Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Het algemene doel van deze procedure is om het nieuw geproduceerde RNA onder behandelingscondities fluorescent te labelen en de hoeveelheid hiervan te kwantificeren middels kwantitatieve beeldanalyse. Gekweekte cellen op dekglas worden behandeld met de alkyn-gemodificeerde base 5-ethynyluridine, hierna aangeduid als 5-EU, en geïncubeerd onder hypoxische condities.

Tijdens de incubatie wordt 5-EU geïncorporeerd tijdens de RNA-synthese zonder het cellulaire transcriptiemachinerie te verstoren. Vervolgens wordt het geïncorporeerde 5-EU fluorescent gelabeld door middel van een kopergekatalyseerde azide-alkyn cycloaddition of clickreactie. Het fluorescent gelabelde nascente RNA wordt vervolgens gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie en de resulterende beelden worden geanalyseerd om de hoeveelheid RNA die onder behandelings- en controlecondities is gegenereerd, te vergelijken.

Statistische analyse van de resulterende gegevens laat de veranderingen in de generatie van nascent RNA als reactie op hypoxie zien via kwantificering van vijf EU-incorporaties en detectie door fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals kwantitatieve BCR, is dat het directe visualisatie van de RNA-productie in cellen op single-cell niveau mogelijk maakt. Hoewel we deze methode hier gebruiken om te bestuderen hoe cellen reageren op een laag zuurstofgehalte, kan deze ook worden gebruikt om reacties op chemotherapeutische geneesmiddelen te bestuderen.

Onze reacties op aanvullende stressreacties waarbij een procedure wordt gedemonstreerd, zullen worden verzorgd door John Leston, een promovendus uit mijn laboratorium, met hulp van ish Kova, eveneens een promovendus, en Humana Druker, een postdoc-onderzoeker. Ten slotte zal Gus Ferguson het gebruik van software voor beeldvisualisatie demonsteren. Begin dit experiment door verschillende dekglasjes in 70% ethanol te dopen om ze te steriliseren.

Plaats de dekglasjes op de rand van een plaat in de weefselkweekkast en laat ze aan de lucht drogen onder laminaire stroming. Zodra de dekglasjes droog zijn, plaatst u één dekglasje in elk van zes schalen van 3,5 centimeter. Voeg twee milliliters warme complete DMEM toe aan elke schaal.

Druk met een pincet aan om ervoor te zorgen dat elk dekglas aan de bodem van de put blijft kleven. Om de U2 OS-cellen van de kweekschaal los te maken, wordt er één keer gewassen met drie milliliters PBS. Voeg vervolgens vier milliliters warme 0,05%trypsine en 1%EDTA toe en incubeer dit gedurende zeven minuten bij 37 graden Celsius.

Nadat er zeven minuten zijn verstreken sinds de resuspensie, worden de cellen gesuspendeerd in zes milliliter warm compleet DMEM om de trypsine-EDTA te inactiveren. Tel de cellen met een hemocytometer en zaai elke 3,5 centimeter petrischaal met dekglasplaatjes met 2 × 10⁵ cellen. Schud de schaal voorzichtig om een gelijkmatige celverdeling te waarborgen en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C, 21% zuurstof en 5% kooldioxide om de cellen te laten hechten.

Verwijder de volgende dag vijf van de schaaltjes uit de incubator. Laat het overgebleven schaaltje ongemoeid. Dit zal dienen als de normoxische positieve controle.

Plaats vier van de schaaltjes in het hypoxiewerkstation. Stel de cellen bloot aan hypoxische omstandigheden gedurende 75 minuten, 90 minuten, twee uur en 24 uur. Aan het andere schaaltje.

Voeg actinomycine D toe aan het medium tot een eindconcentratie van 10 µg/mL en plaats het geheel terug in de 37 °C incubator onder normale zuurstofomstandigheden gedurende vier uur. Deze schaal dient als de normoxische negatieve controle. Terwijl de cellen incuberen, bereidt en verzamelt u de volgende reagentia ter voorbereiding op de click-it assay.

De Click-it assay kit, PBS bij een pH van 7,2 tot 7,6, 3,7% paraformaldehyde in PBS, 1% Triton X 100 in PBS, gedeïoniseerd water, dimethylsulfoxide, 10 molair natriumhydroxide, 37% zoutzuur en pH-indicatiestrips. Zorg dat u klaar bent om een labelassay onder behandelde omstandigheden te starten. Eén uur voordat de hypoxiebehandeling eindigt, bereidt u voor het labelen van de cellen een 2x werkopleossing van EU voor vanuit de 100 millimolaire stockoplossing in voorverwarmd compleet medium.

Voeg vervolgens een gelijk volume 2 XEU toe aan het medium in de schaal met de met actinomycine D behandelde cellen, waardoor de EU wordt verdund tot de werkconcentratie. Voeg daarna, in de hypoxiekamer, de EU-stock toe aan de hypoxie-behandelde cellen. Incubeer gedurende één uur onder de kweekcondities van de behandeling na de hypoxiebehandeling, of na vier uur voor de controles.

Was elke schaal eenmaal met PBS en voeg één milliliter van de 3,7% paraformaldehydestamoplossing toe onder behandelcondities; incubeer gedurende 15 minuten onder behandelcondities. Verwijder na fixatie de cellen uit de hypoxiekamer en plaats ze in de zuurkast. Giet het fixatief af en zorg ervoor dat het paraformaldehyde-afval op een verantwoorde wijze wordt afgevoerd.

Was de cellen vervolgens één keer met PBS. Voer de volgende stappen uit bij kamertemperatuur, waarbij alle oplossingen op ijs worden bewaard bij twee tot zes graden Celsius. Om de cellen te permeabiliseren, verwijdert u de wasoplossing en voegt u aan elke well één milliliter 1% Triton X 100 in PBS toe; incubeer dit gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder de permeatiebuffer en was elke well eenmaal met PBS. Verwijder de wasoplossing van de cellen en voeg 500 microliters vers bereide RNA imaging kit reactiecocktail toe aan elk monster. Bescherm de cellen tegen licht en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder na de incubatie de reactiecocktail en de wasbuffer van de RNA-imagingkit. Spoel eenmaal met 1 mL spoelbuffer van de RNA-imagingkit; eventuele aanvullende antilichaamlabeling dient nu te worden uitgevoerd. Om het DNA te kleuren, worden de monsters gewassen met PBS, waarna de herst 3, 3, 3, 4, 2 wordt verdund tot 1:1000.

Voeg in PBS één milliliter van de verdunde HERC-oplossing toe aan elk monster. Bescherm deze goed tegen licht en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie de HERC-oplossing en was de cellen twee keer met PBS om de dekglasjes te monteren.

Breng 10 µL monteermedium aan in het midden van een standaard microscoopglas. Plaats het dekglas met de celzijde naar beneden op de druppel monteermedium. Voorkom de vorming van luchtbellen, aangezien deze de daaropvolgende beeldacquisitie zullen belemmeren.

Breng transparante nagellak aan op de rand van het dekglas om het aan het microscoopglaasje te fixeren. Laat de lak vijf minuten drogen bij kamertemperatuur. Lichtgevoelige monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C.

Neem na het mounten beelden op met een breedveldmicroscoop die in staat is tot fluorescentiedetectie. Voer de beeldvorming uit met een 40 V 1,30 NA olie-immersie-objectief en leg de beelden vast met een gekoelde CCD-camera. Leg beelden vast van minimaal 30 cellen.

Gebruik software voor beeldbewerking om de beelden te deconvolueren. Hiermee wordt optische vervorming gecorrigeerd door een softwarematige wiskundige formule toe te passen op de opgenomen beelden. Het resultaat is een scherper beeld, waardoor wordt gewaarborgd dat de daaropvolgende analyse beperkt blijft tot uitsluitend de gefotografeerde cellen.

Importeer vervolgens de afbeeldingen in de Omer O-client. Miniaturen van alle verkregen afbeeldingen worden weergegeven om de weergave-instellingen voor alle afbeeldingen binnen hetzelfde experiment te normaliseren. Pas de weergave-instellingen van de normoxische controlecellen toe op alle andere condities met behulp van de region of interest (ROI)-tool in de analysesoftware.

Selecteer in de software kernen uit elke afbeelding. Kies de optie voor intensiteitsanalyse en bepaal de gemiddelde intensiteiten voor elke ROI voor 30 tot 50 cellen. Sla de gegevens op en bereken vervolgens het gemiddelde en de standaarddeviatie voor elke conditie.

Maak tot slot met behulp van software voor datagrafieken spreidingsdiagrammen van alle individuele gemiddelde intensiteitswaarden om de variabiliteit tussen cellen onder elke conditie weer te geven. Het op deze manier uitzetten van intensiteitsgegevens is nuttig omdat het een snelle vergelijking van behandelingsresultaten mogelijk maakt en duidelijk aantoont dat er sprake is van significante heterogeniteit binnen een behandelde celpopulatie, wat anders verborgen blijft bij gebruik van standaard datarepresentaties. Maak alternatief staafdiagrammen om de gemiddelde intensiteit plus de standaarddeviatie van nascent RNA weer te geven, om zo de totale RNA-synthese kwantitatief te bepalen; U2 OS-cellen die werden behandeld met hypoxie en werden gekweekt in de aanwezigheid van 5-ethynyluridine of EU, werden vervolgens verwerkt en geanalyseerd.

Zoals in deze video wordt aangetoond, werden de fluorescentie-intensiteiten van alle cellen binnen elke behandelingspopulatie gemiddeld en uitgezet. In dit staafdiagram is een student T-test gebruikt om de statistische waarschijnlijkheid te berekenen dat elke behandelingsgroep significant verschilt van de controle. Interessant is dat deze gegevens aantonen dat er na verloop van tijd een statistisch significante toename is in de globale RNA-synthese.

Wanneer U2 OS-cellen, zoals verwacht, langer dan anderhalf uur aan hypoxie worden blootgesteld, heft een behandeling met Actinomycine D de fluorescentie-intensiteit volledig op. Deze gegevens suggereren dat de cel na langere perioden van hypoxiebehandeling haar inspanningen richt op de productie van RNA, zelfs in deze vijandige hypoxische omgeving. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe nascent RNA op single-cell niveau kan worden gelabeld en gekwantificeerd bij hypoxie en normoxie; zodra deze techniek onder de knie is, kan de procedure in twee uur worden voltooid.

Andere methoden, zoals co-kleuring met antilichamen tegen RNA-polymerase en HIF, kunnen worden uitgevoerd om vast te stellen of de RNA-polymeraseniveaus zijn gewijzigd en of HIF is geactiveerd. Houd er rekening mee dat werken met formaldehyde uiterst gevaarlijk kan zijn tijdens het uitvoeren van deze procedure. Draag altijd handschoenen en werk in een zuurkast.