Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen In Vivo
28 augustus 2014
Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om bloedvaten in weefsel geëngineerde constructies te visualiseren. Dit wordt bereikt door een gestandaardiseerd volledige huiddefect te creëren op de ruggen van muizen. Vervolgens wordt een monster van het weefsel geëngineerde materiaal geïmplanteerd in het huiddefect.
Aan het eind van de observatietijd wordt het materiaal geïmplanteerd en in een transverlichtingsapparaat geplaatst. Uiteindelijk worden foto's met hoge resolutie van het vasculaire netwerk gemaakt met een standaard digitale camera. Uiteindelijk wordt het vaatnetwerk geanalyseerd door digitale segmentatie en kwantificering met behulp van de Vest egg tool software.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals microscopie, computertomografie of magnetische resonantie beeldvorming, is dat het een effectieve visualisatie en kwantificering in tijd en oorzaak van vasculaire processen binnen biomaterialen mogelijk maakt, met focus op alle nieuwe functionele vaten. Deze methode kan inzicht geven in de vascularisatie van dermale vervangende materialen. Het kan ook worden toegepast op andere modelorganismen of om vascularisatie in andere organen te bestuderen.
Om te beginnen, gebruik 12 millimeter biopsie ponsen om monsters van scaffolds te genereren, zoals uit runder-, collageen gebaseerde dermale vervangende materialen. Snijd stukken tetin gaas met een diameter van 14 millimeter om onder elke scaffold te plaatsen. Na het anestheseren van een muis, controleer de diepte van de anesthesie met een teenprik en verwijder het rughaar volgens het tekstprotocol. Plaats het dier in een buikligging en gebruik een permanente pen met een fijne punt om de middenlijn van de rug van de muis te markeren.
Definieer een excisiegebied dat niet te ver weg is om te voorkomen dat het dier de scaffold verwijdert. Gebruik een 10 millimeter biopsie pons om ronde bilaterale defecten te maken door de pons voorzichtig tegen de huid te drukken. Om het excisiegebied af te bakenen, gebruik forceps om de gemarkeerde huid voorzichtig op te tillen en gebruik chirurgische schaar om langs de gemarkeerde cirkel in te snijden.
Als er bloeding optreedt, gebruik steriel gaas om het gebied voorzichtig te comprimeren om ruimte te maken voor het Titanic gaas. Verleng de scheiding van huid en onderliggend weefsel aan de rand van de wond en nog eens twee tot vier millimeter. Plaats het gaas in het defect direct op de wondbodem en onder de wondranden.
Plaats vervolgens de scaffolds direct bovenop het gaas. Gebruik vier tot zes enkele knopen om de scaffold te naaien, zodat de aangrenzende wondranden de randen iets boven de scaffold laten. Naai vervolgens een transparant wondverband boven de defecten om de scaffold te beschermen terwijl de wondgebied kan worden gemonitord.
Evalueer dagelijks de algemene toestand van het dier door motorische activiteit, lichaamsgewicht, pijnsignalen, tolerantie voor het verband en auto-mutilatie te monitoren. Bewaak ook het wondgebied op lokale en systemische tekenen van bloeding en infectie en de positie van het verband. Na euthanasie van het dier op het gewenste tijdstip.
Volgens het tekstprotocol, gebruik een permanente marker om de excisieplaats te markeren die de scaffolds omvat. Gebruik een schaar of een scalpel om de huid langs de gemarkeerde lijnen in te snijden door een stompe excisie, los de hele huid, inclusief de scaffolds en het gaas van het onderliggende weefsel, plaats een uitgerekt weefsel op zijn kop in een petrischaal. Om het monster te visualiseren, plaats het boven een transverlichtingsapparaat.
Neem in macromodus foto's van de complete scaffolds en gelijke grootte gebieden van normale huid en sla de afbeeldingen op in TIFF-formaat voor verdere digitale analyse. Nadat u de ves EQ tool software hebt gedownload, opent u een afbeelding en selecteert u een gebied van belang voor analyse door op de backspace-toets te drukken. Druk vervolgens op invert.
Om het vaatnetwerk in wit te visualiseren, kies beeldvat verbeteringsfilter hysteresis thresholding top hat transformatie en bereken vat verbetering in alle voorgaande stappen. Scroll om in en uit te zoomen op de afbeelding. Segmenteer de vaatkaart door de eerste drempel of vatdekking te selecteren, zodat elke pixel die enigszins vat-achtig is, als vat wordt gelabeld.
Druk op berekenen. Om uw selectie te bekijken, selecteert u de tweede drempel of achtergronddekking zodat alleen die pixels die bijzonder vat-achtig zijn, als vaten worden gelabeld. Om de lengte van de vaten en het totale gebied dat door hen wordt bedekt te berekenen, klikt u op afbeelding, afbeelding statistieken en binaire afbeelding statistieken.
De vatlengte wordt het beste geschat door het vaatnetwerk voor te verdunnen tot een breedte van één pixel. Ga hiervoor naar beeld morfologische filters en skeletten voor de berekening. De verhouding van vatgebied tot vatlengte geeft een waarde voor de vatgrootte in het gebied van belang.
Elimineer indien nodig artefacten door alleen de vaten van belang te selecteren. Door te klikken onder de selectiemodus, drukt u op backspace om de geselecteerde vaten in een nieuwe afbeelding te kopiëren. Analyseer ten slotte het native huidgebied onder dezelfde parameters als een scaffold, waarbij u het native weefsel een waarde van 100% toekent en de scaffold daarmee vergelijkt.
Als het percentage witte pixels bijvoorbeeld 30% is in het normale weefsel en 15% in de scaffold, vertegenwoordigt dit een 50% vascularisatie van het totale oppervlak van de scaffold. Houd er rekening mee dat de waarden overeenkomen met het hele afbeeldingsgebied. Daarom is het noodzakelijk om het te corrigeren naar het gebied van het geselecteerde gebied zoals hier getoond.
Twee weken na implantatie van weefsel, liet transverlichting duidelijke visualisatie van vasculaire structuren van maximaal 30 micrometer breedte toe in een geheel weefselmonster dat zowel natuurlijk weefsel als geïmplanteerde scaffolds omvatte. Met behulp van digitale segmentatie werden de vascularisatieniveaus van 62,28 plus of minuus 8,6% waargenomen in de scaffold in vergelijking met de natuurlijke huid. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om reproduceerbare volledige huiddefecten te creëren en het biomateriaal betrouwbaar aan de wond te bevestigen.
Volgens deze procedure kan he
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het visualiseren en kwantificeren van vascularisatie in tissue-engineered constructen. Door gebruik te maken van een gestandaardiseerd huiddefectmodel in muizen, kan het vasculaire netwerk effectief worden geanalyseerd.
Belangrijke componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Tissue Engineering
- Vasculaire Biologie
- In Vivo Beeldvorming
Achtergrond
- Vascularisatie is cruciaal voor succesvolle tissue engineering.
- Er zijn betrouwbare technologieën nodig om vasculaire netwerken te evalueren.
- Huidige methoden kunnen tekortschieten in kosteneffectiviteit en eenvoud.
- Deze studie heeft tot doel deze tekortkomingen aan te pakken.
Doel van de studie
- Om bloedvaten in weefseltechnische constructen te visualiseren.
- Om een kosteneffectieve methode voor de analyse van vasculaire netwerken te ontwikkelen.
- Om het begrip van vascularisatie in weefseltechniek te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Creatie van een gestandaardiseerd volledig huiddefect bij muizen.
- Implantatie van weefseltechnisch materiaal in het defect.
- Gebruik van een transilluminatieapparaat voor beeldvorming.
- Hoge-resolutiefotografie van het vasculaire netwerk.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van bloedvaten in de constructen.
- Kwantificering van het vasculaire netwerk met behulp van digitale segmentatie.
- Gebruik van de Vest egg tool-software voor analyse.
- Demonstratie van de effectiviteit en kostenefficiëntie van de methode.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbaar middel om de vascularisatie te beoordelen.
- Het kan worden toegepast in diverse weefseltechnische studies.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze benadering voor verbeterde resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Betrouwbare kwantificering van vascularisatie in biomaterialen is een cruciaal omslagpunt voor het verder ontwikkelen van weefseltechnologische constructen richting translationele en preklinische validatie. Dit model voor een volledig huidgebrek maakt directe, hoge-resolutie visualisatie en digitale kwantificering van neovascularisatie mogelijk, wat het voorspellend vertrouwen in de prestaties van de scaffold ondersteunt. Deze aanpak stroomlijnt het vroegtijdige risico-beheer en de portfolioselectie voor biomateriaal-kandidaten gericht op toepassingen binnen de regeneratieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe toetsing van vascularisatiehypothesen in engineered scaffolds mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van pro-angiogene modificaties of geïncorporeerde bioactieve moleculen.
- Faciliteert biologische risicoreductie door de invloed van bloedvatgroei in vivo te kwantificeren.
- Biedt vergelijkbare interne controles via een bilateraal wondontwerp, waardoor variabiliteit tussen dieren wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare in vivo assaycondities voor de evaluatie van biomaterialen.
- Genereert kwantitatieve resultaten via digitale segmentatie en metrieken voor vaatbedekking.
- Ondersteunt high-resolution screening van meerdere scaffold-formuleringen of bioactivatiestrategieën.
- Maakt hergebruik van het platform mogelijk voor iteratieve optimalisatie van vascularisatie-eigenschappen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Slaat aan bij ziekte-relevante modellen voor weefselherstel en regeneratieve geneeskunde.
- Biedt continuïteit van de beoordeling van scaffolds in de ontdekkingsfase naar preklinische validatie van vasculaire integratie.
- Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve benchmarks voor vascularisatie.
- Maakt downstream-analyses mogelijk, zoals histologie of moleculaire profilering van geëxplanteerde weefsels.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit model slaat een brug tussen vroege ontdekking en preklinische evaluatie door een gestandaardiseerde workflow te bieden voor de in vivo vascularisatiebeoordeling van biomaterialen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing voor angiogeen potentieel en pathway-activatie in engineered constructen.
- Screening: Maakt reproduceerbare, kwantitatieve vergelijking van scaffold-varianten en bioactivatiemethoden mogelijk.
- Analytics: Levert metriken voor vatlengte, oppervlakte en dekking via digitale beeldanalyse voor robuuste, datagestuurde beslissingen.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert afstemming op eindpunten van regeneratieve geneeskunde en preklinische eisen voor weefselintegratie.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een schaalbaar, kosteneffectief assayplatform voor continue evaluatie van de biomateriaal-pipeline.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vascularisatie van steigers en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Standaardiseert de in vivo evaluatie, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt schaalbare screening.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go beslissingen en optimaliseert de toewijzing van middelen door het kwantificeren van belangrijke biologische eindpunten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biomateriaalkandidaten voor verdere ontwikkeling mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in kleine dierchirurgie en wondbeheer.
- Toegang tot transilluminatie-beeldvorming en digitale analysesoftware (bijv. Vest egg tool) is noodzakelijk.
- Vraagt om standaardisatie van chirurgische en beeldvormingsprotocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende typen scaffolds en potentieel andere orgaansystemen door protocolwijzigingen.
- Beperkingen omvatten de noodzaak tot zorgvuldige minimalisatie van artefacten en correctie van het interessegebied tijdens de analyse.
