Name: RNAscope voor In situ Detectie van transcriptionally Actief humaan papillomavirus in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Leer RNAscope-detectie van HPV E6/E7 mRNA in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom met in situ hybridisatie. Deze gevoelige methode visualiseert transcriptieactief virus voor biomarkeronderzoek en diagnostiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mede ondersteund door NIH-subsidie ​​(R43/44CA122444) en DOD BRCP subsidie ​​(W81XWH-06-1-0682) naar YL.

1. Sample, Apparatuur, en Bereiding van het reagens <ol><li> Snijd weefselmonster in blokken van 3-4 mm dikte, vast in vers 10% neutraal gebufferde formaline voor 16-32 uur bij kamertemperatuur (25 ° C) en verankeren in paraffine. Snijd FFPE in secties van 5 ± 1 micrometer dikte van FFPE blokken, monteren secties op dia&#39;s en de lucht drogen. Opmerking: De objectglaasjes kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur onder uitdroging tot 3 maanden. De gemonteerde weefselobjectglaasjes worden gebakken in een droog boven bij 60 ° C gedurende 1 uur vóór de test RNAscope. </li><li> Breng Hybridisatie Oven tot 40 ° C. Plaats een Bevochtigen Papier in de vocht-en klimaatbeheersing lade. Voeg 50 ml dH 2 O om het Bevochtigen Papier om het helemaal nat. Plaats de bedekte lade in de oven te voorverwarmen gedurende ten minste 30 min. vóór gebruik. </li><li> Maak 700 ml 1x voorbehandelen 2 Solution (10 nl, pH 6 citraat buffer) door verdunning van 10x voorbehandelingsoplossing in dH 2 O. Verhit de 1x voorbehandelen 2 Solution aan de kook en maintain de temperatuur tussen 100-104 ° C terwijl het voorkomen van over-koken. </li><li> Maak 3 L 1x Wash Buffer (0,1 x SSC) door verdunning voorverwarmde 50x Wash Buffer in dH 2 O. </li><li> Bereid 2 x 200 ml xyleen en 2 x 200 ml 100% EtOH voor deparaffinisatie onder een afzuigkap. </li><li> Bereid 50% Hematoxylin kleuroplossing en blauwen reagens (0.01% ammoniak water) voor post-kleuring onder een afzuigkap. </li><li> Bereid 200 ml xyleen, 200 ml 70% en 2 x 200 ml 100% EtOH om gedroogd onder een afzuigkap. </li><li> Voorverwarmen Target probes bij 40 ° C gedurende 10 min en breng RTU Detection Kit reagens op kamertemperatuur, waaronder RTU Amp1, Amp2, AMP3, AMP4, Amp 5-Brown en AMP6-Brown, behalve DAB chromogeen Brown-A en-B Brown . </li></ol> 2. RNAscope Assay Deparaffineren en uitdroging Na het bakken, deparaffinize weefsel secties in xyleen voor 2 x 5 minuten met frequente agitatie, en uitdrogen100% EtOH gedurende 2 x 3 min frequent roeren. Lucht drogen gedurende 5 minuten en trek een hydrofobe barrière rond het weefsel sectie met een hydrofobe Barrier Pen. Voorbehandelingen <ol><li> Incubeer weefselcoupes met voorbehandeling 1 gedurende 10 min bij kamertemperatuur harden van endogene peroxidase activiteit spoelen in dH 2 O. </li><li> Incubeer weefsel secties met voorbehandelen 2 gehandhaafd op een kooktemperatuur 15 min voor RNA ophalen, twee keer spoelen in dH 2 O. </li><li> Incubeer weefsel secties met voorbehandelen 3 gedurende 30 minuten bij 40 ° C voor de vertering van eiwitten in HybEZ oven, twee keer spoelen in dH 2 O. </li></ol> Target Probe Hybridisatie Target probes HPV-HR 7 collectief omvatten: HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58. Voeg HPV sondes, Ubiquitin C (UBC) en bacterieel gen dapB probes apart op drie naast elkaar coupes. Hybridiseren bij 40 ° C in de oven gedurende 2hr, spoel dan in 1x Wash buffer voor 2 x 2 min bij RT. Signaalversterking <ol><li> Incubeer weefselcoupes met Amp1 (voorversterker) gedurende 30 min bij 40 ° C, Amp2 (achtergrond verloopstuk) gedurende 15 min bij 40 ° C, AMP3 (versterker) gedurende 30 min bij 40 ° C en AMP4 (labelprobe) gedurende 15 min bij 40 ° C in HybEZ oven. Na elke hybridisatiestap, spoelen met 1 x wasbuffer gedurende 2 x 2 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer weefselcoupes met AMP5 gedurende 30 min en AMP6 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Na elke incubatiestap spoelen met 1 x wasbuffer gedurende 2 x 2 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol> Signal Detection Incubeer weefselcoupes met 1:1 DAB Mengsel door gelijke volume Brown-A en bruin-B gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur twee keer spoelen in dH 2 O. Tegenkleuring <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Stain weefsel secties met 50% Hematoxylin oplossing gedurende 2 minuten bij RT, spoelen met dH 2 O tot dia&#39;s zijn duidelijk, terwijl weefsel paars blijven. Dip dia&#39;s in 0,01% ammoniak in dH 2 O voor 5x en volgde met 5 dips in dH 2 O. Dia bevestiging Dehydrateer weefselcoupes in 70%, 100% en 100% EtOH gedurende 2 minuten elk, xyleen gedurende 5 minuten, zet met xyleen gebaseerde afdekmiddel.

<ol><li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li>
<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+%28HER2%29+status+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li>
<li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li>
<li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+human+papillomavirus+E6%2FE7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%3A+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Schache AG,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li>
<li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%3A+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol.+Jun%22%5BJournal%5D)">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li>
<li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li>
<li>Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHammond%2C+ME+%22Arch.+Pathol.+Lab.+Med%22">Arch. Pathol. Lab. Med</a>. 134 (7), 48-72 (2010).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn in dienst van en eigen voorraad in Advanced Cell Diagnostics, Inc

De RNAscope HPV test toegestaan ​​directe visualisatie van E6/E7 mRNA in situ in HPV-geassocieerde hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. De RNAscope test is volledig compatibel met routinematig vaste tumorweefsel en behoudt weefselmorfologie voor histopathologisch correlaties (figuur 2). Een belangrijk voordeel van de RNAscope test ten opzichte van conventionele CISH methoden is dat het specifiek versterkt de hybridisatiesignalen (figuren 2B en 2E) zonder het versterken van de achtergrond ruis (figuren 2C en 2F). In de praktijk kan de RNAscope HPV test procedure worden afgerond binnen 8 uur of handig verdeeld over twee dagen. De RNAscope HPV-test is gebruikt om HPV-status in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom 12-16 bepalen, waaruit 97% sensitiviteit en specificiteit van 93% met qRT-PCR als referentiemethode 16. Conventionele chromogenic ISH voor HR-HPV-DNA is zeer specifiek, maar heeft een sensitiviteit van ~ 80% 12. Immunohistochemische (IHC) kleuring voor de cellulaire surrogaatmarker p16 werd een uitstekende gevoeligheid, maar kan vals-positieve resultaten 15,18, vooral in nonoropharyngeal hoofd-halskanker 15 genereren. De huidige &quot;gouden standaard&quot; methode qRT-PCR voor HPV E6/E7 mRNA detectie vereist bevroren weefsel voor optimale resultaten en technisch complex, die het gebruik ervan beperkt tot alleen het onderzoekslaboratorium. Bovendien vereist RNA-extractie waardoor het onmogelijk HR-HPV E6/E7 mRNA correleert met histopathologie. Er zijn verschillende kritische factoren voor het succes van de RNAscope assay. Eerste, voor de beste resultaten, weefsels moeten worden in vers 10% neutraal gebufferde formaline gefixeerde bij kamertemperatuur gedurende 16-32 uur volgens ASCO / CAP richtlijnen 19. Ten tweede wordt de HybEZ oven sterk aanbevolen omdat inschakelens optimale controle van temperatuur en vochtigheid voor probe hybridisatie en signaalversterking stappen. Ten derde is het belangrijk om overtollig resterende buffers verwijderen voor elke stap, maar nog steeds de weefselsectie van droging bij een van deze stappen. De hier beschreven handmatige RNAscope procedure is volledig geautomatiseerd op commerciële dia auto-kleuring 10. Dit zou aanzienlijk vergemakkelijken standaardisatie van testomstandigheden en bespaart kostbare handenarbeid in klinische pathologie laboratoria. Daarnaast heeft speciale software voor beeldanalyse ontwikkeld 10 om de cellen en vlekken signalen op een gedigitaliseerde dia, die moeten helpen subjectiviteit te leggen en de reproduceerbaarheid noteren automatisch identificeren. Samengevat, de RNAscope HPV-test detecteert de aanwezigheid van HR-HPV E6/E7 mRNA transcripten in situ in FFPE weefsels. Het heeft een workflow die vertrouwd is bij klinische pathologie laboratoriaTories doordat zij de direct visualisatie van deze in weefsel secties. Het biedt een ideaal platform voor de behandeling van (FFPE) weefselmonsters, en kan gemakkelijk door diagnostische pathologie laboratoria worden aangenomen.

Hoog-risico humaan papillomavirus (HR-HPV) is goed voor ongeveer 5% van alle kanker wereldwijd 1. De incidentie van HPV-geassocieerde orofarynxcarcinoom is toegenomen in de afgelopen decennia, vooral bij mannen. HPV-positieve orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom (OPSCC) zal waarschijnlijk een meerderheid van alle hoofd-en halskanker in de Verenigde Staten vormen in de komende 20 jaar 2. Orofaryngeale plaveiselcelcarcinomen veroorzaakt door HPV geassocieerd met gunstige overleving en status tumor HPV is een sterke en onafhankelijke prognostische factor voor overleving 3. Bewijs voor transcriptionele activering van de virale oncogenen E6 en E7 wordt beschouwd als de gouden standaard voor de aanwezigheid van klinisch relevante HPV 4. Maar detectie van E6/E7 mRNA van verse tumorweefsel door RT-PCR techniek is niet praktisch in de dagelijkse klinische praktijk en is beperkt tot de onderzoekslaboratoria. Onlangs hebben we have ontwikkelde een nieuwe RNA ISH technologie genaamd RNAscope, die multiplex detectie mogelijk maakt in individuele cellen met een enkele RNA-molecuul gevoeligheid in formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselmonsters (FFPE) 5-10. Wij verzorgden drie lijnen van bewijs voor single molecule detectie 5. Ten eerste, de RNAscope probe-ontwerp en signaalamplificatiesysteem toegestaan ​​detectie van enkele kopie HER2 genome DNA doelen in HeLa-en SK-BR-3-cellijnen. Ten tweede, in vergelijking met HER2 genomisch DNA signalen, de verdeling van de fluorescentie-intensiteiten van HER2 mRNA signaal stippen in HeLa-cellen was consistent met een molecuul per punt. Ten derde, het aantal HER2 mRNA signaal dots per cel nauw bij elkaar aan de HER2 mRNA kopie aantal geschat door een oplossing op basis van kwantificering assay, single molecule detectie verdere ondersteuning. Bovendien tegenkleuring van kernen met DAPI in fluorescentie microscopie of met hematoxyline in bright-field microscopie maakt visualisatie van de individuele kernen, which beurt maakt detectie en kwantificering van RNA doelen op een eencellige basis 10. De mogelijkheid om genexpressie te analyseren in situ in de routine klinische monsters maakt RNAscope een veelbelovend platform voor diagnostische pathologie, vooral die FFPE weefsel-sectie gebaseerde testen 10,11. We hebben een RNAscope-gebaseerde test HPV E6/E7 mRNA te detecteren zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes ontwikkeld. Onze recente studies hebben aangetoond dat OPSCC de RNAscope HPV-test is zeer gevoelig en specifiek het toekennen van HPV op FFPE weefsels 12-17, en ook informeert prognose OPSCC 12,16. Het principe van de RNAscope technologie is eerder beschreven 5. We beschrijven hier de volledige RNAscope assayprotocol en demonstreren het gebruik ervan in de detectie van HR-HPV in FFPE tumorweefsel secties.

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Oven, Tray, and Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit - Brown</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, and 58, E6/E7 mRNA</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Gill's Hematoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>Hot Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr><td>Drying Oven</td><td></td><td></td><td>Capable of holding temperature at 60&plusmn;1 &deg;C</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td></td><td></td><td>Capable of holding temperature at 40&plusmn;1 &deg;C</td></tr></tbody></table>

rnascope voor<em&gt; in situ</em&gt; detectie van transcriptionally actief humaan papillomavirus in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

De &#39;gouden standaard&#39; voor oncogene HPV-detectie is de demonstratie van transcriptionally actief hoog-risico HPV in tumorweefsel. Echter, detectie van E6/E7 mRNA door middel van kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) vereist RNA-extractie die vernietigt het tumorweefsel context van cruciaal belang voor morfologische correlatie en is moeilijk in de dagelijkse klinische praktijk worden aangenomen. Het recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie technologie, RNAscope, maakt directe visualisatie van RNA in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefsel molecuul gevoeligheid en enkele cel resolutie, die zeer gevoelig en specifiek in situ analyse van elke RNA biomarker kunnen in routine klinische monsters. De RNAscope HPV-test werd ontworpen om de E6/E7 mRNA zeven hoog risico HPV-genotypen (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58) met een pool van genotype-specifieke probes detecteren. Het heeft een uitstekende gevoeligheid aangetoonden specificiteit tegen de huidige &#39;gouden standaard&#39; methode voor het opsporen E6/E7 mRNA door qRT-PCR. HPV-status bepaald door RNAscope is sterk voorspellende van klinische resultaten bij orofaryngeale kankerpatiënten.

RNAscope HPV test workflow De RNAscope test heeft een sterk gestroomlijnde werkstroom die vergelijkbaar IHC (figuur 1). Het bestaat uit vier belangrijke stappen: voorbehandelingen, hybridisatie signaal versterkingen, en detectie. Het maakt gebruik van een unieke probe-ontwerp strategie die high fidelity signaalversterking 5 zorgt. In de RNAscope HPV test worden de zeven HR-HPV probe sets samengevoegd, alle erkende door dezelfde signaalamplificatiesysteem gekoppeld aan mierikswortel peroxidase (HRP). Specifieke hybridisatie signalen worden gedetecteerd als bruine precipitaten gevormd door HRP gekatalyseerde chromogene reactie met DAB als substraat, dat gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door standaard helderveld microscopie. Vertegenwoordiger kleuring voor HPV-detectie Figuur 2 toont bijvoorbeeld beelden van gebrandschilderd FFPE delen van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Bij de HPV-positieve geval (Figure 2A), de HR-HPV-probes gedetecteerd sterke puntvormige signalen specifiek de tumorcellen. De UBC probe gedetecteerd talrijke punctata cytoplasmatische signalen in zowel tumorcellen en stromale cellen (Figuur 2B). Het bacterieel gen dapB probe toonde een schone achtergrond (figuur 2C). Bij de HPV-negatieve geval zowel de HR-HPV-sonde en de dapB sonde gedetecteerd geen signalen (figuren 2D en 2F), terwijl sterke signalen werden gedetecteerd met de UBC sonde (figuur 2E). In deze assay, UBC dient als positieve controle weefsel RNA kwaliteit en dapB beoordeelt negatieve controle voor achtergrond signalen. De score voor de HPV-status bepaling impliceert onderzoek van alle drie dia&#39;s voor elk geval. De kleuring niveau op negatieve regelschuif (dapB) dia als cutoff: HPV positiviteit wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van cytoplasmatische punctata en / of nucleaire kleuring die boven het signaal op de dabpB dia. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van RNAscope assay. Illustratie van RNAscope assay workflow. De RNAscope test bestaat uit 4 grote stappen, voorbehandelingen, doel probe hybridisatie, signaalversterking en signaal detectie. De gehele test procedure kan in 8 uur worden afgerond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a> <img alt="Figuur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" /> Figuur 2. Voorbeeld afbeeldingen van RNAscope-gekleurde coupes. FFPE secties gekleurd met probes voor HR-HPV, UBC (positieve controle) en dapB (negatieve controle)van twee SCCHH gevallen. AC. HPV-positieve zaak. A, HR-HPV E6/E7 mRNA expressie in tumorcellen. Bijvoegsel, 40X vergroting punctata signalen tonen. B en C) aangrenzend weefsel secties met positieve kleuring UBC (B) en negatief voor dapB (C) resp. DF) HPV-negatieve case. D) geen kleuring voor HPV E6/E7 mRNA , vergelijkbaar met de dapB negatieve controle (F). E) UBC positieve kleuring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">Klik hier voor grotere afbeelding.</a>

De aanwezigheid van hoog-risico HPV in het hoofd en de nek tumorweefsel wordt geassocieerd met gunstige resultaten. De recent ontwikkelde RNA in situ hybridisatie techniek genaamd RNAscope maakt een directe visualisatie van HPV E6/E7 mRNA in FFPE weefsel secties.

RNAscope voor<em&gt; In situ</em&gt; Detectie van transcriptionally Actief humaan papillomavirus in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

The &#39;gold standard&#39; for oncogenic HPV detection is the demonstration of transcriptionally active high-risk HPV in tumor tissue. However, detection ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de sensitieve en specifieke detectie van hoog-risico HPVE zes en E zeven mRNA in tumorcellen bij hoofd-halskanker aan te tonen met behulp van een nieuwe RNA in situ hybridisatietechniek genaamd RNAscope. Dit wordt bereikt door de weefselmonsters op de objectglazen eerst voor te behandelen met hitte en protease om de cellen te permeabiliseren, zodat de probes toegang krijgen. Als tweede stap worden de objectglazen geïncubeerd met een HPV-probecocktail gericht op zeven hoog-risico HPV-typen, die hybridiseert met E zes en E zeven mRNA.Versterk vervolgens de hybridisatiesignalen door sequentieel te hybridiseren met de pre-amplifier, amplifier en HRP-geconjugeerde labelprobe. Het signaal wordt vervolgens gedetecteerd met een chromogeen en gevisualiseerd onder standaard brightfieldmicroscopie; de resultaten tonen HPVE 6 E 7 mRNA-signalen als punctate bruine neerslagen in HPV-positieve tumoren, maar niet in HPV-negatieve tumoren. De RRA scope-assay maakt gebruik van een nieuwe en gepatenteerde probe-ontwerpstrategie voor in situ hybridisatie.Het maakt visualisatie van enkelvoudige moleculen en kwantificering van doelwitten mogelijk. Deze technologie baant de weg voor onderzoekers op het gebied van biomarkeronderzoek en de ontwikkeling van diagnostische tests om RNA-biomarkers die via macro-race of next-generation sequencing-studies zijn ontdekt, te identificeren en te valideren. De meeste wetenschappers met eerdere ervaring in IHC of ISH kunnen deze methode snel onder de knie krijgen.Nu zal ik u een demonstratie geven van de volledige workflow, waarbij de belangrijkste stappen worden belicht om u te helpen de techniek onder de knie te krijgen. De weefselmonsters die met deze RNA-in situ hybridisatie-techniek worden geanalyseerd, zijn geformalineerd en gefixeerd. Paraffine-ingebedde coupes met een dikte van 5 ± 1 micron zijn één uur vóór de analyse op objectglazen gemonteerd.Bak de objectglaasjes in een droge oven bij 60 °C. Bereid de hybridisatie-oven voor. Bring de temperatuur naar 40 °C en plaats bevochtigingspapier in de bevochtigingslade.Voeg 50 milliliters gedestilleerd water toe aan het bevochtigingspapier om het volledig te bevochtigen. Plaats de afgedekte lade in de oven om deze gedurende ten minste 30 minuten voor te verwarmen voor gebruik. Bereid 700 milliliters one x pretreat two solution voor door 10 x pretreatment solution te verdunnen in gedestilleerd water.Verhit de 1x voorbehandelingsoplossing twee tot het kookpunt en houd de temperatuur tussen 100 en 104 °C. Voorkom dat de oplossing overkookt. Maak drie liter 1x wasbuffer door voorverwarmde 50x wasbuffer in gedestilleerd water te verdunnen onder een zuurkast.Bereid de xylenen, 70% ethanol en 100% ethanol voor voor de deparaffinering en dehydratie. Bereid de 50% hematine kleuringsoplossing en 0,01% ammoniakwater of een blauwreagens voor voor de nakleuring. Warm de doelp probes 10 minuten voor bij 40 °C.Breng alle reagentia van de RTU-detectiekit naar kamertemperatuur, behalve het DAB-chromogeen bruin A en bruin B. Om deze assay te starten, worden de gebakken weefselcoupes twee keer geparalyseerd in xyleen gedurende vijf minuten per keer, met frequente agitatie. Dehydrateer deze vervolgens tweemaal gedurende drie minuten in 100%Ethanol met frequente agitatie.Laat vijf minuten aan de lucht drogen en trek vervolgens met de hydrofobe barrièrepen een hydrofobe barrière rond de weefselsectie. Start de voorbehandeling van de weefselsecties door deze 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met pretreat one-oplossing. Dit zal de endogene peroxidaseactiviteit neutraliseren.Spoel af met gedestilleerd water. Win vervolgens RNA terug door de weefselcoupes 15 minuten te incuberen met pre-treat oplossing twee, die gedurende 15 minuten op kooktemperatuur wordt gehouden; spoel daarna twee keer met gedestilleerd water voor de proteïnedigestie. Behandel de weefselcoupes met pre-treat oplossing drie en incubeer deze gedurende 30 minuten in de hybridisatieoven bij 40 °C.Wanneer de incubatie van 30 minuten is voltooid, worden de weefselsneden twee keer gespoeld met gedestilleerd water. De volgende stap is hybridisatie van de target-probes met behulp van een pool van probes die het E6- en E7-mRNA detecteren van zeven hoog-risico HPV-genotypes: HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 en 58. Voeg de HPV-probes, de ubiquitine C-probe en de bacteriële gen DAP B-probe afzonderlijk toe aan drie aangrenzende weefselsneden.Hybridiseer gedurende twee uur bij 40 °C in de oven aan het einde van de tweeuurige incubatie. Spoel de weefselcoupes twee keer gedurende telkens twee minuten met washbuffer bij kamertemperatuur voor signaalversterking. Begin met het incuberen van de weefselcoupes met de AMP one pre-amplifier gedurende 30 minuten bij 40 °C in de hybridisatieoven.Spoor twee keer af met wasbuffer gedurende telkens twee minuten bij kamertemperatuur. De volgende stappen voor signaalversterking omvatten het incuberen van de weefselcoupes met de volgende reagentia bij 40 °C gedurende de aangegeven tijd, met twee spoelingen in wasbuffer bij kamertemperatuur. Na elke incubatie volgt AMP two background reducer gedurende 15 minuten.Incubeer 30 minuten met AMP drie-amplifier en 15 minuten met AMP vier-gelabelde probe. Incubeer vervolgens de weefselsneden 30 minuten bij kamertemperatuur met amp vijf, na twee spoelingen in washbuffer, gevolgd door incubatie met amp zes gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, waarna opnieuw twee spoelingen in washbuffer volgen. Meng voor de signaaldetectie een één-op-één DAB-mengsel door gelijke volumes van brown A en brown B samen te voegen. Voeg de oplossing toe aan de objectglazen en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.Spoel tweemaal met gedistilleerd water. Kleur de weefselcoupes tegen met een 50% hematoxyline-oplossing gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en spoel vervolgens met gedistilleerd water tot de coupes helder zijn terwijl de weefsels paars blijven. Dompel de coupes vijf keer in 0,01% ammoniakwater, gevolgd door vijf keer dompelen in gedistilleerd water. Dehydrateer de weefselcoupes door deze telkens twee minuten te incuberen in 70% ethanol, 100% ethanol en 100% ethanol, gevolgd door vijf minuten in xyleen.Monteer tot slot de preparaten met xyleen-gebaseerd monteermiddel. Hier zijn voorbeeldbeelden van gekleurde, in formaline gefixeerde en in parafine ingebedde coupes van hoofd-hals plaveiselcelcarcinomen. In het HPV-positieve geval detecteerden de HR-HPV-sondes sterke punctate signalen specifiek in de tumorcellen. Dit is duidelijk gevisualiseerd in de inzet bij een 40x vergroting.De positieve controle UBC-probe detecteerde talrijke punctate cytoplasmatische signalen in zowel tumorcellen als stromale cellen. Terwijl de negatieve controle DAP B-probe een schone achtergrond vertoonde in het HPV-negatieve geval, detecteerden zowel de HR HPV-probe als de DAP B-probe geen signalen, terwijl er door de UBC-probe sterke signalen werden gedetecteerd. De scoring voor de bepaling van de HPV-status omvat het onderzoeken van alle drie de coupes voor elk geval.Het kleuringsniveau op de negatieve controle DAP B-dia is als afkapwaarde gebruikt; HPV-positiviteit wordt gedefinieerd door de aanwezigheid van punctate, cytoplasmatische en/of nucleaire kleuring boven het signaal op de DAP B-dia. De RNAscope-assay kan binnen acht uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Het is cruciaal om bij elke stap voldoende oplossing toe te voegen om het gehele weefseloppervlak te bedekken.Het is daarnaast belangrijk om tussen de stappen door eventuele resterende buffer te verwijderen door tegen de slides te tikken, terwijl de slides wit moeten blijven. De rescope-technologie kan worden toegepast voor de detectie van vrijwel elke RNA-biomarker in elke cel of weefsel van elke soort.

rnascope-for-situ-detection-transcriptionally-active-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het karakteriseren van T-cel-epitopen van pathogenen die lokale infecties veroorzaken, zoals het humaan papillomavirus, is een uitdaging vanwege het beperkte aantal circulerende T-cellen. Er wordt een methode beschreven waarbij zeldzame T-cellen werden geïsoleerd en gekarakteriseerd, beginnend met een zeer klein aantal cellen.

Het gebruik van interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay om nieuwe T-cel epitopen van het humaan papillomavirus karakteriseren

This video describes a sequential hybridization strategy that involves hybridizing mRNA probes to specific target mRNA. Following probe hybridization, signal amplification is performed to enhance resolution via reduction of signal-to-noise ratio during RNA-CISH of histological samples.

Probe Hybridization and Signal Amplification in RNA In Situ Hybridization: A Technique for Detecting Specific RNA Sequences in Tissue Sections

This video presents the protocol for signal detection during RNA chromogenic in situ hybridization. This technique can be used to diagnose an active oncogenic infection visually in an intact tissue specimen.

RNA CISH Signal Detection: A Technique to Detect Chromogenic Signals During RNA In Situ Hybridization in Intact Tissue Specimens

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

Multiparameter fluorescentie immunohistochemie kan worden gebruikt om het aantal, relatieve verdeling en lokalisatie van immuuncellenpopulaties in de tumor micro-omgeving te beoordelen. Dit manuscript beschrijft het gebruik van deze techniek om T-cel subpopulaties in orofaryngeale kanker te analyseren.

Vier-kleur Fluorescentie Immunohistochemie van T-cel Subpopulations in Archival Formalin-Fixed, Paraffine-Embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Monsters

Homeobox genen zijn regelgevende genen vaak geassocieerd met tumoren in de volwassen organismen. We onderzochten hun vergelijkende expressie door immunohistochemische en real-time PCR analyse, in normale en inflammatoire nasale mucosae en in sinonasal gezwellen om ze te gebruiken als mogelijk diagnostische en therapeutische doelen.

Identificatie van OTX1 en OTX2 als twee mogelijk moleculaire merkers voor Sinonasal carcinomen en olfactorische Neuroblastomas

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor longknobbellokalisatie met behulp van kleurstofmarkering via elektromagnetisch genavigeerde transthoracale naaldtoegang. De hier beschreven techniek kan worden bereikt in de peri-operatieve periode om nodule lokalisatie te optimaliseren en tot succesvolle resectie bij het uitvoeren van minimaal invasieve thoracale chirurgie.

Elektromagnetische navigatie Transthoracale nodule lokalisatie voor minimaal invasieve thoracale chirurgie

Hier presenteren we een reproduceerbare methode voor het ontwikkelen van een model orthotopic lymfkliertest van hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom. Tumoren tonen klinisch relevante histopathologische kenmerken van de ziekte, met inbegrip van necrose, arme differentiatie, knooppunten metastasen en immuun infiltratie. Tumor-dragende muizen ontwikkelen klinisch relevante symptomen zoals dysfagie, verplaatsing van de kaak en gewichtsverlies.

Intramucosal enten van plaveiselcelcarcinoom cellen in muizen voor Tumor immuun profileren en evaluatie van de reactie van de behandeling

Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.

Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose

RNA haarspelden en lussen kunnen fungeren als primers voor reverse transcriptie (RT) bij afwezigheid van sequentie-specifieke primers, interfereren met de studie van overlappende antisense transcripten. We hebben een techniek ontwikkeld die in staat is om streng-specifiek RNA te identificeren, en we hebben het gebruikt om HIV-1 antisense Protein ASP te bestuderen.

Detectie van humaan immunodeficiëntie virus type 1 (HIV-1) antisense protein (ASP) RNA transcripten bij patiënten door onderdeel-specifieke RT-PCR

Leer RNAscope-detectie van HPV E6/E7 mRNA in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom met in situ hybridisatie. Deze gevoelige methode visualiseert transcriptieactief virus voor biomarkeronderzoek en diagnostiek.

RNAscope voor

Meer video's verkennen