Name: Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Leer hoe pericyten uit het volwassen menselijk brein worden omgezet in geïnduceerde neuronen met retrovirale vectoren. Deze methode maakt directe lineage-herprogrammering mogelijk voor hersenherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar dat dr. Magdalena Götz voor haar inbreng tijdens de ontwikkeling van dit protocol. Wij danken dr. Marius Wernig (Stanford University) voor royaal verstrekken van ons met de Sox2 coderende sequentie. We zijn ook zeer dankbaar Dr Alexandra Lepier voor virus productie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 4182/2-2) en het BMBF (01GN1009A) naar BB, en het Beierse ministerie van Wetenschappen, Onderzoek en Kunst naar MK en BBCS ontving gelden van de binationale SYSTHER- INREMOS Virtual Institute (Duitse en Sloveense federale ministeries van Onderwijs en Onderzoek) en de DFG (SFB 824).

1. Isolatie en kweken van volwassen menselijke hersencellen Experimenten met menselijk weefsel moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante overheids-en institutionele regelingen met betrekking tot het gebruik van menselijk materiaal voor onderzoeksdoeleinden. Het huidige protocol is ontwikkeld in overeenstemming met de goedkeuring door de ethische commissie van de Medische Faculteit van de LMU München en schriftelijke toestemming van alle patiënten. Dit protocol voor het bereiden van culturen van de volwassen mens hersenschors is vastgesteld met behulp van specimen van de patiënten van beide geslachten die lijden aan temporaalkwab epilepsie of andere diepgewortelde niet-traumatische, niet-maligne afwijkingen. De resultaten van de chirurgische kamer uitsluitend uit de toegangsgeul naar de hersenen laesie en daarom weefsel wordt als gezond beschouwd. De leeftijd van de patiënten was 19-70 jaar. <ol><li> Bereid groeimedium door toevoeging van warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum(FCS) naar DMEM hoog glucose met GlutaMAX tot een uiteindelijke concentratie van 20% FCS te verkrijgen. Voeg 5 ml penicilline / streptomycine in totaal 500 ml groeimedium. Voer deze en alle volgende stappen die steriele kweekomstandigheden in een passende laminaire stroming kap. </li><li> Houd het menselijk brein biopsie volwassen verkregen uit de operatiekamer in Hanks &#39;gebalanceerde zoutoplossing met CaCl2 en MgCl2 (HBSS) medium dat HEPES (10 mM eindconcentratie) op ijs tot verwerking. Start verwerking zo spoedig mogelijk. </li><li> Om de dissociatie te beginnen in enkele cellen, breng het weefsel in een 65 mm petrischaal en gehakt in kleine stukjes door twee steriele eenmalig gebruik scalpels. Voor enzymatische digestie gebruiken 3-6 ml TrypLE in een 15 ml conische buis en incubeer gedurende 15-30 min bij 37 ° C in een waterbad. </li><li> Voeg 1 volume voorverwarmd groeimedium dissociatie vergemakkelijken en voorzichtig vermaal de oplossing die weefselstukken en neer door eersteen 5 ml wegwerp pipet, gevolgd door een glazen Pasteur pipet tot homogenisering van de celsuspensie. Typisch enkele resterende stukken weefsel, voornamelijk bestaande uit witte stof in de suspensie blijven. </li><li> Spin neer op 157 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid groeimedium (10 ml per ongecoat T75 kolf). Gebruik een T75 kolf gedurende een biopsie van 5-10 mm in grootte en extrapolatie van deze bij grotere exemplaren. </li><li> Plaats cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 en 5% O2. </li><li> Vervang de helft van het medium elke 3-4 dagen tot cellen confluentie hebben bereikt. Dit duurt meestal tot twee weken (aangeduid als doorgang 0 [P0]). </li></ol> 2. In vitro Uitbreiding en karakterisering van de volwassen menselijke hersencellen <ol><li> In vitro expansie: <ol><li> Zuig het kweekmedium en was met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), op kamertemperatuur gehouden temperature, voor het toevoegen van 3 ml TrypLE. </li><li> Incubeer bij 37 ° C gedurende 5-10 min tot de meeste cellen losgemaakt. Tik voorzichtig de kolven om opheffing van de cellen te vergemakkelijken; na toevoeging van 3 volumes kweekmedium, overdracht van de cellen in een 15 ml conische buis en spin neer bij 157 xg gedurende 5 minuten en suspendeer de cellen in de juiste hoeveelheid groeimedium. </li><li> Passage de cellen bij een verhouding van 1:03 voor optimale opbrengst van nieuwe T75 celkweek flessen. Let op: Wij hebben deze cellen gepasseerd totdat P5 zonder enig teken van verminderde efficiëntie herprogrammering. Terwijl op P0 de cultuur bevat een aanzienlijke fractie van endotheelcellen (zoals beoordeeld door CD34 expressie), op latere passages hun aantal verwaarloosbaar. </li></ol></li><li> Karakterisering van volwassen menselijk brein culturen: <ol><li> Immunocytochemie: <ol><li> Voor de karakterisering van de cellen, zaden ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groei medium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2. </li><li> Voor immunocytochemische analyse van de gekweekte humane hersencellen verwijdert het medium en was 3x met 1 ml PBS. </li><li> Fix cellen door toevoeging van 500 ui 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Breng de glazen dekglaasjes in een geschikte kleuring bevochtigde kamer en blok met 80 pl PBS dat 3% runderserumalbumine (BSA) en 0,5% Triton X-100 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. </li><li> Voeg primaire antilichamen verdund in dezelfde oplossing (voor verdunningsfactoren zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) en incubeer overnacht bij 4 ° C of 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Opmerking: Een aanzienlijk variëren maar fractie van de cellen in deze fase kweken zijn immunoreactief voor bloedplaatjes afkomstige groeifactor receptor β (PDGFRß), cluster van differentiatie 146 (CD146), NG2 chondroïtinesulfaat proteoglycan, en gladde spier actine (SMA), dwz markers kenmerkend microvaatje-geassocieerde pericyten. Slechts een minderheid (&lt;1%) drukken de astroglial markers gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100β. Bovendien, in dit stadium de kweek zonder enige cellen die de neuronale merker βIII-tubuline moet zijn. Gebruik meerdere primaire antilichaam combinaties voor co-etikettering van verschillende markers. Verdere bevestiging van de expressie van gliale, neuronale, endotheliale en pericyte markers kan worden verkregen door reverse transcriptie en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (niet beschreven in dit protocol). </li><li> Na incubatie met de primaire antilichamen Was driemaal met 1 ml PBS en voeg de bijbehorende secundaire antilichamen (in de geschikte verdunningen) de kleuroplossing en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen 3x met PBS. Indien nodig voor montage onder kleuring met DAPI gedurende 5 minuten bij kamertemperatuurtemperatuur. </li><li> Gebruik antifading montage medium en analyseren van de dekglaasjes met een epifluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop. </li></ol></li><li> Flowcytometrie: <ol><li> Voor de analyse van het oppervlaktewater marker expressie met behulp van flowcytometrie, groeien cellen tot confluentie in ongecoate T25 of T75 celkweekkolven. </li><li> Trek cellen door TrypLE als hiervoor en resuspendeer beschreven kleuroplossing bestaande uit PBS + 0,5% BSA. Per kleurreactie, resuspendeer 100.000-200.000 cellen in 100 ul kleuroplossing. Bereid enkele vlekken reacties per antilichaam gebruikt (CD146-FITC, CD140b-PE, CD34-APC, CD13-FITC, respectieve isotypecontrole antilichamen). </li><li> Add fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen elk kleuroplossing (verdunningen zie tabel specifieke reagentia en apparatuur) direct in de celsuspensie en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 min in het donker. </li><li> Was de cellen drie keer met 500 pi PBS en spin down tussen elkewasstap bij 157 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 0,5-1 ml kleuroplossing en overdracht cellen door een cel zeef (70 micrometer) aan FACS buizen. Bescherm het monster van blootstelling aan licht. </li><li> Vortex monsters voorafgaande aan het plaatsen van hen in de FACS instrument. </li><li> Om de levende cellen te analyseren en uit te sluiten puin en celaggregaten, gate voor FSC-A en SSC-A. Cel duplets zijn speciaal uit gated door FSC-A en FSC-W. Om de juiste gating voorwaarden voor celoppervlak markeringen poorten met isotype-gematchte controle-antilichaam geconjugeerd aan de respectieve fluorochroom bepalen. Vervolgens bepalen de hoeveelheid antilichaam gebonden cellen. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Verrijking voor pericyte-afgeleide cellen door Fluorescentie Activated Cell Sorting <ol><li> Zuiver het pericyte celpopulatie (geresuspendeerd in groeimedium) voor transductie via FACS sortering met een 70 urn mondstuk. Gebruik CD34-APC in combinatie met CD140b-PE en CD146-FITC te selecteren voor pericytes. Sort voor CD34-negatieve, CD140b-en CD146-positieve cellen. </li><li> Verzamel de gesorteerde cellen in groeimedium en plaat op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2. </li><li> 48 uur na het sorteren vervangen het medium met vers groeimedium en uitvoeren transductie zoals beschreven in protocol 4. </li></ol> 4. Retrovirale transductie van pericyte-afgeleide cellen en herprogrammeren in Induced Neuronen Opmerking: Raadpleeg de lokale richtlijnen voor biologische veiligheid bij het hanteren van retrovirale deeltjes. In Duitsland is het gebruik van de retrovirussen hier werkzaam vereisen bioveiligheidsniveau 2. Voor de productie van retrovirale deeltjes verwijzen naar protocol 6. Voor retrovirale constructen gebruikt voor herprogrammering, zie Karow et al.. (2012). Retrovirussen waren pseudogetypeerde met VSV-G (vesiculaire stomatitis virus-glycoproteïne) 5. Voor de productie wordt verwezen naar Gavrilescu et al. 6. <ol><li> 24 uur voorafgaand aan retrovirale transductie zaad ~ 60.000 cellen op poly-D-lysine-gecoate glazen dekglaasjes in 500 ul vers groeimedium in 24-well weefselkweekplaten en incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 en 5% O2 . </li><li> De volgende dag, vervang het groeimedium met 500 ul vers, voorverwarmd groeimedium en voeg 1 pl van de respectievelijke geconcentreerde supernatanten die retrovirale deeltjes (pCAG-IRES-DsRed voor de controle, vooral tijdens vaststelling van het protocol in het lab), pCAG-ascl1 -IRES-DsRed, pCAG-Sox2-IRES-GFP. </li><li> Een dag later, verwijder het medium dat de virusdeeltjes uit de cellen en voeg 1 ml vers, voorverwarmd B27-differentiatiemedium, bestaande uit 49 ml DMEM hoog glucose met GlutaMAX en 1 ml B27 serumvrij supplement. Handhaaf de cellen in kweek bij 37 ° C in 5% CO2 en 5% O 2 4-8 weken zonder dat het medium repetitieve mediumveranderingen schadelijk worden als INS rijpen. </li></ol> 5. Karakterisering van Induced Neuronen door Immunocytochemie <ol><li> Om de cellulaire identiteit van de getransduceerde cellen te bepalen, in het bijzonder aan de verwerving van een neuronaal fenotype aan te tonen, uit te voeren immuuncytochemie tegen neuronale antigenen zoals BIII-tubuline, MAP2 en NeuN (voor antilichamen en hun respectievelijke verdunningen, zie tabel specifieke reagentia en apparatuur, volgt u dezelfde procedure als aangegeven in 2.2.1). </li><li> Voor het verbeteren van de rijping van PdiNs, co-cultuur van deze cellen met neuronen afgeleid van E14 muis cerebrale cortex. Daartoe ontleden de cerebrale cortex en dissociëren het weefsel mechanisch met een vuur gepolijste glazen Pasteur pipet. Voeg 10,000-50,000 muizen neuronen aan culturen van-pericyte afgeleide cellen 2-3 weken na transductie met Sox2-en ascl1-codering retroviruses en verder kweken. Getransduceerde cellen kunnen worden onderscheiden van muizen neuronen hun reporter (GFP en DsRed) expressie, hetzij levend epifluorescentie of na immunocytochemie voor GFP en DsRed. </li><li> Om de vorming van synapsen beoordelen op PdiNs door muizen neuronen, uit te voeren immuuncytochemie tegen vesiculaire neurotransmitter receptoren zoals vesiculaire glutamaat transporter 1 (vGluT1). </li><li> Probe getransduceerde cellen voor hun elektrische eigenschappen (dwz het vermogen van het genereren van actiepotentialen) en de vaststelling van functionele synapsen door patch-clamp elektrofysiologie. Voor details van de procedure zie Heinrich et al.. (2011). </li></ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
<li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Het huidige protocol beschrijft de in vitro uitbreiding en verrijking van-pericyte afgeleide cellen na isolatie van de menselijke hersenschors volwassen en de daaropvolgende omzetting in iNs door-retrovirus gemedieerde expressie van de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1. Een dergelijk protocol voorziet in een experimenteel in vitro systeem om de lijn-omzetting van hersen-ingezeten cellen in neuronen en mogelijk ook glia bestuderen, met het doel voor ogen om uiteindelijk vertalen deze directe ...

In tegenstelling tot herprogrammering van somatische cellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die op hun beurt zijn begiftigd met een overvloed aan differentiatie potentieel, directe herprogrammering beoogt rechte omzetting van een specifiek celtype in een ander. Met betrekking tot hun toepassing in de context van ziektemodel en potentiële cellen gebaseerde therapieën, zowel herprogrammering benaderingen hebben specifieke voor-en nadelen. Herprogrammeren in iPSCs (i) biedt een vrijwel oneindige bron van cellen; (Ii) maakt genetische manipulatie; (Iii) schenkt met een bijna onbeperkt differentiatie potentieel. Echter grote nadelen van iPSCs brengen het risico van tumorgeniciteit van de ongedifferentieerde cellen (teratomavorming in vivo) en de noodzaak voor ex vivo kweken en worden verplant als deze cellen worden gebruikt voor cellen gebaseerde therapieën. Omgekeerd is direct afstammings-herprogrammering beperkt door de lagere opbrengst van de gewenste cellendie rechtstreeks correleert met het aantal van de doelcellen van de uitgangspopulatie, maar bezit het voordeel dat-lijn geherprogrammeerd cellen blijken geen tumorigene risico vertonen op transplantatie 1,2; bovendien kan direct herprogrammering ook worden bereikt in situ, dat wil zeggen binnen het orgaan waar deze cellen vereist zou zijn, waardoor de noodzaak van transplantatie voorkomen. Met dit in het achterhoofd, heeft ons lab de mogelijkheid van-lijn herprogrammeren hersen-ingezeten cellen nagestreefd in iNs als nieuwe benadering in de richting van cel-gebaseerde therapieën van neurodegeneratieve ziekten. Brain gevestigde cellen die mogelijk kunnen worden beschouwd als cellulaire doelwitten voor afstammings-herprogrammering omvatten verschillende macroglia (astrocyten, NG2 cellen en oligodendrocyten), microglia, en microvaatje geassocieerde cellen (endotheelcellen en pericyten). Wij hebben uitgebreid bestudeerd in vitro potentie van astroglia herprogrammering van de cerebrale cortex van de vroege postnatale muizen 3-5. Op zoek evenzo geschikte cel bronnen voor directe afstamming-herprogrammering in het volwassen menselijk brein, we tegenkwamen een celpopulatie die met succes kan worden geprogrammeerd in de ins en vertonen kenmerken van pericytes. Hier een protocol hoe deze cellen oogsten van volwassen menselijke hersenen biopsieën, uitbreiden en verrijken deze cellen in vitro, en tenslotte succes herprogrammeren een aanzienlijke fractie van deze in vitro geëxpandeerde cellen (in het traject van 25-30%) in beschrijven we INS. Herprogrammering kan door gelijktijdige retrovirus-gemedieerde co-expressie van twee transcriptiefactoren, Sox2 en ascl1. Deze PdiNs bleken het vermogen van repetitieve actiepotentiaal afvuren verwerven en synaptische als doelwitten dienen voor andere neuronen vermelding van hun vermogen integreren in neurale netwerken. Het protocol biedt een eenvoudige procedure voor de isolatie en geslacht omzetting van volwassen menselijke hersenen pericyten in iNs. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>anti-CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>anti-PDGFRβ</td><td>Cell Signaling</td><td>3169S</td><td>gebruik 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>gebruik 1:400</td></tr><tr><td>anti-NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>gebruik 1:400</td></tr><tr><td>anti-SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>gebruik 1:400</td></tr><tr><td>anti-βIII-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>gebruik 1:400</td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>gebruik 1:200</td></tr><tr><td>anti-GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>gebruik 1:600</td></tr><tr><td>anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>gebruik 1:1,000</td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>gebruik 1:500</td></tr><tr><td>anti-S100β</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>gebruik 1:300</td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>gebruik 1:200</td></tr><tr><td>anti-GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>gebruik 1:500</td></tr><tr><td>anti-Calretinin</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>gebruik 1:500</td></tr><tr><td>anti-vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td>135511</td><td>gebruik 1:1,000</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>Rat IgG1 isotype control APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>gebruik 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoge glucose, GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>foetaal runder serum</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>voer hitte-inactivatie uit door incubatie bij 56 °C gedurende 30 min</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS zonder CaCl2 en MgCl2 (D-PBS, 1x)</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>PFA (paraformaldehyde)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>Runder serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidin-2-fenylindole) dilactaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buisjes met ronde bodem</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Polystyreen buisjes met ronde bodem en celfilterdop</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24-well platen</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 kweekkolven</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kweekkolven</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Weggeef pipetten 10 ml</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>Glazen Pasteur pipetten (150 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes 12 mm diameter</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische wegwerp scalpels</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>Weefsel kweek schalen</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>Conische buisjes 15 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire stroomkast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge en draaibare rotor met adapters voor 15 ml en 50 ml buisjes</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>Celsorteerder voor flow cytometry: FACSAria l met FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gebeluchte kweekincubator</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbad op 37 °C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow buisjesvloeistof</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescentie microscoop BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in induced neuronen

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Directe lijn-herprogrammering van niet-neuronale cellen in geïnduceerde neuronen (INS) kan inzicht geven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen neurogenese en maken nieuwe strategieën voor in vitro modellen of repareren van de zieke hersenen. Het identificeren van de hersenen-ingezeten niet-neuronale celtypes vatbaar voor directe omzetting in iNs zou kunnen stellen voor de lancering van een dergelijke aanpak in situ, dat wil zeggen binnen het beschadigde hersenweefsel. Hier beschrijven we een protocol ontwikkeld in de poging identificeren cellen afkomstig van de volwassen menselijke hersenen die dit uitgangspunt voldoen. Dit protocol omvat: (1) het kweken van menselijke cellen uit de cerebrale cortex, verkregen uit volwassen menselijke hersenen biopten; (2) het in vitro expansie (ongeveer ter 2-4 weken) en karakterisatie van de cultuur door immunocytochemie en flowcytometrie; (3) de verrijking door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) met anti-PDGF-receptor-β en anti-CD146 antilichamen;(4) de-retrovirus bemiddelde transductie met de neurogene transcriptiefactoren Sox2 en ascl1; (5) en tenslotte de karakterisering van de verkregen pericyte-afgeleide neuronen geïnduceerde (PdiNs) met immunocytochemie (14 dagen tot 8 weken na retrovirale transductie). In dit stadium kan iNs worden gesondeerd voor hun elektrische eigenschappen van patch-clamp opname. Dit protocol verschaft een reproduceerbare werkwijze voor de in vitro lijn omzetting van hersen-resident pericyten in functionele menselijke iNs.

De eerste resultaten van dit protocol na succes een cultuur van een monster van humane volwassen hersenschors bestaat uit de identificatie van de cellulaire samenstelling van de cultuur. Immunocytochemie voor celtype specifieke eiwitten onthult een hoge mate van heterogeniteit tussen culturen afgeleid van specimen van verschillende patiënten (Figuur 1A). Zoals gekwantificeerd door flow cytometrie er altijd een aanzienlijke fractie van cellen die expressie PDGFRß (gemiddeld ~ 75%, van 30 tot maximaal 99%...

Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om cellen die afkomstig zijn van menselijke hersenparasieten om te zetten in geïnduceerde neuronen. Dit wordt bereikt door parasiet-afgeleide cellen te isoleren en te kweken uit chirurgische hersenmonsters. Vervolgens worden de in vitro cellen na expansie immunogelabeld voor parasitaire markers, wat karakterisering en uiteindelijke verdere verrijking van de cellen mogelijk maakt.Vervolgens worden parasiet-afgeleide cellen getransduceerd met retrovirale vectoren die neurale lotbepalers coderen, om ze direct om te zetten in geïnduceerde neuronen. De resultaten tonen geïnduceerde neuronen aan die zijn verkregen uit lijn-gereprogrammeerde parasiet-afgeleide cellen, gebaseerd op immunokleuring voor de neuronale marker beta three tubulin. Het belangrijkste voordeel van deze benadering ten opzichte van bestaande methoden, zoals de herprogrammering van fibroblasten of differentiatie van embryonale stamcellen tot neuronen, is dat we cellen targeten die endogeen zijn aan de hersenen; dit kan uiteindelijk de weg vrijmaken voor directe lijnconversie binnen de hersenen zonder dat de cellen getransplanteerd hoeven te worden.Het volgende protocol i

lineage-reprogramming-pericyte-derived-cells-adult-human-brain-into

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen...

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

This video demonstrates the direct reprogramming of genetically modified hematopoietic progenitor cells into neuronal stem cells. Transcription factors expressed by hematopoietic progenitor cells trigger a cascade of molecular events facilitating their transformation. Further specific media is used to select and grow induced neuronal stem cells.

Direct Reprogramming of Hematopoietic Progenitor Cells into Neural Stem Cells

This video demonstrates the process for differentiating induced neural progenitor cells (iNPCs) into neurons and astrocytes using specialized media.

Differentiating Induced Neural Progenitor Cells into Astrocytes

The video demonstrates the generation of neurons from adult human dermal fibroblasts (aHDFs). The aHDFs are reprogrammed using a lentiviral vector carrying genes for neuronal transcription factors and short hairpin RNAs (shRNAs). The shRNAs inhibit the expression of a neuronal transcriptional repressor, and the neuronal transcription factors activate genes to differentiate aHDFs into neurons. These reprogrammed aHDFs are cultured in an early and a late neuronal conversion medium to generate...

Generating Neurons by Reprogramming Human Dermal Fibroblast Cells

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

Een robuust protocol controleren neurale populaties time-lapse video-microscopie gevolgd door softwarematige nabewerking is beschreven. Deze methode geeft een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van biologische gebeurtenissen in een geselecteerde populatie tijdens live imaging experimenten.

Live Imaging gevolgd door eencellige bijhouden van de biologie van de cel van de Monitor en de progressie van de bloedlijn van meerdere neurale populaties

Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

We beschrijven een protocol om menselijke huid-afgeleide fibroblasten te herprogrammeren in geïnduceerde Neuronal Progenitor Cells (iNPC's), en hun daaropvolgende differentiatie in geïnduceerde Astrocyten (iA's). Deze methode leidt tot een snelle en reproduceerbare generatie van iNPC's en iA's in grote hoeveelheden.

In vitro modellering voor neurologische ziekten met behulp van directe conversie van fibroblasten naar neuronale voorlopercellen en differentiatie in astrocyten

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Leer hoe pericyten uit het volwassen menselijk brein worden omgezet in geïnduceerde neuronen met retrovirale vectoren. Deze methode maakt directe lineage-herprogrammering mogelijk voor hersenherstel.

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Meer video's verkennen