitatie + gele barrière</td><td>Nightsea</td><td></td><td>Deze adapter maakt het mogelijk om GFP-fluorescentie te onderzoeken met behulp van een typische disserpeermicroscoop (bijv Nikon)</td></tr><tr><td>StereoZoom Microscoop 83604 Set met 10X Wide Field Oogstukken en Universele Boom Stand</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagens</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>VOORSICHT; Alternatieve RNA-extractiemethoden kunnen worden gebruikt. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

-affiniteit gebaseerde isolatie van tagged kernen uit<em&gt; drosophila</em&gt; tissues voor de analyse van genexpressie

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonale en larvale weefsels bevatten vaak een zeer heterogeen mengsel van celtypen, welke de analyse van genexpressie kan bemoeilijken in deze weefsels. Dus, om cel-specifieke genexpressie van Drosophila weefsels te analyseren, kan het nodig zijn om specifieke celtypen met hoge zuiverheid en in voldoende hoge opbrengsten van verdere toepassingen zoals transcriptionele profilering en chromatine immunoprecipitatie isoleren. Echter, de onregelmatige cellulaire morfologie in weefsels zoals het centrale zenuwstelsel, in combinatie met de zeldzame populatie van specifieke celtypen in deze weefsels, uitdaging vormen voor traditionele methoden celisolatie zoals laser-microdissectie en fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) . Hier, een alternatieve benadering karakteriseren cel-specifieke genexpressie middels affiniteit isoleert gelabeld kernen, in plaats van hele cellen, wordt beschreven. Kernen in de specifieke cell type belang zijn genetisch gelabeld met een nucleair-envelop gelokaliseerde EGFP tag met behulp van de Gal4/UAS binaire expressie systeem. Deze-EGFP gelabeld kernen kunnen worden geïsoleerd met antilichamen tegen GFP die zijn gekoppeld aan magnetische korrels. De in dit protocol beschreven benadering maakt consistente isolatie van kernen van bepaalde celtypes in het Drosophila larven centrale zenuwstelsel bij hoge zuiverheid en op voldoende niveau voor expressie analyse, zelfs wanneer deze celtypen omvatten minder dan 2% van de totale celpopulatie in de weefsel. Deze benadering kan gebruikt worden om kernen te isoleren uit een grote verscheidenheid van Drosophila embryo&#39;s en larven celtypes in specifieke Gal4 drivers, en kunnen bruikbaar zijn voor het isoleren kernen van celtypen die niet geschikt is voor FACS of laser microdissectie bent.

De repo-GAL4 driver (Bloomington voorraad nummer 7415) is specifiek uitgedrukt in gliacellen in het Drosophila zenuwstelsel op meerdere stadia van ontwikkeling 18. Vliegen werden gegenereerd die stabiel tot expressie UAS-EGFP :: Msp-300 KASH onder controle van de repo-GAL4 via standaard genetische technieken. Om de expressie patroon van de EGFP :: KASH transgen in deze vliegen karakteriseren, het patroon van GFP-expressie in de ontleed optische kwab en oog verbee...

Drosophila weefsels bevatten vaak een heterogeen mengsel van celtypen. Om genexpressie in bepaalde celtypes van een bepaald weefsel te onderzoeken, kan kernen genetisch gemerkt en vervolgens geïsoleerd met behulp van een op affiniteit gebaseerde benadering. Geïsoleerde kernen kan worden gebruikt voor verdere toepassingen zoals genexpressie analyse en chromatine immunoprecipitatie.

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit<em&gt; Drosophila</em&gt; Tissues voor de analyse van genexpressie

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Drosophila melanogaster testes kunnen snel en efficiënt geïsoleerd van volwassen mannen met behulp van het ontleden van naalden. Met de praktijk, kan men gemakkelijk isoleren in een of twee dagen een bedrag van testes voldoende is voor de analyse van DNA of RNA door hoge throughput sequencing of meer traditionele methoden of moleculaire biologie van eiwitten voor antilichaam-of enzym-gebaseerde testen.

Isolatie van Drosophila melanogaster Testes

Hier beschrijven we een geheel gemonteerde...

Hele Mount RNA TL<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo&#39;s

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Het beschreven RNA in situ hybridisatie protocol staat toe de opsporing van RNA in hele Drosophila embryo's of ontleed weefsels. Met behulp van 96-wells microtiterplaat platen en tyramide signaal versterking, kunnen afschriften worden gedetecteerd op hoge resolutie, gevoeligheid en doorvoer, en tegen een relatief lage prijs.

Hoge resolutie fluorescentie In Situ hybridisatie in Drosophila embryo's en weefsels met behulp van Tyramide signaal versterking

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie (EASI-FISH) is een robuuste techniek die expansiemicroscopie combineert met fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de expressie van meerdere genen in dik weefsel te detecteren. Dit protocol schetst recente vorderingen in de methode en de aanpassing ervan voor het labelen van het intacte Drosophila centrale zenuwstelsel..

Multiplex detectie van genexpressie in de intacte Drosophila hersenen met behulp van expansie-ondersteunde iteratieve fluorescentie in situ hybridisatie

Het protocol beschrijft de single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) -methode om ribosomale RNA-transcripten te onderscheiden die zijn afgeleid van de X- of Y-chromosoom ribosomale DNA-locus in Drosophila melanogaster.

Single Nucleotide Polymorfisme-gevoelige FISH-detectie van Locus-specifieke ribosomale RNA-transcriptie in Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) uit te voeren in oogtische lobben van Drosophila melanogaster-larven . Procedures voor probe-ontwerp, hybridisatie, amplificatie en weefselmontage worden gedetailleerd om de visualisatie van de zich ontwikkelende optische kwab te vergemakkelijken.

Hybridisatiekettingreactie FISH in de zich ontwikkelende Drosophila optische lob

Leer affiniteitsgebaseerde isolatie van gelabelde kernen uit Drosophila-weefsels voor genexpressieanalyse. Deze methode maakt onderzoek naar specifieke celtypen en chromatine-immunoprecipitatie mogelijk.

-Affiniteit gebaseerde Isolatie van Tagged Kernen uit

Meer video's verkennen